Une méthode de perméabilisation de Drosophila Embryons pour dosages de petites molécules activité

L’objectif général de l’expérience suivante est de préparer des embryons de drosophile viables avec une coquille d’œuf perméable pour tester la bioactivité de petites molécules médicamenteuses ou de toxines introduites. Pour ce faire, il faut d’abord traiter les embryons en phase de développement avec de l’eau de Javel diluée pour éliminer les couches externes de la coquille choriale de l’œuf. La deuxième étape consiste à permer les embryons avec un solvant qui épuise la fine couche cireuse de coquille d’œuf qui bloque les solutés à petites molécules.

La troisième étape consiste à traiter les embryons avec un médicament ou une toxine et un colorant pour évaluer simultanément la perméabilité de la coquille de l’œuf et introduire un composé d’intérêt. Après un développement ultérieur, les embryons peuvent être soit directement imagés, soit traités pour l’immunohistochimie. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l’activité d’un médicament ou d’une toxine sur le développement des tissus, telle que déterminée par la microscopie fluorescente avec des immunoréactifs ou des liens vitaux.

Aujourd’hui, je vais présenter notre méthode de perméation d’embryons de drosophile pour des tests d’activité de petites molécules. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’utilisation de solvants organiques conventionnels tels que l’heptane à perme. La coquille de l’œuf est que notre solvant de perméation embryonnaire, ou EPS, est manquant d’eau et relativement non toxique.

Ces propriétés facilitent les traitements embryonnaires où l’exposition aux solvants peut être contrôlée avec plus de précision et peut être effectuée dans des milieux physiologiquement pertinents, ce qui entraîne une plus grande viabilité embryonnaire. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai réfléchi à la façon d’enlever la couche cireuse de la coquille de l’œuf. En tant que skieur, j’ai réfléchi à l’utilisation courante d’un solvant d’agrumes pour enlever le fart résiduel de la semelle des skis.

Cela m’a incité à traduire cette application à la coquille d’œuf d’embryon de mouche, et après quelques essais et erreurs, j’ai conduit à la résolution de la composition de l’EPS, Préparez des cages de population avec au moins 500 mouches en âge de s’accoupler des souches souhaitées. Les cages doivent être équipées de 10 centimètres de jus de raisin. Aère avec une noisette de pâte de levure.

Changez ces assiettes deux fois par jour. Après quelques jours, les mouches seront conditionnées à la culture et pondront des embryons plus régulièrement. L’EPS est composé de tensioactifs et de solutions de solvants limitants et est bon pendant deux mois.

Lorsqu’ils sont conservés à température ambiante, réchauffez les tensioactifs à 37 degrés Celsius lors du mélange de l’EPS frais Pour le traitement EPS, les embryons sont manipulés avec des paniers fabriqués à partir de trois centimètres, donc un tube en polypropylène de 50 millilitres et un treillis en nylon rugueux. Les bords en plastique fondent plus facilement sur le maillage lors des étapes de développement ultérieures. Les embryons sont également manipulés à l’aide de paniers fabriqués à partir des bouchons de tubes de 50 millilitres.

Le capuchon est percé et entaillé, et le filetage entre le capuchon et le tube sécurise le treillis. Alternativement, une chambre à glissière localement est utilisée et préparée avec un morceau perméable à l’oxygène. Faites une membrane fixée sur l’ouverture par un anneau de retenue pour récolter les embryons.

Placez une assiette de raisin frais avec de la pâte de levure sur la culture le matin. Au bout d’une heure, changez l’assiette et jetez la première assiette collectée. Laissez la deuxième plaque recueillir les embryons pendant deux heures à 25 degrés Celsius.

Ensuite, récupérez la plaque et transférez-la à 18 degrés Celsius. Laissez les embryons se développer jusqu’au stade souhaité. Lorsque les embryons sont prêts, décavez-les avant le traitement EPS.

Rincez-les de l’assiette dans le panier à purée avec de l’eau et à l’aide d’un pinceau. Deuxièmement, rincez-les à l’eau courante douce pour éliminer tous les débris. Troisièmement, plongez-les dans de l’eau de Javel à 50 % pendant deux minutes avec une circulation périodique de la solution d’eau de Javel.

Ensuite, rincez-les rapidement à l’eau courante. Remplissez maintenant six plats de 60 millimètres chacun avec 10 millilitres de PBS pour fonctionner comme des bains et faites une dilution de un à 40 du stock EPS dans MBIM pour faire tourbillonner le mélange. Une émulsion blanche se formera, épongera l’excès d’eau du fond du panier à mailles à l’aide d’une lingette et plongera les embryons dans la dilution EPS avec un mouvement tourbillonnant constant.

