Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

L’objectif global de cette procédure est de générer un test quantitatif de la fonction rénale chez le poisson zèbre. Ceci est accompli en anesthésant d’abord les embryons de poisson-zèbre à 72 HPF. Ensuite, les embryons sont transférés dans un moule d’injection et orientés de manière à ce que leur cœur soit à gauche du champ de vision.

Ensuite, la cavité péricardique est injectée avec un colorant fluorescent supplémentaire rumine et des images fluorescentes de la région cardiaque sont nécessaires à l’aide d’un microscope de dissection par épifluorescence. En fin de compte, la clairance rénale d’un colorant fluorescent est évaluée à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit une lecture quantitative de la fonction rénale du poisson zèbre sans nécessiter d’analyses sanguines ou urinaires, ce qui n’est pas possible chez le poisson zèbre.

Cette méthode fournit un outil puissant pour évaluer la fonction rénale dans les modèles de maladie du poisson-zèbre. Après avoir tiré les aiguilles et préparé un moule selon le protocole de texte, coulez le moule en versant d’abord une solution à 2 % d’aro faite dans de l’eau de poisson dans une boîte de Pétri de 90 millimètres. Placez le moule sur la boîte de Pétri, en laissant les bords des lames empilées s’immerger en biais sous la surface agricole.

Laisser reposer pendant 30 minutes. Retirez le plâtre de la diapositive et utilisez de l’eau de poisson fraîche contenant un anesthésique trica dans un rapport de un à 25. Pour couvrir la diapositive, il a été imprimé pour effectuer des injections de colorant fluorescent chez le poisson zèbre.

Utilisez une configuration de micro-injection standard composée d’un compresseur d’air connecté à un système de régulation de pression qui alimente un porte-pipette droit pour une utilisation avec des capillaires de 1,0 diamètre extérieur. Le porte-pipette doit être logé dans un boîtier MN 33. Micromanipulateur de contrôle à trois axes fixé à une plaque de base en acier par un microscope de dissection magnétique pour visualiser, manipuler et injecter des embryons tout en maintenant le poisson zèbre dans des conditions standard telles que décrites dans le protocole de texte.

Utilisez des lignées de poisson-zèbre de type sauvage ou transgénique selon le cas pour l’expérience. Maintenir une densité de peuplement de 15 mâles à 15 femelles par réservoir de huit litres pour s’assurer que le maximum d’œufs sont collectés sans déranger les poissons. Immergez les bassins d’élevage dans les bassins de stockage de type sauvage la veille de la collecte.

Le jour de la collecte, prévoyez 30 à 40 minutes pour que les poissons frayent. Ensuite, utilisez une passoire à mailles et de l’eau fraîche d’aquarium pour recueillir et rincer les œufs. Déposez les œufs nettoyés dans une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant l’embryon, le milieu et incubez à 28,5 degrés Celsius pour inhiber la myogenèse.

À huit heures. Post-fertilisation ou HPF. Transférez les embryons viables dans un minimum de liquide dans des boîtes de Pétri fraîches contenant un à 100 PTU dans un milieu embryonnaire et incubez ensuite à 28,5 degrés Celsius.

Utilisez une pince à pointe fine pour casser l’extrémité de l’aiguille. Déplacez ensuite le RD vers la pointe de l’aiguille en maximisant la durée de l’impulsion à la minute. Lorsque la solution atteint la pointe, revenez à la milliseconde.

Placez un micromètre sur la platine du microscope et, à l’aide du régulateur de pression et des raffinements à la pointe de l’aiguille, ajustez la taille de la gouttelette expulsée à 100 microns de diamètre ou à un volume de 0,5 nanolitre avant l’injection. Installez 2 boîtes de Pétri de 35 millimètres. Chacun contenant cinq millilitres de milieu embryonnaire marque une trica et l’autre de récupération.

Ajoutez 200 microlitres de trica de bouillon dans le plat étiqueté trica. Une fois prêt à injecter, sélectionnez un embryon individuel à 72 HPF. Transférez un minimum de liquide dans la boîte trica et surveillez l’activité de l’embryon.

Une fois l’embryon anesthésié, transférez-le dans le moule d’injection et orientez-le dans l’auge de manière à ce que le côté gauche soit tourné vers le haut. Positionnement du cœur sur le côté gauche du champ de vision. Pour injecter le DR dans le cœur, utilisez l’aiguille pour percer le péricarde et injectez un nanolitre de RD dans la cavité péricardique.

Après avoir retiré l’aiguille, transférez l’embryon injecté dans un minimum de liquide dans la boîte de récupération et surveillez pendant une minute. Transférez ensuite l’embryon individuel dans une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu d’embryon frais contenant du PTU et étiquetez de manière appropriée. Après avoir injecté au moins 10 embryons par groupe expérimental, incuber à 28,5 degrés Celsius pendant trois heures.

Trois heures après l’injection ou l’HPI, les embryons anesthésiés comme décrit précédemment. Et transférez dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant 3 % de méthylcellulose. Poussez doucement les embryons dans la méthylcellulose et orientez-les de manière à ce que la face latérale puisse être imagée.

À l’aide d’un filtre d’émission de 570 nanomètres pour la lumière UV, acquérez une image de l’embryon. Laissez l’embryon se rétablir avant de le replacer dans le puits désigné, obtenez des images pour tous les embryons injectés, puis continuez à incuber à 28,5 degrés Celsius. Après avoir acquis une deuxième série d’images à 24 CV, j’utilise le logiciel image J pour quantifier l’intensité de fluorescence de chaque embryon injecté en ouvrant une image et en spécifiant une région d’intérêt ou ROI.

En choisissant Modifier la sélection, spécifiez et définissez la valeur sur 100 pixels carrés. Positionnez le cœur au centre du retour sur investissement et choisissez analyser, définir les mesures et définir les mesures pour inclure l’échelle de gris moyenne et la surface. Ensuite, prenez la mesure, quantifiez la fluorescence pour chaque ensemble d’images à trois HPI et 24 HPI par embryon et transférez les valeurs moyennes de l’échelle de gris dans une feuille de calcul pour un traitement ultérieur.

Utilisez un logiciel approprié pour effectuer une analyse statistique et comparer des groupes pour en déterminer la signification statistique à l’aide du test T de l’élève, comme illustré ici. L’injection de DR dans neuf poissons injectés par Morpho a entraîné le développement de kystes friques prostatiques chez 40 % des embryons cinq jours après la fécondation. De plus, le poisson morphine a montré une réduction de la capacité à éliminer le colorant fluorescent après 24 HPI par rapport aux témoins.

Une fois qu’il y a un moût, un groupe de 10 poissons peut être injecté en 15 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tirer parti de la transparence optique du poisson-zèbre pour surveiller quantitativement la clairance temporelle d’un colorant fluorescent micro-injecté comme lecture efficace de la fonction rénale du poisson-zèbre.