Name: Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse de la composition et de la fonction des néphrons chez le poisson zèbre adulte. Les techniques de marquage fluorescent permettent d'évaluer la structure rénale et la régénération.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par un financement à RAW de ce qui suit: National Institutes of Health accorde K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar octroi d&#39;une subvention # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l&#39;Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques; et un don généreux à l&#39;Université de Notre Dame de Elizabeth et Michael Gallagher au nom de la famille Gallagher à favoriser les cellules souches. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données et l&#39;analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Enfin, nous remercions les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et idées sur ce travail.

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit des procédés qui permettent la visualisation des composants de segments de néphron dans le poisson zèbre adulte. L&#39;injection de dextran conjugués fluorescents permet préférentiel étiquetage du PCT en raison des propriétés d&#39;endocytose de ces cellules des tubules proximaux 30,38. Cette méthode peut être réalisée avec une grande flexibilité en raison de l&#39;existence des dextranes qui peut être obtenu avec une multitude de différents conjugués fluorescents. En outre, l&#39;utilisation de dextranes de lysine peut être fixé est d&#39;une manière particulièrement commode pour étiqueter PCT segments, comme les procédures d&#39;étiquetage secondaires ne sont pas nécessaires. Cela permet la détection du signal relativement simple et est compatible avec de nombreux autres marqueurs fluorescents, immunomarquage, et l&#39;utilisation de lignes de journaliste transgéniques. Alcaline phosphatase étiquetage de marque aussi le tubule proximal, avec une forte réactivité dans le PCT et réactivité légèrement plus faible dans le PST. Enfin, la coloration de DBA permet l&#39;étiquetage des segments des tubules distaux, qui affichent un characteristic morphologie ramifiée. Différentes molécules de lectine, qui sont des protéines de sucre de liaison d&#39;origine non immune, ont été largement utilisés pour distinguer les segments de néphron de mammifère 47. Il est intéressant de noter que DBA dans le poisson zèbre est en corrélation avec les segments de tube distal, comme il est utilisé pour marquer les tubes collecteurs dans les reins de mammifères 47. Pris ensemble, ces procédés peuvent être utilisés dans diverses combinaisons pour documenter la composition et la fonction rénale. Depuis toutes ces méthodes peuvent être utilisées dans les préparations de rein entiers, ils fournissent des outils pour évaluer la structure et la fonction des néphrons tout au long de l&#39;organe sans dépendre entièrement de l&#39;utilisation de plus de temps, les méthodes fastidieuses, par exemple, le travail de cryosection et immunomarquage. Cependant, les colorants décrits dans cet article sont des méthodes viable en cryosection. analyse de Coupe à congélation génère des échantillons (par rapport à l&#39;ensemble de montage) qui sont mieux adaptés pour l&#39;immunohistochimie pour détecter Pepti spécifiquesdes, même si bien sûr ce type d&#39;analyse nécessite la disponibilité d&#39;anticorps primaires appropriés. Malheureusement une limitation majeure à travailler avec le modèle animal le poisson zèbre reste la faible disponibilité d&#39;anticorps. Ainsi WISH reste le plus largement utilisé, c&#39;est à dire, &quot;go-to&quot;, procédure pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique. WISH utilisant des réactions de substrat BCIP, NBT, et / ou INT à produire des précipités violets ou rouges n&#39;est pas compatible avec coloration fluorescente sur cryosections. Une option serait d&#39;invoquer l&#39;utilisation de la détection de WISH fluorescent, une procédure qui a été optimisé pour les échantillons embryonnaires de poisson zèbre et pourraient être adaptés pour une utilisation avec le rein adulte. La description des méthodes de cet article de la vidéo doit permettre de poursuivre l&#39;expérimentation des techniques comme WISH fluorescent en combinaison avec des lignes de poisson zèbre transgénique dans les segments individuels sont étiquetés avec un journaliste comme eGFP ou mCherry. Alternativement, les méthodes décrites ici CoulD être testé en combinaison avec d&#39;autres colorants vitaux, par exemple, d&#39;autres lectines. Ainsi, outre l&#39;adaptation et l&#39;expansion des méthodes décrites ici peuvent être invoquées pour répondre aux besoins du chercheur pour préparations entières de rein de montage et d&#39;analyse. En tant que tels, ces procédés ont un large potentiel d&#39;application avec le modèle de poisson zèbre pour les études en cours de régénération et également dans la modélisation de la maladie génétique. Il ya un besoin urgent pour la recherche innovante et les traitements contre les affections rénales. Des millions de personnes souffrent d&#39;une forme de la maladie rénale chaque année qui résulte de causes congénitales, aigu, et / ou chroniques. En outre, la prévalence de la maladie rénale continue d&#39;augmenter dans le monde entier, faisant de ces maladies une émission de la santé publique mondiale 14,15. Les traitements tels que l&#39;hémodialyse sont disponibles grâce auquel une machine de dialyse externe sert à débarrasser le sang des déchets métaboliques du patient si leurs reins ne sont pas en mesure de remplir ce rôle. Malheureusement, Cette