Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer la composition et la fonctionnalité des segments de néphron dans le rein du poisson zèbre adulte. Ceci est accompli en injectant d’abord de la dextrine marquée par fluorescence dans un nid qui attache le poisson zèbre. La deuxième étape consiste à retirer et à fixer le rein pour préparer le tissu aux méthodes de marquage ultérieures.

Ensuite, le rein est blanchi pour éliminer la pigmentation, puis coloré pour marquer par fluorescence les segments de néphron souhaités. Les résultats sont obtenus à l’aide de l’immunofluorescence, de la microscopie et/ou de l’imagerie en champ clair qui permettent de visualiser l’anatomie rénale en fonction de la ou des taches sélectionnées. Les méthodes de marquage suivantes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine du rein concernant l’anatomie des organes et peuvent être utilisées pour étudier la composition des néphrons et évaluer la fonctionnalité rénale avant et après une blessure.

Les implications de ces techniques s’étendent à l’étude des anomalies génétiques dans la formation des reins adultes et pourraient également être appliquées pour évaluer l’état rénal lors de la modélisation des maladies chroniques. Pour commencer, décantez la solution d’un poisson anesthésié et placez soigneusement l’animal sur une éponge humide moulée sur le côté ventral. Ensuite, remplissez une seringue à insuline avec 20 microlitres de solution mère de dextrine décongelée.

Placez l’aiguille de manière à ce que l’insertion se fasse à un angle peu profond sur la ligne médiane ventrale de l’abdomen. Pour éviter d’injecter légèrement les organes, soulevez l’aiguille juste après l’injection pour soulever la paroi corporelle et créer un espace dans lequel injecter la solution. Après l’injection, remettez doucement le poisson dans l’aquarium pour qu’il se remette de l’anesthésie.

Pour commencer, décantez toute solution supplémentaire d’un poisson anesthésié et placez-la sur un mouchoir ou une serviette en papier. Après avoir enlevé la tête et les organes internes, utilisez des aiguilles de dissection super fines pour ouvrir les parois du corps. Localisez l’organe rénal qui adhère à la paroi dorsale de l’animal.

Utilisez des pinces fines pour détacher le rein de la paroi dorsale. Placez délicatement le rein dans un flacon en verre de cinq millilitres contenant un XPBS et lavez-le trois fois pendant cinq minutes chacun. Retirez le rein à l’aide d’une pipette de transfert et placez-le sur une lame en verre propre avec une à deux gouttes d’un XPBS.

Utilisez une pince fine pour aplatir le rein sur la lame, en vous assurant qu’aucun tissu ne s’est enroulé ou renversé sur lui-même. Un outil en fil de tungstène peut être utilisé pour faire de petites incisions dans le tissu conjonctif afin de faciliter le positionnement à plat du rein. Ensuite, placez de petits morceaux de pâte à modeler sur chaque coin d’une lamelle en verre de 18 x 18 millimètres.

Placez lentement le couvercle sur le rein, en gardant un léger angle. Pour minimiser l’emprisonnement des bulles d’air, ajoutez une goutte supplémentaire d’un XPBS pour remplir l’espace entre la lamelle et la glissière si nécessaire. Un groupe distinct de poissons-zèbres est euthanasié et trempé dans un fixateur pendant la nuit.

Lorsque vous êtes prêt, à l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement le rein de la paroi dorsale du corps et placez l’organe dans un flacon en verre. Lavez le rein disséqué trois fois avec trois à cinq millilitres d’un XPBS à 0,05 % pendant cinq minutes chacun. Ensuite, retirez la solution de PBS et rincez le rein avec trois millilitres d’une solution de saccharose à 5 % pendant 30 minutes.

Après ce temps, remplacez la solution par trois millilitres de saccharose à 30 % et conservez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Retirez la solution et lavez le rein deux fois avant d’ajouter trois à cinq millilitres de solution de blanchiment. Pour éliminer la pigmentation mélanocytaire présente sur l’organe rénal, placez le flacon en verre sur un rotateur et observez attentivement la disparition de la pigmentation.

