Name: Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Apprenez à évaluer la fonction rénale chez le poisson zèbre en utilisant une méthode d'immunofluorescence quantitative. Cette technique permet de mesurer le clairance rénal sans prélèvement sanguin ni urinaire.

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Assistance technique fournie par Jaipreet Bharj. Ce travail a été financé par des subventions du FP7-UE (SYSCILIA -241 955) et le rein Fondation néerlandaise (CP11.18).

Déclaration éthique: animaux, l&#39;élevage, l&#39;entretien et les procédures sont définies et contrôlées par la Loi 1986. Tous expérimentation animale a été réalisée sous licences accordées par le ministre de l&#39;Intérieur (PIL n ° 70/7892) en conformité avec biologique Animaux (Scientific Procedures) Services de Groupe de gestion et le comité d&#39;éthique services biologique, SGUL, Londres, Royaume-Uni. Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d&#39;animaux utilisés et d&#39;affiner les procédures et l&#39;élevage afin de minimiser la souffrance et améliorer le bien-être. 1. Préparation des instruments, anesthésique et Fluorescent Dye <ol><li> Utilisation d&#39;un étirage de micropipettes et les capillaires standard de borosilicate de paroi (sans filaments) tirer les aiguilles de longueur appropriée pour la micro-injection (figure 1A). </li><li> Faire un moule agarose pour l&#39;orientation des embryons pour injection facile dans le péricarde (figure 1B). Colle environ dix verre microscope slides ensemble pour former un «escalier» de diapositives offset. Pour de meilleurs résultats, utilisez une goutte de colle époxy rapide jeu de résine dans le centre de chaque diapositive. </li><li> Découpez une section d&#39;environ 78 mm de longueur à mi-chemin à travers deux pipettes 10 ml en plastique à l&#39;aide d&#39;un scalpel chauffé bec Bunsen, retirez pipette se termine comme il convient. Attachent et les articles de la colle (résine époxy) de pipette aux lames de verre empilés pour fournir la stabilité pour permettre le moule de puiser dans un plat de 90 mm de Pétri. Faites tous les efforts pour assurer les coins de diapositives alignent perpendiculaire à la chaussée plat Petri. Prévoyez du temps de colle à définir. </li><li> Casting de moule dans une solution d&#39;agarose à 2% dans l&#39;eau fait de poisson (obtenu à partir de l&#39;aquarium). Verser agarose dans une boîte de Pétri de 90 mm et placez le moule sur le dessus de la boîte de Pétri ouverte, permettant la diapositive empilés bords de submerger à un angle sous la surface de la gélose. Laisser reposer sur le banc de laboratoire pendant 30 min. </li><li> Retirer le casting de diapositives et couvrir l&#39;agarose coulissant imprimé avec de l&#39;eau du poisson fraiscontenant Tricaine anesthésie (voir l&#39;étape 1.9) dans un rapport 1:25. </li><li> Assurez solutions de rhodamine dextran (RD) colorant. Remettre en suspension rhodamine B 10 000 MW étiqueté dextran dans l&#39;eau ultra-pure autoclave pour obtenir une concentration du stock de 50 mg / ml. Pour la micro-injection, diluer davantage le stock à une concentration finale de 5 mg / ml dans l&#39;eau ultra-pure autoclave. NOTE: cellules pigmentées commencent à se différencier chez le poisson zèbre de 24 heures après la fécondation (HPF); ceux-ci peuvent obscurcir marqueurs fluorescents lors de l&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Inhiber la formation des mélanocytes à l&#39;aide de N -Phenylthiourea (PTU), qui bloque la mélanogenèse par inhibition de la tyrosinase. Faire une solution d&#39;achat d&#39;actions de 0,003% des PTU en dissolvant la poudre dans de l&#39;eau PTU aquarium, solution de la chaleur à 60 ° C pour solubiliser totalement. </li><li> Incuber embryons de poisson zèbre en solution de bleu de méthylène, un fongicide doux, pour éviter la prolifération de champignons et augmenter la survie. Ajouter 2 ml de solution stock méthylène bleu, contenant 0,1% de bleu de méthylène dans ueau ltrapure, à 1 L d&#39;eau de l&#39;aquarium et de l&#39;utilisation en tant que moyen d&#39;embryons standard. </li><li> Faire un 15 mM concentration stock de tricaïne méthanesulfonate / éthyl-3 benzoate comme indiqué dans «Le poisson zèbre livre &#39;23. Anesthésier les embryons et par conséquent les immobilisé pour effectuer la procédure de micro-injection. </li><li> Après anesthésier les embryons, les orienter, pour l&#39;imagerie en utilisant les propriétés non-toxiques et visqueux de méthylcellulose. Pour faire un 200 ml préparation de 3% de méthylcellulose, chill 130 ml d&#39;eau à -20 ° C pendant 30 min et placer sur la glace. Chauffer 70 ml d&#39;eau à 80 ° C dans un bêcher en verre, ajouter 6 g de méthylcellulose, et agiter à l&#39;aide d&#39;une baguette de verre jusqu&#39;à ce que toutes les particules sont mouillées et dispersées uniformément. Ajouter l&#39;eau glacée, mélanger et laisser la préparation refroidir à 4 ° C pendant 30 min avant aliquotage en tubes de 50 ml. REMARQUE: abaissement de la température permet la méthylcellulose à devenir soluble. La solution deviendra plus épaiscomme les hydrates de poudre. 