intervention a des limites, comme le traitement en cours est nécessaire pour la survie. En outre, les patients auront éventuellement besoin d&#39;une transplantation rénale, qui peut prendre des années pour recevoir une fois par patient est placé sur une liste d&#39;attente. Même après l&#39;obtention d&#39;une greffe de rein, de nombreux patients souffrent d&#39;effets indésirables à la suite de la procédure et doivent combattre ces effets pour le reste de leur vie. Ces difficultés montrent la nécessité grave pour le développement de nouveaux traitements pour soit prévenir les maladies du rein ou à augmenter peut-être la régénération des tissus 8,16,52,53. Compte tenu des limites éthiques évidentes de l&#39;utilisation de sujets humains dans les laboratoires biomédicaux, les modèles animaux sont essentiels pour l&#39;étude de la pathogenèse de la maladie humaine et pour les essais de nouveaux traitements. En raison de sa ressemblance anatomique et la proximité de l&#39;évolution, la souris est devenu le modèle le plus utilisé de la maladie humaine 45. Cependant, il ya certaines limites de cet animal, yment incapacité de visualiser le développement des organes in vivo et la praticité de remplir les écrans génétiques à grande échelle. Le poisson zèbre sont un organisme modèle pertinent et utile pour l&#39;étude du développement des organes et de la modélisation des maladies humaines 45,46. En ce qui concerne les maladies humaines, des homologues fonctionnels chez le poisson zèbre existent pour près de 70% de tous les gènes humains 54,55. Des travaux récents ont mis en évidence l&#39;utilité de poisson zèbre pour de nombreux domaines de 31,37,56 de recherche du rein. Études de régénération et de réparation chez le poisson zèbre après l&#39;IRA suggèrent que tubule épithéliale régénération et neonephrogenesis sont deux processus qui se produisent tout au long et se chevauchent la régénération timecourse 30,37. L&#39;utilisation d&#39;un aminoglycoside antibiotique appelé la gentamicine a été utilisé comme un paradigme de la blessure qui permet d&#39;étudier les résultats de l&#39;IRA en 29,30,37 poisson zèbre adulte. Au cours d&#39;une de deux semaines environ blessure période suivante de la gentamicine, la Tubul proximalees régénérer, et en attendant de nouveaux néphrons forment tout au long de l&#39;organe 29,30,37. En général, les mécanismes qui régulent la régénération épithéliale restent très controversée. Dans un mécanisme proposé du processus de réparation, il est l&#39;événement de blessure aiguë initiale suivie par une desquamation des cellules mortes dans la lumière. Ensuite, il existe une série de dé-différentiation, la prolifération, la migration et événements, après quoi de nouvelles cellules se différencient, repeupler la membrane basale lésé et à rétablir la fonction du site lésé. Alternativement, d&#39;autres études ont suggéré que les cellules de remplacement proviennent de cellules souches / progénitrices qui résident dans les tubules de néphrons. En ce qui concerne le processus de neonephrogenesis chez le poisson zèbre, les agrégats cellulaires ont été observés AKI suivante par injection de gentamicine 29,30. Ces agrégats maturité plus tard dans de nouveaux néphrons qui sondent en tubules 29,30 existants. Le fil conducteur qui unit néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis est leur facteur de mystère pure: à l&#39;heure actuelle il ya exponentiellement plus de questions sur la façon dont ces exploits se produit une régénération qu&#39;il n&#39;y idées disponibles. À ce jour, cependant, plusieurs lignes intéressantes de données appuient l&#39;idée que la recherche de la régénération rénale en utilisant le poisson zèbre peut en effet fournir des indications pertinentes comparables en AKI humain qui peut aussi avoir directement translation potentiel 56-58. criblage de produits chimiques afin d&#39;identifier de petites molécules qui augmentent la prolifération des cellules souches rénales chez l&#39;embryon de poisson zèbre a récemment conduit à l&#39;identification de la -butanoate inhibiteur de l&#39;histone déacétylase de méthyl-4-(phénylthio) (m4PTB) 56,57. L&#39;administration de ce composé pour les larves de poisson zèbre avec AKI la gentamicine a révélé que la survie des larves augmente et que la prolifération tubulaire rénale a été renforcée 56,58. Lorsque les souris modérée AKI induite par l&#39;ischémie ont été traités avec m4PTB, leur récupération a été accélérée dans association avec une réduction à la fois et l&#39;atrophie tubulaire cycle cellulaire arrêt de la prolifération des cellules des tubules rénaux 58. Ces résultats suggèrent que les voies responsables pour le développement normal du poisson zèbre rénale et / ou la réponse régénérative à AKI seront conservées avec les mammifères 56. Ainsi, tandis que d&#39;autres études sont nécessaires pour démêler les mécanismes de régénération, à savoir d&#39;identifier les voies de signalisation qui sont impliqués et de comprendre leur interaction-le poisson zèbre offre une avenue prometteuse pour poursuivre cet objectif important dans le domaine de la néphrologie. Des outils tels que les étiquettes de cellules néphron décrites dans ce protocole constituent un groupe de tests qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition rénale et la fonctionnalité des modèles AKI. En outre, ils peuvent être appliqués à caractériser des modèles transgéniques de la maladie rénale et peuvent fournir des moyens pour identifier les agents thérapeutiques chimiques capables de promouvoir la restauration de la structure de barrage après néphron rénalâge.