Après avoir fait tourner les embryons dans l’EPS pendant 30 secondes, retirez-les et épongez l’excès de solution. Ensuite, déplacez le panier entre les six bains PBS, en giculant doucement pour rincer et procéder au colorant et au traitement médicamenteux. L’optimisation de la perméabilité et de la viabilité est la partie la plus délicate de ce protocole.

La perméabilité est sensible au stade de développement de l’embryon. La température à laquelle les embryons vieillissent peut également varier considérablement entre les souches individuelles de mouches. Les meilleurs paramètres pour la dilution du PSE et le temps d’exposition doivent être obtenus de manière empirique.

Tout d’abord, préparez une solution de 50 micromolaires de colorant d’acide carboxylique de science-fiction dans M-B-I-M-T, un millilitre dans un tube de microfiche suffit. Une toxine ou un médicament peut être ajouté à ce stade pour que les traitements aigus vortex se mélangent. Transférez les embryons perme du panier dans le tube de micro-fuge avec un pinceau.

Fermez le tube et retournez-le plusieurs fois. Ensuite, chargez le tube sur un mutateur et laissez-les incuber pendant 15 minutes. Une fois que les embryons se sont installés, retirez le colorant à l’aide d’une pipette et rajoutez un millilitre de M-B-I-M-T pour un lavage. Resus.

Suspendez les embryons, laissez-les se déposer et remplacez le M-B-I-M-T. Ensuite, faites-le une troisième et une quatrième fois. Une fois le quatrième lavage terminé, retirez tous les M-B-I-M-T et déplacez les embryons dans un panier de développement pour de longues périodes de développement.

Pour le panier de développement d’abord, préparez le panier avec un rinçage à 70 % d’éthanol, puis di eau, séchez le sang avec une lingette de laboratoire. Une fois terminé. Ensuite, transférez le panier dans une parabole de 60 millimètres avec six millilitres de milieu d’incubation contenant le médicament ou la toxine souhaité.

Transférez les embryons dans le filet du panier avec un pinceau en laissant tomber doucement le milieu d’incubation dessus, dispersez les embryons en une monocouche. Attention à ne pas piéger des bulles d’air sous le grillage. Pour utiliser d’abord une chambre à glissière, préparez la chambre, retournez la chambre à glissière et mettez un mince cordon de graisse sous vide sur le bord de l’ouverture.

Chargez ensuite 150 microlitres du fluide souhaité sur la surface de la membrane do à l’intérieur de l’ouverture. Maintenant, transférez les embryons dans le milieu à l’aide d’un pinceau et dispersez-les sur la membrane. Terminez en appliquant une lamelle circulaire de 25 millimètres en aplatissant le support.

Appliquez une légère pression sur le pourtour pour assurer l’étanchéité. L’élevage des embryons à 18 degrés Celsius a un effet robuste sur leur capacité à être perméés par l’EPS et à absorber la teinture aux derniers stades du développement. Ceci est illustré par l’absence d’absorption de Rumine BD dans les embryons traités à l’EPS élevés à 25 degrés Celsius L’absorption de colorant à l’acide carboxylique de science-fiction, vue ici en rouge, révèle les différents niveaux de perméabilité généralement observés dans les embryons traités à l’EPS.

La distribution dynamique du colorant de science-fiction rouge lointain au cours du développement et sa consolidation dans le jaune dans l’intestin développé observée avec l’autofluorescence bleue révèlent un critère utilisé pour évaluer la viabilité. Le colorant de science-fiction peut également déterminer la perméabilité antérieure de l’embryon après la fixation au formaldéhyde et l’immunocoloration. Après que les embryons d’EPS aient été traités avec un colorant de science-fiction et de la toxine méthylmercure, ils sont colorés avec Antifa deux vus en vert pour marquer les motoneurones et anti E lab en rouge pour marquer les corps cellulaires des neurones.

Le colorant de science-fiction est pseudo coloré en bleu. Le méthylmercure a un effet sur la structuration des corps cellulaires des neurones cortones marqués par les flèches chez les embryons de traitement témoin. Ces neurones ont une fasciale plus ordonnée, deux illustrés ici en blanc illustrent la ramification normale des neurones segmentaires dans le traitement de contrôle noté par les pointes de flèches.

En comparaison, le traitement au méthylmercure modifie le motif de ramification, comme l’indiquent les flèches vertes fixes. La flèche verte creuse marque l’endroit où les branches ont été déplacées. Une fois maîtrisé, les traitements de perméation embryonnaire dans cette technique peuvent être effectués en 30 ou 40 minutes environ si elle est effectuée correctement.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la fixation et l’immunocoloration des embryons peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quels tissus spécifiques sont ciblés par un médicament ou une toxine au cours du développement. Je vous remercie d’avoir regardé cette procédure et je vous souhaite bonne chance pour mettre ces méthodes en œuvre dans votre laboratoire.