3% de méthylcellulose peut être stocké sans croissance bactérienne pour de courtes périodes d&#39;une semaine à 4 ° C ou plus à -20 ° C. Assurez-vous que la méthylcellulose a atteint RT avant utilisation. </li><li> Pour effectuer des injections de colorant fluorescent dans le poisson zèbre utiliser un micro-injection set-up standard (figure 1C). Il se agit d&#39;un compresseur d&#39;air relié à un système de régulation de pression qui alimente un porte-pipette directement pour une utilisation avec 1,0 capillaires de diamètre extérieur. Le titulaire de la pipette doit être logé à l&#39;intérieur d&#39;un micromanipulateur compact contrôle 3-MM33 axe solidaire d&#39;une plaque de base en acier par un support magnétique. Les embryons peuvent être visualisées, manipulé et injecté au moyen d&#39;un microscope à dissection stéréo. </li></ol> 2. poisson zèbre élevage et de traitement pré-injection <ol><li> Maintenir le poisson zèbre comme décrit précédemment 23. Utilisez un aquarium set-up qui fournit l&#39;eau de recirculation fourni à une température constante de 28,5 ° C, Conditionné à un pH de 6.8 à 7.2 et une conductivité de 450 à 550 pS avec du bicarbonate de sodium et Instant Ocean sel de mer, respectivement. Utilisez type sauvage ou des lignes de poisson zèbre transgénique, le cas échéant à l&#39;expérience, le maintien d&#39;une densité de stockage de 15 hommes 15 femmes par 8 L réservoir. Réglez le photocycle des installations de poisson à 14 h de la lumière du jour entre 9 heures-23 heures. </li><li> Frai du poisson zèbre commence au début de la photocycle, lorsque les lumières se allument dans la matinée. Pour assurer un maximum d&#39;œufs peuvent être collectées sans déranger les poissons, plongez bassins d&#39;élevage (contenant des inserts en mesh, disponibles auprès des spécialistes de poisson zèbre) dans les réservoirs de stockage de type sauvage le soir avant la collecte. </li><li> Le jour de la collecte, permet 30 à 40 min pour les poissons pour frayer, après quoi recueillir et rincer œufs à l&#39;aide d&#39;une passoire à thé et de l&#39;eau de l&#39;aquarium frais. Déposer les œufs nettoyés dans un milieu contenant des embryons de 90 mm de boîte de Pétri et incuber à 28,5 ° C. </li><li> Traiter les embryons avec PTU pour inhiber mélanogenèse. A 8 HPF, transférer des embryons viables dans le liquide minimal pour des plats frais de Pétri contenant 1: 100 PTU à moyen de l&#39;embryon et incuber encore à 28,5 ° C jusqu&#39;à 72 HPF. REMARQUE: PTU peut causer des anomalies de développement se il est utilisé à des stades antérieurs devraient donc être restreintes pour poster huit étapes de HPF, mais peut être traitée aussi tard que 24 HPF. Plus tardive des PTU ne bloque pas entièrement la pigmentation des yeux, mais est généralement couronnée de succès et en inhibant la formation de tronc mélanocytes. </li></ol> 3. microinjection NOTE: Le péricarde entoure le cœur, mais est séparé pour la protection et la facilité de mouvement cardiaque par le fluide dans la cavité péricardique. L&#39;objectif de cette procédure consiste à injecter RD dans la cavité péricardique, cela permet une absorption rapide du colorant au système de vascularisation. <ol><li> aiguilles de charge avec 6 pi - dilués RD, à l&#39;aide des conseils de microloader et sécurisé dans le support de l&#39;aiguille du micromanipulateur. Casser la fin de l&#39;aiguille à l&#39;aide bien tippforceps ed (figure 1A). Déplacez la solution de RD à la pointe de l&#39;aiguille en maximisant la durée d&#39;impulsion pour le réglage des minutes, revenir à msec une fois terminé. </li><li> Utiliser un micromètre, le régulateur de pression, et des améliorations à la longueur de la pointe de l&#39;aiguille (en utilisant une pince) pour ajuster la taille de la gouttelette expulsé à 100 m de diamètre, ce qui équivaut à un volume de 0,5 nl (figure 2A). REMARQUE: Lorsque l&#39;aiguille se casse, veillez à ne pas casser trop large sinon il fera calibrer le volume d&#39;injection difficile. Si nécessaire, briser encore la pointe de l&#39;aiguille d&#39;augmenter la taille des gouttes cependant