Le rein est un organe complexe qui remplit une multitude de fonctions physiologiques de l&#39;organisme. La principale fonction du rein est l&#39;excrétion des déchets métaboliques, et cette tâche est étroitement liée avec le maintien de l&#39;homéostasie fluide. Le rein effectue ces travaux en filtrant le sang et la formation de l&#39;urine, tout en régulant de façon concomitante la pression artérielle, les niveaux d&#39;électrolyte, et l&#39;équilibre acide-base. Tubules épithéliales hautement spécialisées appelées néphrons servent de l&#39;unité fonctionnelle de base du rein 1,2. Chez les vertébrés adultes, néphrons sont généralement organisés dans une disposition étroitement enroulé autour d&#39;un système de drainage centralisée, permettant ainsi de nombreux tubes pour emballer dans le assez petit orgue. Par exemple, chaque rein humain peut contenir plus de 1 million de néphrons 3. D&#39;autres mammifères comme la souris possèdent de l&#39;ordre de 8 à 10000 néphrons par rein 4. Le degré de complexité rénale diffère entre les mammifères et les autres vertebrates dues à des variations dans le nombre de néphrons totale et leur disposition architecturale dans le rein. espèces de vertébrés forment jusqu&#39;à trois structures rénales successives au cours du développement, et chaque formulaire affiche une complexité croissante à l&#39;égard de néphrons dotation et arrangement: les pronephros, mésonéphros, et metanephros. Le dernier bâtiment rénale doit être conservé sert de rein adulte organe, généralement un mésonéphros ou un metanephros 2. Chaque forme de rein, cependant, a une composition à base de néphrons-2. Le néphron est l&#39;outil de travail du rein et est responsable de la filtration du sang avec un métabolite de la sécrétion et la réabsorption. Néphrons sont des structures tubulaires simples composées de cellules épithéliales et avoir une organisation segmentaire, dans lequel discrets domaines hautement spécialisés, de l&#39;épithélium différenciés effectuer des tâches spécifiques. Dans l&#39;ordre de l&#39;écoulement du filtrat à travers le néphron, il ya généralement trois grandes parties qui COMPRISe chaque unité: (1) le corpuscule rénal, (2) un tubule proximal avec, intermédiaire, et segments distaux, et (3) un canal collecteur 1. Le tube proximal est responsable de la réabsorption de solutés organiques, et plus particulièrement du glucose et des acides aminés 1. Le tube intermédiaire (ou boucle de Henle) est un site majeur de sel et d&#39;eau réglementation 1. Enfin, réglage fin de sel et d&#39;autres ions se produit dans le tubule distal et le tube collecteur et est fortement régulée par le système endocrinien 1. A partir de là, le filtrat traverse l&#39;uretère et de la vessie, en fin de compte la sortie du corps comme un produit de déchets 1. La perte de la fonction rénale peut provenir d&#39;une multitude de causes qui empêchent l&#39;activité des néphrons normale. Ces causes peuvent se produire au cours du développement du rein, par exemple, des anomalies congénitales qui conduisent à la malformation de néphrons 5, ou des causes de différents types de dommages (provenant de l&#39;environnement à la fois génétique etorigines NTAL). Blessures acquises sont généralement classés comme des blessures rénale aiguë (IRA) ou de blessure rénale chronique (IRC). AKI implique une perte soudaine de la fonction rénale, souvent résultant d&#39;une ischémie ou d&#39;une toxine exposition 6,7. Chez les mammifères, la réparation de l&#39;épithélium des néphrons est possible après de telles blessures 8, et de nombreuses personnes présentent pleine restauration de la fonction rénale après l&#39;IRA. Cependant, AKI est également associée à une forte morbidité et la mortalité qui ont été signalés dans un large 30 - gamme de fréquence de 70% 6,7. CKD, en revanche, est associée à une perte progressive de la fonction rénale résultant de nombreuses années de dommages prolongée, généralement associée à une fibrose 8,9. En outre, une interaction existe entre AKI et CKD, soit comme on peut prédisposer un individu à l&#39;autre 10-12. Par exemple, ceux qui ont souffert de l&#39;insuffisance rénale aiguë sont plus sensibles à la maladie rénale chronique et même la mort 13. L&#39;incidence de la maladie rénale, à la fois aux États-Unis et dans le monde, a atteint épidéproportions micro et devrait augmenter que la population âgée augmente-donc il ya un besoin croissant d&#39;identifier les interventions de la médecine régénératrice pour le rein 14,15. Malgré la connaissance que patients atteints d&#39;IRA peuvent récupérer, il a longtemps pensé que le rein est un organe sans pouvoirs de régénération innées. Cette vision traditionnelle a été considérablement révisé au cours des dernières années 16. Des études portant sur ​​des lésions rénales chez les souris et les rats après l&#39;IRA ont montré que les cellules épithéliales des tubules des néphrons peuvent proliférer et reconstruire néphrons fonctionnels 17-20. Bien que les mammifères possèdent cette capacité d&#39;adaptation à régénérer néphrons, il ya des limites notables et des réponses inadaptées peuvent être déclenchées qui conduisent à la fibrose rénale et CKD 21. Par exemple, une étude récente a démontré que l&#39;ablation répétée des cellules épithéliales dans les néphrons murins a été associée à une diminution de la régénération et néphrons la fibrose rénale suggérant VHAea limitée seuil de régénération 22. Il n&#39;existe aucune preuve que l&#39;adulte rein de mammifère forme de nouvelles néphrons pour remplacer ceux perdus ou endommagés, ainsi leur destruction conduit à un déficit de 8,9 néphrons permanent. Fait intéressant, certains vertébrés ne répondent à AKI en régénérant néphron épithéliums et en produisant de nouvelles néphrons, un processus connu sous le neonephrogenesis ou néphron néogénèse 23. Neonephrogenesis se produit dans les poissons après exposition à des toxines ou résection partielle, et des modèles de blessures ont toujours inclus le poisson rouge 24,25, le tilapia 26, patin 27, médakas 28, et plus récemment, le poisson zèbre 29,30. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre constituent un modèle de recherche génétique viable pour découvrir les voies cellulaires et moléculaires responsables de la régénération rénale. Dans cet article, vidéo, nous démontrons comment étiqueter les segments de néphrons chez le poisson zèbre adulte. Connaissance des néphrons anatomie, les caractéristiques moléculaires,et les caractéristiques fonctionnelles sont indispensables pour les études rénales futurs succès en utilisant le poisson zèbre. Le rein de poisson zèbre adulte est une structure de mésonéphros et est par nature moins complexe en termes de nombre de néphrons et de l&#39;organisation de la structure de metanephros chez les mammifères adultes, aviaires et reptiles 31. Cependant, le poisson-zèbre organisation segment de néphron est analogue pour les mammifères, et a été documentée dans le rein embryonnaire sur la base des études d&#39;expression génique 31-35. Néphrons d&#39;embryons de poisson zèbre contiennent des segments linéaires tubulaires qui incluent le tubule contourné proximal (PCT), tubule proximal droite (PST), distale tôt (DE), et distale retard (DL) 31-35 (Figure 1). Néphrons adultes poisson zèbre possèdent segments tubulaires similaires 30,31,36,37 (Figure 1). Le PCT peut également être identifié par un phénotype fonctionnel: les cellules épithéliales de la PCT seront incorporer des composés de dextrane marquées par fluorescence (10-70 kDa en taille) présents dans lecirculation, qui a été utilisé à la fois dans le poisson zèbre de rein embryonnaire et adulte afin d&#39;évaluer l&#39;absorption endocytique par les cellules du tubule proximal 38 à 41 (figure 1). Une différence dans les segments du néphron entre le poisson-zèbre et les mammifères, c&#39;est que le poisson-zèbre manquent un tube intermédiaire, ou l&#39;anse de Henle, 30-37; car le fonctionnement de ce secteur chez les mammifères d&#39;économiser l&#39;eau, et le poisson-zèbre est une espèce d&#39;eau douce sans l&#39;urgence de concentrer leur urine, il n&#39;est pas surprenant que le poisson-zèbre manque ce segment 32,33. Ainsi, la composition d&#39;ensemble du néphron est largement conservée entre le poisson zèbre et le rein des mammifères 32,33. Ces similitudes ont permis de poisson zèbre à être un outil de recherche efficace pour étudier les fonctions des gènes rénales exprimée pendant néphrogenèse développement 32-35,42 et de modéliser de nombreuses maladies rénales 43,44, ce qui ajoute à la liste substantielle de la situation des droits qui peuvent être étudiée en utilisantpoisson zèbre 45,46. Aujourd&#39;hui, le rein de poisson zèbre adulte est un modèle attractif pour les études comparatives de régénération rénale en raison de sa traçabilité génétique et le palais en éveil des ressources technologiques disponibles pour interroger la fonction des gènes et voies de signalisation dans cette espèce. Plusieurs études ont utilisé les mésonéphros poisson zèbre pour étudier les mécanismes de régénération après AKI 29,30,37. Pour la recherche AKI continué à utiliser le rein de poisson zèbre adulte, il est essentiel de disposer de méthodes exquis pour étiqueter les différentes régions et les méthodes néphrons pour étudier la fonctionnalité des néphrons. Plusieurs méthodes d&#39;analyse de rein adulte ont été adaptées à partir des protocoles de rein embryonnaire. L&#39;injection intrapéritonéale de dextran marqué par fluorescence dans le poisson zèbre adulte étiquettes l&#39;épithélium du PCT dans mésonéphros néphrons par endocytose 30, comme dans embryons de poisson zèbre 38-41 (Figure 1). Cette méthode a été utilisée pour visualize quand tubules proximaux à retrouver leurs biens résorber suivante AKI, qui permet à un évaluation de restaurer la fonction physiologique 30 (Figure 1). Une autre caractéristique du néphron tubule proximal est que les cellules epitheliales dans ce segment présentent une bordure en brosse 37 montre que des niveaux élevés de l&#39;activité phosphatase alcaline endogène. Ainsi, l&#39;épithélium proximale peut être localisé visuellement chez l&#39;adulte rein poisson zèbre en utilisant une technique basée sur la fluorescence connu comme Elf-(marqué par une enzyme de fluorescence) -97 47. Ici, nous décrivons comment effectuer fluorescentes essais d&#39;absorption de dextran 30,48 chez l&#39;adulte rein poisson zèbre, de façon à obtenir une évaluation fonctionnelle du tubule proximal et la carte de la taille et les contours de ce segment de tubule. Ensuite, nous décrivons les techniques d&#39;étiqueter les régions du tubule proximal du néphron adulte avec l&#39;étiquette fluorescente phosphatase alcaline. En troisième lieu, on montre pour la première fois que le Rhodamine-tagged lectine agglutinine de Dolichos biflorus (DBA), qui a été utilisé comme marqueur général des tubes collecteurs dans les reins des mammifères 49, marque les tubules distaux du rein adulte de poisson zèbre. En tant que DBA est mutuellement exclusif de coloration alcaline phosphatase, ces étiquettes offrent un moyen de distinguer large pan-proximale par rapport étendues pan-distale de l&#39;adulte néphron poisson zèbre. Tout au long de la mise en œuvre de ces colorants fluorescents à la fois toute la montagne et des coupes histologiques cryostat, nous corréler ces étiquettes avec des domaines d&#39;expression des gènes soluté de transporteurs qui identifient de façon unique chaque segment de néphrons. Par conséquent, ce protocole contient également un guide sur les procédures de traitement des tissus modifiés pour l&#39;ensemble de tissu adulte montage hybridation in situ (WISH) analyse dans la base de notre embryon protocole WISH 50. Ces procédures peuvent être utilisées dans diverses combinaisons (Figure 2) de documenter les attributs morphologiques et fonctionnelles of adultes néphrons rénaux poisson zèbre. Ainsi, ces protocoles peuvent être appliqués à des études de régénération, la caractérisation phénotypique des autres modèles de maladie rénale, et encore utilisés pour étudier la formation de rein adulte.