La dépigmentation prend généralement environ 20 minutes, mais peut parfois prendre jusqu’à 60 minutes. Si la solution de blanchiment est laissée agir trop longtemps, une désintégration peut se produire et il est donc conseillé de surveiller l’échantillon toutes les 10 à 15 minutes pour vérifier l’intégrité lorsque la pigmentation a été retirée du lavage des reins deux fois et d’incuber avec une solution de PFA à 4 % pendant une heure à température ambiante. Ensuite, retirez la solution à 4 % de PFA et lavez le rein trois fois après le dernier lavage à trois à cinq millilitres de solution de blocage et incubez le rein à température ambiante pendant deux heures.

Une fois le blocage terminé, passez directement au protocole de coloration sélectionné. Retirez la solution bloquante et lavez le rein trois fois avant de laisser le rein tremper dans un XPBS pendant au moins 10 minutes. Pendant ce temps, transférez le rein dans une boîte de culture à 12 ou 24 biens.

Remplacez le XPBS par une solution de substrat de phosphatase alcaline suffisamment fonctionnelle pour couvrir l’échantillon et placez l’échantillon sur un rotateur pendant 30 minutes à température ambiante. Après ce temps, arrêtez la réaction en lavant le rein dans une solution tampon de lavage à la phosphatase alcaline. Rincez le rein avec trois changements de solution tampon de lavage pendant 10 à 15 minutes.

Ensuite, retirez la solution de tampon de lavage et montez le rein sur un verre propre. Glissez-le support de montage phosphatase inclus dans le kit d’étiquetage. Visualisez le rein coloré à la phosphatase alcaline à l’aide d’un stéréomicroscope ou d’un microscope composé avec un ensemble de filtres branchés à Debbie.

Tout d’abord, préparez une solution de DBA fonctionnelle de 200 microlitres en diluant le DBA dans un XPBS. Remplacer la solution PBS par 200 microlitres de solution DBA et placer l’échantillon sur un rotateur pendant une heure à température ambiante. Après ce temps, retirez la solution de DBA et lavez le rein trois fois avec trois à cinq millilitres d’un XPBS pendant cinq minutes chacun.

Retirez celui XPBS et montez le rein sur une lame en verre propre. Comme démontré précédemment, visualisez les segments distaux du rein colorés au DBA à l’aide d’un filtre standard Trixie ou Texas red réglé sur un stéréomicroscope fluorescent ou un microscope composé. Dans cette image en fond clair d’un rein non blanchi, la pigmentation noire correspond à la population dispersée de mélanocytes.

Ici, les segments néophrons de PCT sont visualisés trois jours après l’injection de dextrine. L’encart contient l’image d’un seul néphron avec des mélanocytes. Cette image montre un rein adulte après l’élimination de la pigmentation des mélanocytes.

Ces images représentatives montrent de légères variations morphologiques entre les segments de PCT, tandis que de nombreux PCT de néphron sont étroitement enroulés. D’autres néphrons contiennent des régions PCT qui ont un enroulement minimal, la dextrine bleue cascade, la dextrine Lucifer jaune et la dextrine fluoro Ruby marquent tous préférentiellement les segments PCT dans les néphrons rénaux, la dextrine Cascade Blue et le Lucifer Yellow montrent un marquage non spécifique avec un bruit de fond beaucoup plus élevé observé dans les reins traités au jaune Lucifer. En revanche, la dextrine fluoro Ruby a montré une réduction spectaculaire du bruit de fond avec un marquage PCT intense.

Un rein adulte coloré par le désir de détecter un marqueur spécifique du type de cellule porteuse PCT présente un modèle d’expression caractéristique de l’absorption de la dextrine avec une distribution de divers domaines PCT en boucle étroitement enroulés, ainsi que des étirements PCT plus allongés qui montrent un large diamètre constant. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer avec succès les segments de néphron dans le rein du poisson zèbre adulte, tels que le tubule proximal avec de la phosphatase alcaline et le tubule distal médical avec DBA. N’oubliez pas que travailler avec du paraldéhyde à 4 % peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un manteau, de gants et de lunettes doivent toujours être prises lors de cette procédure.