conserver une épaisseur d&#39;aiguille qui permet l&#39;entrée dans le péricarde sans flexion excessive ou des dommages aux tissus. </li><li> Avant l&#39;injection, anesthésier les embryons dans le milieu de l&#39;embryon contenant tricaïne. Mettre en place 2 x 35 mm boîtes de Pétri contenant 5 ml de milieu d&#39;embryon, une étiquette &#39;Tricaine&#39; et l&#39;autre &#39;Recovery&#39;. </li><li> Ajouter 200ul de stock tricaïne à l&#39;antenne dûment étiquetés. Une fois prêt à injecter, sélectionnez un embryon individuelle à 72 HPF et transférer dans un liquide minimale au plat tricaïne. Surveiller l&#39;activité de l&#39;embryon, tester l&#39;embryon est anesthésié et immobilisé par agitation douce en utilisant une pointe de microloader tronquée. </li><li> Transférer l&#39;embryon anesthésié au moule d&#39;injection et orienter l&#39;embryon à l&#39;intérieur d&#39;une auge d&#39;agarose sorte que le côté gauche soit vers le haut, le positionnement du coeur à la gauche du champ de vision. </li><li> Pour injecter la RD dans le cœur, le péricarde percer avec l&#39;aiguille et injecter 1 nl de RD dans la cavité péricardique de l&#39;embryon anesthésié (figure 2B, panneau de droite). Retirer l&#39;aiguille après l&#39;injection. Transférer l&#39;embryon injecté dans le liquide minimal à &#39;plat de récupération &quot;et surveiller pendant 1 min. Transférer l&#39;embryon individu à une plaque de 24 puits contenant 1 ml de milieu d&#39;embryons frais (contenant PTU) et étiqueter correctement. REMARQUE: Le péricarde est difficile, mais il ya un point faible notable à l&#39;intersection où le péricarde répond aux arcs pharyngiens ventro-caudal et dorso-rostrale sac vitellin (figure 2B) flèche. L&#39;aiguille doit être adressée à cette rainure. Lorsque l&#39;aiguille est en place, un robinet cabinet d&#39;un doigt sur le dessus du micromanipulateur va faciliter l&#39;entrée dans la cavité péricardique. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour au moins 10 embryons par groupe expérimental, placez chaque poisson dans un puits séparé et unique labelto permis individuels expérimentaux suivis. Incuber à 28,5 ° C pendant 3 heures. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> À 3 h injection de poste (HPI) anesthésier embryons comme décrit précédemment et transférer dans un plat de 35 mm de Pétri contenant 3% de méthylcellulose. Poussez doucement embryons dans la méthylcellulose et d&#39;orienter de sorte que le côté latéral peut être imagée. </li><li> Acquérir une image de l&#39;embryon sous UV en utilisant un filtre pour la visualisation of lumière émise à 570 nm (figure 2C). Après l&#39;acquisition de l&#39;image, permet de récupérer l&#39;embryon avant de remplacer dans le puits désigné. Acquérir des images pour tous les embryons injectés et incuber encore à 28,5 ° C. NOTE: Dans ce protocole, nous avons utilisé un stéréomicroscope fluorescente avec un jeu de filtres de TXR, une caméra DFC300FX et logiciels d&#39;application respective. Prenez note des paramètres d&#39;acquisition exactes pour l&#39;acquisition de l&#39;image suivante. </li><li> Au 24 HPI, acquérir un second tour d&#39;images tel que décrit ci-dessus. Une fois que toutes les images ont été acquises, à la fois à 3 et 24 HPI HPI, humainement disposer des embryons ou à d&#39;autres moyens expérimentaux par exemple, immunohistochimie. </li></ol> 5. Traitement d&#39;image <ol><li> Quantifier intensité de fluorescence de chaque embryon injecté, à 3 et 24 HPI HPI, en analysant des images en utilisant le logiciel ImageJ du NIH. Pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence, ouvrir une image dans ImageJ et spécifiez une région d&#39;intérêt (ROI) à 100 px (sélection Edit → → préciser) 2. </li><li> Positionner le coeur dans le centre de la ROI (figure 2C), réglez mesures pour y inclure l&#39;échelle de gris moyen et environs (Analyser → ensemble des mesures), effectuer une mesure (Analyser → mesure). Remplissez pour chaque ensemble d&#39;images, à 3 et 24 HPI HPI, par embryon et de transférer des valeurs moyennes d&#39;échelle de gris vers un tableur pour traitement ultérieur. NOTE: Nous avons choisi une taille de roi fixe de 100 px 2 car cela englobe coeurs individuels entre embryons. Le cœur a été choisi pour effectuer des mesures en raison de la taille importante qui permet à un emplacement commode pour mesurer la teneur fluorescent du sang avant d&#39;entrer dans le rein. </li><li> Effectuer une analyse statistique en utilisant un logiciel statistique appropriée. Comparer des groupes de signification statistique en utilisant le test t de l&#39;élève. </li></ol>