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Fabriqué en diluant 10 X PBS dans de l’eau distillée.</td></tr><tr><td>1X détergent PBST</td><td></td><td></td><td>0.1 % Tween-20 dans 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS avec 0,05 % de détergent Tween</td><td></td><td></td><td>0,05 % Tween-20 dans 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4 % PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissoudre 4 % PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) dans 1 X PBS, porter à ébullition sur une plaque chauffante dans une hotte. Refroidir et congeler les aliquotes pour les conserver au congélateur à -20 °C. Décongeler juste avant utilisation et ne pas recongeler les stocks.</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pince à épiler Motif #55&nbsp ;</td></tr><tr><td>Toboggan en verre</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>D’autres pâtes à modeler peuvent être remplacées et fonctionner de la même manière</td></tr><tr><td>Porte-diapositives</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>En option : plateau en carton pour ranger les lames à plat</td></tr><tr><td>Solution de blanchiment</td><td></td><td></td><td>Formule du mélange d’eau de Javel (pour une solution de 20 ml) : 1,6 ml de solution d’hydroxyde de potassium à 10 % 0,6 ml de solution de peroxyde d’hydrogène à 30 % 100 &mu ; l de 20 % Tween Remplir à 20 ml avec de l’eau distillée</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Solution bloquante</td> Solution de blocage <td></td><td></td><td>(pour une solution de 10 ml) : 8 ml de 1X PBS avec 0,05 % Tween 2 ml de sérum fœtal de veau 150 &mu ; l de détection de l’activité de</td></tr> la <tr><td>phosphatase alcaline</td> DMSO <td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>Nous utilisons le kit de détection de phosphatase endogène ELF 97. Pour préparer la solution de substrat de travail, diluez le substrat 20 fois dans le tampon de détection, conformément aux instructions du fabricant.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>de lavage à la phosphatase alcaline</td><td>Recette de la solution tampon de lavage (pour une solution de 100 ml) : 5 ml de 0,5 M EDTA 120 mg de lévamisole 95 ml de 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescéine, 40 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Diluer avec de l’eau distillée pour obtenir une solution mère à 50 mg/ml, et conservez les aliquotes au congélateur à -20°C.</td></tr><tr><td>Dextran, bleu cascade, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Diluer avec de l’eau distillée pour obtenir une solution mère de 50 mg/ml, et stocker les aliquotes au congélateur à -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>Dextran, jaune lucifer, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Diluer avec de l’eau distillée pour obtenir une solution mère de 50 mg/ml, et stocker les aliquotes au congélateur à -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tétraméthylrhodamine (fluoro-rubis), 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Diluer avec de l’eau distillée pour obtenir une solution mère de 50 mg/ml et stocker les aliquotes dans le congélateur à -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (pour un 100 &mu ; l solution) : 1 &mu ; l de DBA 99 &mu ; l de 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodure</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set support de montage</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, solution 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation de tissus</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsie, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 lames de microscope adhésives</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueur de liquide &ndash ; super stylo PAP</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’humidité immuno coloration</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&commerce ; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645 ; SMZ1000 ; 83455 P-Bleu GFP/DAPI ; 83457 P-Dotow GFP/FITC ; 83457 Le jeu de filtres P-TRITC</td><td>utilisé était le suivant : Le filtre Hoechst/DAPI a été utilisé pour la détection du DAPI, de l’iodure de propidium, du bleu en cascade de dextran et de la phosphatase alcaline. Le filtre GFP/FITC a été utilisé pour la détection du dextran-FITC, du dextran lucifer yellow et de l’anti-GFP. Le filtre TRITC a été utilisé pour la détection du dextran-fluoro-ruby, du PI et du DBA.</td></tr><tr><td>Microscope composé</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI ; 96311 C-FL B-2E/C FITC ; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Le jeu de filtres utilisé était le suivant : Le filtre Hoechst/DAPI a été utilisé pour la détection du DAPI, de l’iodure de propidium, du bleu de cascade de dextran et de la phosphatase alcaline. Le filtre GFP/FITC a été utilisé pour la détection du dextran-FITC, du dextran lucifer yellow et de l’anti-GFP. Le filtre Texas Red a été utilisé pour la détection du dextran-fluoro-ruby, du PI et du DBA. &nbsp ;</td></tr></tbody></table>

