Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

L'objectif général de cette procédure est de générer un dosage quantitatif de la fonction rénale chez le poisson zèbre. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord les embryons de poisson zèbre à 72 HPF. Ensuite, les embryons sont transférés dans un moule d'injection et orientés de manière à ce que leurs cœurs se trouvent à gauche du champ de vision.

Ensuite, la cavité péricardique est injectée avec un colorant fluorescent rumine dextra et des images fluorescentes de la région cardiaque sont obtenues à l’aide d’un microscope stéréoscopique à fluorescence épiscopique. Enfin, l’élimination rénale d’un colorant fluorescent est évaluée par microscopie à fluorescence épiscopique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une mesure quantitative de la fonction rénale du poisson zèbre sans nécessiter de tests sanguins ou urinaires, qui ne sont pas réalisables chez le poisson zèbre.

Cette méthode fournit un outil puissant pour évaluer la fonction rénale chez les modèles de maladie chez le poisson zèbre. Après avoir préparé les aiguilles et fabriqué un moule selon le protocole décrit, coulez le moule en versant d'abord une solution d'aro à 2 % préparée dans de l'eau pour poissons dans une boîte de Pétri de 90 millimètres. Placez le moule sur la boîte de Pétri, en inclinant légèrement les bords des lames superposées pour qu'ils s'immergent sous la surface d'aro.

Laisser reposer pendant 30 minutes. Retirer le moule à lame et utiliser de l’eau de poisson fraîche contenant un anesthésique trica dans un rapport de un à 25. Pour couvrir la lame, imprégner d’aros afin d’effectuer des injections de colorant fluorescent chez le poisson zèbre.

Utilisez un dispositif standard de microinjection composé d'un compresseur d'air relié à un système de régulation de pression qui alimente un porte-pipette droit destiné à être utilisé avec des capillaires de 1,0 de diamètre externe. Le porte-pipette doit être monté sur un manipulateur microscopique compact MN 33 à commande tridimensionnelle, fixé à une plaque de base en acier à l'aide d'un support magnétique, et associé à un microscope stéréoscopique afin de visualiser, manipuler et injecter les embryons, tout en maintenant les poissons zèbres dans des conditions standard telles que décrites dans le protocole écrit.

Utilisez des lignées de poissons zèbres de type sauvage ou transgéniques selon les besoins de l'expérience. Maintenez une densité d'alimentation de 15 mâles pour 15 femelles par aquarium de huit litres afin de recueillir un nombre maximal d'œufs sans perturber les poissons. Plongez les aquariums de reproduction dans les aquariums de stock de type sauvage la veille du prélèvement.

Le jour de la collecte, prévoir de 30 à 40 minutes pour que les poissons se reproduisent. Ensuite, utiliser un tamis et de l'eau fraîche d'aquarium pour recueillir et rincer les œufs. Déposer les œufs nettoyés dans une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant du milieu pour embryons, et incuber à 28,5 degrés Celsius afin d'inhiber la myogenèse.

Huit heures après la fécondation (hpf). Transférer les embryons viables, avec un minimum de liquide, dans des boîtes de Pétri fraîches contenant de un à 100 PTU par milieu d'embryon, puis poursuivre l'incubation à 28,5 degrés Celsius.

Utilisez une pince fine pour briser l'extrémité de l'aiguille. Ensuite, déplacez le RD vers l'extrémité de l'aiguille en maximisant la durée d'impulsion sur le réglage en minutes. Lorsque la solution atteint l'extrémité, revenez aux millisecondes.

Placez un micromètre sur la platine du microscope et, à l’aide du régulateur de pression et des réglages fins de la pointe de l’aiguille, ajustez la taille de la goutte expulsée à un diamètre de 100 microns ou à un volume de 0,5 nanolitre avant l’injection. Préparez 2 boîtes de Pétri de 35 millimètres, chacune contenant cinq millilitres de milieu pour embryons ; étiquetez l’une « trica » et l’autre « recovery ».

Ajoutez 200 microlitres de trica stock dans la boîte de Pétri étiquetée trica. Une fois prêt à injecter, sélectionnez un embryon individuel à 72 HPF. Transférez le minimum de liquide dans la boîte de Pétri contenant la trica et surveillez l'activité de l'embryon.

Une fois l'embryon anesthésié, transférez-le dans le moule d'injection et orientez-le dans la rainure de manière à ce que le côté gauche soit tourné vers le haut, en positionnant le cœur du côté gauche du champ de vision. Pour injecter le RD dans le cœur, percez le péricarde à l'aide de l'aiguille et injectez un nanolitre de RD dans la cavité péricardique.

Après avoir retiré l'aiguille, transférez l'embryon injecté avec le minimum de liquide vers la boîte de récupération et surveillez pendant une minute. Ensuite, transférez l'embryon individuel dans une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu frais pour embryons additionné de PTU, et étiquetez correctement. Après avoir injecté au moins 10 embryons par groupe expérimental, incubez à 28,5 degrés Celsius pendant trois heures.

Trois heures après l'injection (HPI), anesthésier les embryons comme décrit précédemment. Transférer-les dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant 3 % de méthylcellulose. Pousser délicatement les embryons dans la méthylcellulose et les orienter de manière à pouvoir imager le côté latéral.

À l’aide d’un filtre d’émission de 570 nanomètres pour la lumière UV, acquérez une image de l’embryon. Laissez l’embryon se remettre avant de le replacer dans le puits désigné, acquérez des images pour tous les embryons injectés, puis poursuivez l’incubation à 28,5 degrés Celsius. Après avoir acquis une deuxième série d’images à 24 HP, j’utilise le logiciel ImageJ pour quantifier l’intensité de fluorescence de chaque embryon injecté en ouvrant une image et en spécifiant une région d’intérêt ou ROI.

En choisissant l'option modifier la sélection, spécifiez et réglez la valeur à 100 pixels carrés. Positionnez le cœur au centre de la zone d'intérêt (ROI) et sélectionnez analyser, définir les mesures, puis configurez les mesures pour inclure la teinte grise moyenne et la surface. Ensuite, effectuez la mesure, quantifiez la fluorescence pour chaque série d'images à 3 HPI et 24 HPI par embryon, puis transférez les valeurs moyennes de teinte grise dans un tableur pour un traitement ultérieur.

Utilisez un logiciel approprié pour effectuer l'analyse statistique et comparer les groupes afin d'évaluer la signification statistique à l'aide du test T de Student, comme illustré ici. L'injection de RD dans les bbbs de neuf poissons Morpho injectés a entraîné le développement de kystes de friction ventrale chez 40 % des embryons cinq jours après la fécondation. De plus, les poissons morpholino ont montré une réduction de leur capacité à éliminer le colorant fluorescent après 24 HPI par rapport aux témoins.

Il faut qu'un groupe de 10 poissons soit injecté en moins de 15 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tirer parti de la transparence optique du poisson zèbre pour surveiller quantitativement l'élimination temporelle d'un colorant fluorescent micro-injecté, un indicateur efficace de la fonction rénale du poisson zèbre.