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<li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li>
</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Poisson zèbre offre un outil précieux pour modéliser les maladies génétiques humaines, leur utilisation comme un instrument scientifique pour la recherche in vivo ont permis des études détaillées de la répartition génétique de nombreux systèmes biologiques, y compris le rein. Une grande partie est maintenant compris comment le rein poisson zèbre se développe et fonctionne. Les similitudes frappantes avec néphrogenèse humaine et d&#39;homologie avec la maladie causant des gènes 21 a montré comment le ...

Le rein humain joue un rôle crucial dans le filtrage des déchets métaboliques du sang et la récupération de solutés nécessaires pour maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. Il existe un certain nombre de maladies génétiques humaines qui provoquent un dysfonctionnement rénal. La maladie rénale héréditaire la plus fréquente est autosomique polykystose rénale dominante (PKD) caractérisé par le développement des sacs remplis de fluide dans les tubules néphrétiques; les dommages causés par la cystogénèse est préjudiciable à la fonction rénale 10. ADPKD a une occurrence de 1: 800-1: 1000 et représente 8 à 10% des patients en insuffisance rénale au stade terminal (ESRF) 11. Plusieurs gènes ont été impliqués pour provoquer ADPKD y compris polycystine-1 (PKD1) et -2 (PKD2), représentant environ 85% et 15% des cas respectivement 12,13. En outre, les produits de gènes pour PKD1 et -2 localiser le cil et sont fondamentales pour ciliogenèse 14,15. Il ya maintenant une famille reconnue de troubles génétiques humains, connus sous le nomles ciliopathies, qui affectent la fonction des cils et se traduisent par CKD 16. Le nombre croissant de maladies génétiques humaines qui affectent le développement et la fonction ciliaire suscite l&#39;intérêt mondial dans cet organite résiduelle autrefois considéré. Le cil, une saillie cellulaire ressemblant à des cheveux, est enrichi avec les récepteurs et les canaux nécessaires à la transduction des événements de signalisation cellulaire clés d&#39;ions. Le cil est constitué d&#39;une base de axoneme microtubules, typiquement structuré en neuf doublets de microtubules disposés radialement, avec ou sans une paire centrale de microtubules de singulet. La structure de axonémale définit le type et le mode d&#39;action ciliaire. L&#39;arrangement des microtubules 9 + 2 confère à la motilité du cil où il est utilisé dans le déplacement des fluides à travers les surfaces epitheliales. La configuration 9 + 0 est non mobiles, mais est considéré principalement fonction des événements de signalisation cellulaire 17. En dehors de CKD, les conséquences de la dysfonction ciliaire sont un ensemble de caractéristiquescaractéristiques de ciliopathie qui comprennent, l&#39;obésité, la dégénérescence rétinienne, une polydactylie, et la déficience cognitive 16. Cependant, CKD est parmi les plus préjudiciables à la qualité de vie du patient et donc une force motrice majeure derrière le développement de appropriée dans des modèles in vivo pour ciliaire liés CKD. Le poisson zèbre est un excellent modèle pour comprendre l&#39;étiologie de la maladie génétique humaine. Leur développement rapide, la production d&#39;un grand nombre d&#39;œufs, tissu transparent, et la croissance ex utero permet processus de développement de poisson zèbre pour être visualisées et événements biologiques manipulés avec beaucoup d&#39;aisance. Les gènes peuvent être génétiquement modifiés en utilisant le récent succès d&#39;outils d&#39;édition de génome (CRISPR 18 et 19 TALENS), renversé en utilisant la technologie antisens morpholino 20, ou pharmacologiquement réglementés par l&#39;addition de composés à leur environnement aquatique. En effet, le poisson zèbre offre une plate-forme pour entreprendre eXperiments qui ne sont pas permissives dans d&#39;autres