analyse de néphron composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Le modèle de poisson zèbre a émergé comme un système pertinent pour étudier le développement du rein, de la régénération et de la maladie. Les deux reins embryonnaires et adultes poisson zèbre sont composés d&#39;unités fonctionnelles appelées néphrons, qui sont hautement conservées avec d&#39;autres vertébrés, y compris les mammifères. La recherche dans le poisson-zèbre a récemment démontré que deux phénomènes distincts transpirent après néphrons adultes encourent des dégâts: d&#39;abord, il ya la régénération robuste dans néphrons existants qui remplace les cellules épithéliales des tubules détruits; deuxième, entièrement nouveaux néphrons sont produites à partir de progéniteurs rénaux dans un processus connu sous le nom neonephrogenesis. En revanche, les humains et d&#39;autres mammifères semblent avoir seulement une capacité limitée pour la régénération de l&#39;épithélium des néphrons. À ce jour, les mécanismes responsables de ces phénomènes rein de régénération restent mal compris. Depuis reins poisson zèbre adultes subissent à la fois néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis, ils fournissent un para expérimentale exceptionnelleparadigme pour étudier ces événements. En outre, il existe un large éventail d&#39;outils pharmacologiques et génétiques disponibles dans le modèle de poisson zèbre qui peuvent être utilisés pour délimiter les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent la régénération rénale. Un aspect essentiel de cette recherche est l&#39;évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit un ensemble de techniques de marquage qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition du rein et de la fonctionnalité du néphron de test dans le rein adulte de poisson zèbre. Ainsi, ces méthodes sont largement applicables à l&#39;avenir la caractérisation phénotypique des adultes poisson zèbre paradigmes de lésions rénales, qui comprennent, mais ne sont pas limités à, des régimes d&#39;exposition nephrotoxicant ou des méthodes génétiques de la mort cellulaire ciblée comme la technique d&#39;ablation de cellules nitroreductase médiation. En outre, ces méthodes pourraient être utilisées pour étudier les perturbations génétiques dans la formation du rein adulte et pourraient également être appliquées pour évaluer la fonction rénale lors de la modélisation des maladies chroniques.

Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l&#39;évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d&#39;évaluer la réabsorption rénale.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer la composition et la fonctionnalité des segments de néphron dans le rein du poisson zèbre adulte. Ceci est accompli en injectant d’abord de la dextrine marquée par fluorescence dans un nid qui attache le poisson zèbre. La deuxième étape consiste à retirer et à fixer le rein pour préparer le tissu aux méthodes de marquage ultérieures.Ensuite, le rein est blanchi pour éliminer la pigmentation, puis coloré pour marquer par fluorescence les segments de néphron souhaités. Les résultats sont obtenus à l’aide de l’immunofluorescence, de la microscopie et/ou de l’imagerie en champ clair qui permettent de visualiser l’anatomie rénale en fonction de la ou des taches sélectionnées. Les méthodes de marquage suivantes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine du rein concernant l’anatomie des organes et peuvent être utilisées pour étudier la composition des néphrons et évaluer la fonctionnalité rénale avant et après une blessure.Les implications de ces techniques s’étendent à l’étude des anomalies génétiques dans la formation des reins adultes et pourraient également être appliquées pour évaluer l’état rénal lors de la modélisation des maladies chroniques. Pour commencer, décantez la solution d’un poisson anesthésié et placez soigneusement l’animal sur une éponge humide moulée sur le côté ventral. Ensuite, remplissez une seringue à insuline avec 20 microlitres de solution mère de dextrine décongelée.Placez l’aiguille de manière à ce que l’insertion se fasse à un angle peu profond sur la ligne médiane ventrale de l’abdomen. Pour éviter d’injecter légèrement les organes, soulevez l’aiguille juste après l’injection pour soulever la paroi corporelle et créer un espace dans lequel injecter la solution. Après l’injection, remettez doucement le poisson dans l’aquarium pour qu’il se remette de l’anesthésie.Pour commencer, décantez toute solution supplémentaire d’un poisson anesthésié et placez-la sur un mouchoir ou une serviette en papier. Après avoir enlevé la tête et les organes internes, utilisez des aiguilles de dissection super fines pour ouvrir les parois du corps. Localisez l’organe rénal qui adhère à la paroi dorsale de l’animal.Utilisez des pinces fines pour détacher le rein de la paroi dorsale. Placez délicatement le rein dans un flacon en verre de cinq millilitres contenant un XPBS et lavez-le trois fois pendant cinq minutes chacun. Retirez le rein à l’aide d’une pipette de transfert et placez-le sur une lame en verre propre avec une à deux gouttes d’un XPBS.Utilisez une pince fine pour aplatir le rein sur la lame, en vous assurant qu’aucun tissu ne s’est enroulé ou renversé sur lui-même. Un outil en fil de tungstène peut être utilisé pour faire de petites incisions dans le tissu conjonctif afin de faciliter le positionnement à plat du rein. Ensuite, placez de petits morceaux de pâte à modeler sur chaque coin d’une lamelle en verre de 18 x 18 millimètres.Placez lentement le couvercle sur le rein, en gardant un léger angle. Pour minimiser l’emprisonnement des bulles d’air, ajoutez une goutte supplémentaire d’un XPBS pour remplir l’espace entre la lamelle et la glissière si nécessaire. Un groupe distinct de poissons-zèbres est euthanasié et trempé dans un fixateur pendant la nuit.Lorsque vous êtes prêt, à l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement le rein de la paroi dorsale du corps et placez l’organe dans un flacon en verre. Lavez le rein disséqué trois fois avec trois à cinq millilitres d’un XPBS à 0,05 % pendant cinq minutes chacun. Ensuite, retirez la solution de PBS et rincez le rein avec trois millilitres d’une solution de saccharose à 5 % pendant 30 minutes.Après ce temps, remplacez la solution par trois millilitres de saccharose à 30 % et conservez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Retirez la solution et lavez le rein deux fois avant d’ajouter trois à cinq millilitres de solution de blanchiment. Pour éliminer la pigmentation mélanocytaire présente sur l’organe rénal, placez le flacon en verre sur un rotateur et observez attentivement la disparition de la pigmentation.La dépigmentation prend généralement environ 20 minutes, mais peut parfois prendre jusqu’à 60 minutes. Si la solution de blanchiment est laissée agir trop longtemps, une désintégration peut se produire et il est donc conseillé de surveiller l’échantillon toutes les 10 à 15 minutes pour vérifier l’intégrité lorsque la pigmentation a été retirée du lavage des reins deux fois et d’incuber avec une solution de PFA à 4 % pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirez la solution à 4 % de PFA et lavez le rein trois fois après le dernier lavage à trois à cinq millilitres de solution de blocage et incubez le rein à température ambiante pendant deux heures.Une fois le blocage terminé, passez directement au protocole de coloration sélectionné. Retirez la solution bloquante et lavez le rein trois fois avant de laisser le rein tremper dans un XPBS pendant au moins 10 minutes. Pendant ce temps, transférez le rein dans une boîte de culture à 12 ou 24 biens.Remplacez le XPBS par une solution de substrat de phosphatase alcaline suffisamment fonctionnelle pour couvrir l’échantillon et placez l’échantillon sur un rotateur pendant 30 minutes à température ambiante. Après ce temps, arrêtez la réaction en lavant le rein dans une solution tampon de lavage à la phosphatase alcaline. Rincez le rein avec trois changements de solution tampon de lavage pendant 10 à 15 minutes.Ensuite, retirez la solution de tampon de lavage et montez le rein sur un verre propre. Glissez-le support de montage phosphatase inclus dans le kit d’étiquetage. Visualisez le rein coloré à la phosphatase alcaline à l’aide d’un stéréomicroscope ou d’un microscope composé avec un ensemble de filtres branchés à Debbie.Tout d’abord, préparez une solution de DBA fonctionnelle de 200 microlitres en diluant le DBA dans un XPBS. Remplacer la solution PBS par 200 microlitres de solution DBA et placer l’échantillon sur un rotateur pendant une heure à température ambiante. Après ce temps, retirez la solution de DBA et lavez le rein trois fois avec trois à cinq millilitres d’un XPBS pendant cinq minutes chacun.Retirez celui XPBS et montez le rein sur une lame en verre propre. Comme démontré précédemment, visualisez les segments distaux du rein colorés au DBA à l’aide d’un filtre standard Trixie ou Texas red réglé sur un stéréomicroscope fluorescent ou un microscope composé. Dans cette image en fond clair d’un rein non blanchi, la pigmentation noire correspond à la population dispersée de mélanocytes.Ici, les segments néophrons de PCT sont visualisés trois jours après l’injection de dextrine. L’encart contient l’image d’un seul néphron avec des mélanocytes. Cette image montre un rein adulte après l’élimination de la pigmentation des mélanocytes.Ces images représentatives montrent de légères variations morphologiques entre les segments de PCT, tandis que de nombreux PCT de néphron sont étroitement enroulés. D’autres néphrons contiennent des régions PCT qui ont un enroulement minimal, la dextrine bleue cascade, la dextrine Lucifer jaune et la dextrine fluoro Ruby marquent tous préférentiellement les segments PCT dans les néphrons rénaux, la dextrine Cascade Blue et le Lucifer Yellow montrent un marquage non spécifique avec un bruit de fond beaucoup plus élevé observé dans les reins traités au jaune Lucifer. En revanche, la dextrine fluoro Ruby a montré une réduction spectaculaire du bruit de fond avec un marquage PCT intense.Un rein adulte coloré par le désir de détecter un marqueur spécifique du type de cellule porteuse PCT présente un modèle d’expression caractéristique de l’absorption de la dextrine avec une distribution de divers domaines PCT en boucle étroitement enroulés, ainsi que des étirements PCT plus allongés qui montrent un large diamètre constant. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer avec succès les segments de néphron dans le rein du poisson zèbre adulte, tels que le tubule proximal avec de la phosphatase alcaline et le tubule distal médical avec DBA. N’oubliez pas que travailler avec du paraldéhyde à 4 % peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un manteau, de gants et de lunettes doivent toujours être prises lors de cette procédure.

