Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Au début de l’embryon de drosophile, de nombreux organites subissent un mouvement à grande échelle. Notre protocole décrit comment surveiller ce mouvement à l’aide de colorants fluorescents développés pour la culture cellulaire. Comparées aux protéines fluorescentes, les sondes fluorescentes disponibles dans le commerce sont plus lumineuses et couvrent une plus large gamme de spectre.

Ils permettent le comarquage multiplex et peuvent être utilisés dans n’importe quel fond génétique. Il faut de la pratique et des essais et des erreurs pour savoir combien de temps dessécher les embryons, de sorte qu’ils éclatent pendant l’injection ou se dessèchent et cessent de se développer. Pour commencer, commencez à préparer les aiguilles d’injection en plaçant le capillaire dans un porte-capillaire sur l’extracteur d’aiguilles et en le fixant à l’aide d’écrous d’aile.

Alignez le centre du capillaire avec l’élément chauffant. Selon les instructions du fabricant, choisissez les réglages appropriés sur l’extracteur d’aiguilles. À l’aide d’un microscope à dissection, effectuez le test de contrôle de la qualité.

Appuyez les aiguilles dans le mastic horizontalement avec les pointes d’aiguille suspendues à l’air. Couvrez les aiguilles avec le couvercle et conservez jusqu’à utilisation. À l’aide d’embouts de chargement d’aiguilles fixés à une micropipette, aspirer un microlitre de la solution injectable dans la pointe sans piéger les bulles d’air.

À l’aide de gants, tenez l’aiguille dans une main avec sa pointe pointée vers l’extérieur et insérez-y la pointe de chargement. Distribuer le liquide près de l’extrémité de l’aiguille, retirer la pipette et maintenir l’aiguille verticalement jusqu’à ce que le liquide s’écoule vers la pointe. Couvrez le récipient avec du papier d’aluminium sans endommager les pointes de l’aiguille pour éviter le blanchiment des colorants.

À l’aide d’une pipette de transfert ou d’un micropipetter, placez une petite goutte de colle heptane au centre d’un couvercle rectangulaire et laissez-le s’évaporer. Pour retirer le chorion mécaniquement, couvrez la plaque embryonnaire vieillie de manière appropriée avec une fine couche d’huile d’halocarbure 27 pour rendre la coquille d’œuf transparente. Visualisez la plaque sous un microscope à dissection avec éclairage trans pour confirmer le stade embryonnaire et sélectionner les embryons en phase de clivage.

À l’aide d’une pince à épiler fine, ramassez un embryon du stade souhaité en saisissant les appendices dorsaux et transférez-le sur la lame de verre préparée recouverte de ruban adhésif double face. Placez l’embryon sur le ruban adhésif et minimisez le transfert d’huile. Roulez doucement l’embryon sur la surface du ruban adhésif en appuyant avec le côté de la pointe de la pince à épiler sans le piquer directement.

Continuez à rouler l’embryon jusqu’à ce que le chorion adhère au ruban adhésif et se fissure. Après les fissures du chorion, continuez à rouler l’embryon pour le séparer du chorion, qui reste collé au ruban adhésif. Retournez l’embryon sur le chorion, qui est moins adhésif que le ruban adhésif.

Frottez doucement l’embryon avec la pince à épiler jusqu’à ce qu’il se fixe à la pince à épiler pour le transfert. Ensuite, transférez l’embryon dans le bordereau de couverture et mettez-le en contact avec la colle pour maintenir l’embryon en place, en le séparant de la pince à épiler. Ajustez l’orientation de l’embryon sur le bordereau de couverture.

Laissez les embryons se dessécher pendant cinq à 12 minutes en plaçant le couvercle avec des embryons dans la chambre de dessiccation et en le scellant. Retirez le couvercle de la chambre et mettez une goutte d’huile d’halocarbure 700, couvrant les embryons pour empêcher une dessiccation supplémentaire. Examinez-les sous la lunette de dissection et procédez à la micro-injection si les embryons ont été desséchés correctement.

Placez l’objectif 4X dans le trajet de la lumière et, à l’aide du bouton de mise au point du microscope, ajustez les embryons à la mise au point. Déplacez les embryons horizontalement au centre du champ de vision à l’aide des commandes de scène. Gardez les embryons au bord du champ de vision et éloignez-vous en vue de l’abaissement de l’aiguille.

En restant avec le même plan focal, abaissez la pointe de l’aiguille et assurez-vous qu’elle est visible dans le champ de vision avec les embryons. Vérifiez que l’aiguille fonctionne en distribuant une partie de la solution injectable dans l’huile d’halocarbure 700. En cas de succès, une bulle de solution apparaîtra dans l’huile près de la pointe de l’aiguille.

À l’aide des commandes de scène, déplacez l’embryon vers la pointe de l’aiguille jusqu’à ce que la pointe perfore doucement l’embryon et y pénètre. Simultanément, commencez le flux de la solution injectable jusqu’à ce qu’une tache claire transitoire apparaisse sur le site de la pointe de l’aiguille, indiquant un transfert réussi de la solution dans l’embryon. Fixez le couvercle du microscope confocal à l’aide du porte-lames.

Soyez prudent car le couvercle est fragile. Inspectez les embryons à l’aide de la fonction d’épifluorescence du microscope confocal avec un objectif 40X et assurez-vous que le fluoro 4 dans l’embryon est visible avant de continuer. Pour l’imagerie en direct, pendant les étapes de synchronisation, définissez la taille de l’image de 512 x 512 pixels, la moyenne de ligne de trois et une fréquence d’images de 0,1 image par seconde.

Après l’injection du colorant BODIPY 493 503, il a été localisé à l’endroit où la pointe de l’aiguille a été insérée, puis diffusée à côté du site d’injection. Après 24 minutes, le colorant s’est diffusé au-delà du point médian de l’embryon. La motilité de l’organite a été surveillée en injectant à l’embryon BODIPY 493 503 et LysoTracker Red.

L’analyse par vélocimétrie par image de particules a révélé que le contenu embryonnaire convergeait vers la région centrale de l’embryon, où le cytoplasme s’écoule à l’intérieur de l’embryon. L’étiquetage de l’ER, à l’aide d’ER-Tracker Green, fournit une résolution vive de l’enveloppe nucléaire, permettant la visualisation des principales étapes du cycle cellulaire. L’embryon a été injecté avec MitoView 633 au stade du blastoderme et photographié quatre heures plus tard.

L’image montre une cellule neuroectodermique d’un embryon en extension de bande germinale. Un embryon cellularisant a été injecté avec un mélange de BODIPY 493 503 et de sirculine SiR, ce qui montre que les gouttelettes lipidiques se déplacent bidirectionnellement le long des microtubules. L’embryon doit être partiellement desséché afin que le liquide puisse être injecté.

Trop peu de dessiccation provoquera une fuite de l’embryon lors de l’injection, trop de dessiccation tuera l’embryon. Les vidéos d’organites en mouvement peuvent être caractérisées par diverses techniques d’analyse d’images. Le suivi des particules révèle le comportement des organites individuels, la vélocimétrie d’imagerie des particules révèle le flux en vrac.