modèles animaux. Alors que le poisson-zèbre sont des vertébrés relativement simples (par rapport à l&#39;homme), ils partagent de nombreux organes fonctionnellement conservés, des gènes et des processus de signalisation en commun avec les humains. Par exemple, le rein poisson zèbre est remarquablement similaire en structure et la fonction par rapport à l&#39;homme 21,22. Cependant, contrairement au rein de mammifère qui se développe à travers une succession de phases, chacune marquée par un rein plus développé (pronéphros, mésonéphros métanéphros), et, le poisson zèbre embryonnaire ne se développe un pronéphros, la forme la plus immature d&#39;un rein. Alors que des millions de néphrons peuvent être trouvés formant les blocs de construction de rein de mammifère, l&#39;embryon de poisson zèbre possède seulement deux. Le glomérules, qui permettent pour le filtrat sanguin initial, sont fusionnés à la ligne médiane ventrale juste à l&#39;aorte. filtres de sang dans les glomérules dans les tubules pronephrique qui se exécutent caudale long de l&#39;axe, la fusion avant la sortie via le cloaque. Le pronephrique tubules sont fortement ciliés de cils motiles qui sont permissives pour l&#39;écoulement du filtrat vers la sortie caudale 3,4. Cette structure pronephrique simples maintient l&#39;homéostasie poisson zèbre par plusieurs semaines de croissance larvaire où ils finissent par se transformer en une structure plus complexe mésonéphros 21. Cependant, le poisson zèbre ne se développe jamais un métanéphros 21. Malgré les particularités de poisson zèbre, le néphron poisson zèbre est segmenté avec des profils d&#39;expression génique égal à celui observé chez les mammifères et offre ainsi un incomparable modèle in vivo pour néphrogenèse 3,22. Régulièrement patients sont testés pour la fonction rénale par une série de tests sanguins et urinaires. Typiquement, le sang est analysé pour les sels dissous, l&#39;urée et la créatinine. Des niveaux élevés de l&#39;urée, la créatinine et les concentrations de sel anormales sont révélateurs de problèmes avec la fonction rénale. L&#39;analyse d&#39;urine en utilisant une jauge colorimétrique détecte des niveaux anormaux de protéines, blood, du pus, de bactéries et de sucre présente dans les échantillons d&#39;urine. Ces essais nécessitent normalement environ 30 ml d&#39;urine ou de 5 à 10 ml de sang. Il a été difficile de traduire ces types d&#39;essais à petite dans des organismes modèles in vivo, tels que le poisson-zèbre, principalement en raison de la nature impossible de collecter le sang ou l&#39;urine suffisante pour réaliser le dosage. Ici, nous abordons l&#39;absence de tests de la fonction rénale poisson zèbre appropriées et décrivons une technique innovante pour son étude. En injectant un colorant fluorescent dans le sang nous sommes en mesure de suivre et de quantifier individuellement dans le temps de la filtration et de l&#39;excrétion de l&#39;activité de fluorescence à partir du sang par les reins. Cette méthode peut être utilisée pour étudier des dommages aux reins causée par la maladie, ce qui nous fournissons un exemple de.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Extracteur de micropipette de type Flaming/Brown</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires à paroi standard en borosilicate Appareil</td><td>de Harvard</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Colle à résine époxy</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10 000 MW étiqueté Dextran</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>méthylcellulose</td><td>Compresseur d’air Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&nbsp ;</td><td>Parker Instruments&nbsp ;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur compact à 3 axes&nbsp ;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>pointes de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps&nbsp ;</td>Micromètre d’étage <td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