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit une procédure pour identifier et disséquer les organes de l'zèbre adulte.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d'étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d'identifier et d'enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l'isolement cellulaire, la transplantation, et les...

Dissection du rein Zebrafish adultes

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Cette vidéo montre la dissection et la préparation d’un support plat du rein de poisson-zèbre adulte. Le support plat préparé peut être visualisé au microscope pour l’analyse des échantillons.

Préparation du support plat du rein : une procédure pour disséquer et préparer un support plat pour l’analyse microscopique du rein de poisson-zèbre adulte

Dans cette vidéo, nous démontrons la dépigmentation du rein de poisson-zèbre adulte et sa préparation ultérieure pour les procédures de coloration. Après la coloration, le rein de poisson-zèbre adulte peut être utilisé pour étudier la régénération rénale, la caractérisation phénotypique de modèles de maladies rénales et la fonctionnalité du néphron.

Dépigmentation et précoloration du rein de poisson-zèbre : une technique pour préparer le rein de poisson-zèbre adulte à la coloration

Nous présentons ici une méthode fiable pour étudier la régénération rénale adulte en induisant une lésion rénale aiguë par injection de gentamicine. Nous montrons que les dommages dépendent de la dose de gentamicine et de la température ambiante en utilisant l’hybridation in situ pour marquer lhx1a+ en développant de nouveaux néphrons.

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d'évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD.

Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse du développement des organes dans des embryons de poisson zèbre en utilisant une fluorescence microscope de dissection capables d'effectuer le sectionnement optique et des stratégies simples de réadaptation pour corriger la dérive focale et plane.

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Ce protocole décrit les procédures pour induire des lésions rénales aiguës (AKI) chez le poisson zèbre adulte utilisant le cisplatine comme agent néphroxique. Nous avons détaillé les étapes pour évaluer la reproductibilité de la technique et deux techniques pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire dans le tissu rénal, la cytométrie d’écoulement et TUNEL, respectivement.

Modèle aigu de lésion rénale induit par le cisplatine chez le poisson zèbre adulte

Le poisson-zèbre est un modèle important pour comprendre le développement des reins. Ici, un protocole d’hybridation in situ est optimisé pour détecter l’expression des gènes chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre pendant le développement du mésonéphros.

In situ Hybridation chez les larves et les juvéniles de poisson zèbre au cours du développement de Mesonephros

Découvrez une méthode d'analyse de la composition et de la fonction des néphrons chez le poisson zèbre adulte. Les techniques de marquage fluorescent permettent d'évaluer la structure rénale et la régénération.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

Explorer plus de vidéos