L&#39;embryon de poisson zèbre offre un modèle souple pour étudier l&#39;organogenèse et modéliser les maladies génétiques humaines. Malgré sa simplicité relative, le rein et le poisson zèbre développe fonctions dans presque la même manière que les humains. Une différence importante dans la construction du rein humain est la présence de millions de néphrons par rapport au poisson-zèbre ne possède que deux. Cependant, la simplification d&#39;un système aussi complexe en unités fonctionnelles de base a aidé notre compréhension de la façon dont le rein développe et exploite. Chez le poisson zèbre, la ligne médiane située glomérule est responsable de la filtration du sang initial en deux tubules pronephrique qui divergent afin de fonctionner bilatéralement long de l&#39;axe embryonnaire avant de fusionner les uns aux autres au cloaque. Les tubules pronephrique sont fortement peuplées par des cils mobiles qui facilitent le mouvement de filtrat le long du tubule segmenté, permettant l&#39;échange de différents solutés avant de finalement sortir via le cloaque 2-4. De nombreux gènes responsables de la maladie rénale chronique, incLUDING ceux liés à ciliogenèse, ont été étudiés chez le poisson zèbre 5. Cependant, une attraction majeure de retour a été la difficulté d&#39;évaluer la fonction rénale poisson zèbre après manipulation génétique. Essais traditionnels pour mesurer le dysfonctionnement du rein chez l&#39;homme ont prouvé non translationnelle poisson zèbre, principalement en raison de leur environnement aquatique et de petite taille. Par exemple, il ne est pas physiquement possible d&#39;extraire le sang de l&#39;embryon organisé poissons pour l&#39;analyse de l&#39;urée et de la créatinine contenu, car ils sont trop petits. En outre, le poisson zèbre ne produisent pas suffisamment d&#39;urine pour tester sur une simple protéinurie &#39;jauge&#39;, qui est souvent effectuée lors des examens initiaux des patients. Nous décrivons un dosage par fluorescence qui utilise la transparence optique du poisson zèbre pour contrôler quantitativement le dégagement d&#39;un colorant fluorescent, au fil du temps, du système vasculaire et en sortie par le rein, pour donner une lecture de la fonction rénale 1,6-9.

Syndrome de Bardet-Biedl (BBS) est une ciliopathie hétérogène rare qui affecte environ 1: 160 000 personnes dans le monde 16. Les patients présentent un certain nombre de problèmes liés notamment reins polykystiques, suite patients ont souvent besoin de dialyse rénale ou une transplantation 24. ESRF est la cause la plus fréquente de décès chez BBS, avec environ 30% des patients CKD en développement 16. Actuellement, 20 gènes non liés ont été impliqués dans BBS sans association génotype-p...

Le poisson zèbre est un outil populaire pour modéliser la maladie rénale chronique (CKD). Cependant, leur petite taille, il est impossible d&#39;évaluer la fonction rénale en utilisant des méthodes traditionnelles. Nous décrivons une fluorescente reins de colorant jeu dosage qui permet une analyse quantitative de la fonction rénale dans le poisson zèbre CKD.

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

L'objectif général de cette procédure est de générer un dosage quantitatif de la fonction rénale chez le poisson zèbre. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord les embryons de poisson zèbre à 72 HPF. Ensuite, les embryons sont transférés dans un moule d'injection et orientés de manière à ce que leurs cœurs se trouvent à gauche du champ de vision.Ensuite, la cavité péricardique est injectée avec un colorant fluorescent rumine dextra et des images fluorescentes de la région cardiaque sont obtenues à l’aide d’un microscope stéréoscopique à fluorescence épiscopique. Enfin, l’élimination rénale d’un colorant fluorescent est évaluée par microscopie à fluorescence épiscopique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une mesure quantitative de la fonction rénale du poisson zèbre sans nécessiter de tests sanguins ou urinaires, qui ne sont pas réalisables chez le poisson zèbre.Cette méthode fournit un outil puissant pour évaluer la fonction rénale chez les modèles de maladie chez le poisson zèbre. Après avoir préparé les aiguilles et fabriqué un moule selon le protocole décrit, coulez le moule en versant d'abord une solution d'aro à 2 % préparée dans de l'eau pour poiss

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons une technique de micro-injection de la famille des aminosides, la gentamicine, en 2 jours post-fetilization (DPF) des larves de poisson zèbre pour induire des lésions rénales aiguës (IRA). Nous décrivons également une méthode pour monter toute l'immunohistochimie, plastique enrobage et de sectionnement des larves de poisson zèbre pour visualiser les dégâts médiation AKI.

Microinjections intraveineuse de larves de poisson zèbre pour étudier lésions rénales aiguës

La transplantation de cellules est une technique essentielle pour l'étude de la régénération des tissus et pour le développement des thérapies cellulaires de la maladie. Nous démontrons ici une technique microchirurgicale qui permet la transplantation de cellules génétiquement marquées directement dans le rein de poisson zèbre adulte.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d'étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d'identifier et d'enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l'isolement cellulaire, la transplantation, et les...

Dissection du rein Zebrafish adultes

Dans cette vidéo, nous démontrons la dépigmentation du rein de poisson-zèbre adulte et sa préparation ultérieure pour les procédures de coloration. Après la coloration, le rein de poisson-zèbre adulte peut être utilisé pour étudier la régénération rénale, la caractérisation phénotypique de modèles de maladies rénales et la fonctionnalité du néphron.

Dépigmentation et précoloration du rein de poisson-zèbre : une technique pour préparer le rein de poisson-zèbre adulte à la coloration

Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l'évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d'évaluer la réabsorption rénale.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

Nous présentons ici une méthode fiable pour étudier la régénération rénale adulte en induisant une lésion rénale aiguë par injection de gentamicine. Nous montrons que les dommages dépendent de la dose de gentamicine et de la température ambiante en utilisant l’hybridation in situ pour marquer lhx1a+ en développant de nouveaux néphrons.

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

Le poisson zèbre est un excellent organisme expérimental pour étudier les processus de développement de vertébrés et modèle des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole sur la façon d'effectuer un écran chimique à haut débit manuel embryons de poisson zèbre avec un ensemble de montage hybridation in situ (WISH) lecture.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse du développement des organes dans des embryons de poisson zèbre en utilisant une fluorescence microscope de dissection capables d'effectuer le sectionnement optique et des stratégies simples de réadaptation pour corriger la dérive focale et plane.

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Ce travail présente un nouveau modèle in vivo de lésions rénales segmentaires utilisant du poisson zèbre transgénique GFP rénal. Le modèle permet l'induction de l'ablation ciblée des cellules épithéliales rénales pour montrer les mécanismes cellulaires des lésions et des réparations de néphron.

Approche précise de l&#39;ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

Ce protocole décrit les procédures pour induire des lésions rénales aiguës (AKI) chez le poisson zèbre adulte utilisant le cisplatine comme agent néphroxique. Nous avons détaillé les étapes pour évaluer la reproductibilité de la technique et deux techniques pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire dans le tissu rénal, la cytométrie d’écoulement et TUNEL, respectivement.

Modèle aigu de lésion rénale induit par le cisplatine chez le poisson zèbre adulte

Apprenez à évaluer la fonction rénale chez le poisson zèbre en utilisant une méthode d'immunofluorescence quantitative. Cette technique permet de mesurer le clairance rénal sans prélèvement sanguin ni urinaire.

Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

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