Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d'imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

L’objectif global de cette procédure est de permettre l’analyse en accéléré de divers processus de développement à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente avec des stratégies simples de réalignement après avoir dérivé dans n’importe quelle direction. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, car elle permet d’observer directement le développement des tissus et des organes dans les embryons vivants pendant plusieurs heures. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est une alternative abordable et facile à utiliser aux techniques plus complexes normalement utilisées pour l’enregistrement en différé des tissus et des organes en développement, telles que le balayage laser ou la microscopie éclairée.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les altérations spatiales et temporelles qui se produisent au cours du développement de l’embryon et des larves de poisson-balayeur, elle peut également être appliquée pour étudier les processus de développement précoces et d’autres organismes modèles. De plus, il convient d’observer des processus dynamiques chez les organismes adultes, tels que la cicatrisation et la régénération des racines. En préparation, identifier les poissons adultes hautement reproducteurs de la lignée d’expression transgénique de la GFP.

L’après-midi précédant la micro-injection de la plante, installez cinq couples mâle-femelle de poissons reproducteurs dans cinq conteneurs de reproduction. Dans les récipients, gardez le mâle et la femelle séparés par un tamis amovible pendant la nuit. Le lendemain matin, juste après l’allumage des lumières, placez un mâle et une femelle ensemble au-dessus du tamis, ce qui les empêchera de manger leurs œufs.

Maintenant, observez les poissons pendant qu’ils frayent. Une fois que le couple produit environ 50 œufs, séparez-les. Ensuite, transférez les ovules à l’aide d’une pipette Pasteur dans une boîte de Pétrie remplie d’eau d’embryon pour une première injection.

Répétez ce processus pour chaque paire accouplée. Si des œufs supplémentaires sont nécessaires, les mêmes couples d’accouplement peuvent être réunis et séparés plusieurs fois. Pour la micro-injection, la préparation avancée des plats et des aiguilles d’injection se fait de manière assez standard.

Les détails se trouvent dans le protocole texte. Commencez par charger une aiguille d’injection préparée. À l’aide d’une pointe de micro-chargeur, remplissez l’aiguille avec deux microlitres de solution de travail MO, puis fixez l’aiguille dans un micro-manipulateur.

Ensuite, la pointe de l’aiguille peut être ouverte. Lorsque vous l’observez avec le microscope de dissection, utilisez une pince à épiler pour ouvrir l’extrémité ou poussez la pointe contre une surface rigide. Ensuite, calibrez le volume d’injection en injectant la solution de MO dans une goutte d’huile minérale sur un réticule.

Ajustez l’injection pour faire des gouttes de 75 microns qui correspondront à environ 200 picolitres de solution. Ensuite, préparez les embryons à injecter. Disposez les quelque 21 embryons au stade cellulaire le long de la rainure de la boîte de micro-injection avec le pôle végétal orienté vers l’approche de l’aiguille de micro-injection, qui est à un angle de 45 degrés par rapport à la rainure.

Maintenant, injectez les embryons. Avec l’aiguille, perforez le chorion et le jaune, puis injectez la solution chargée de Morpholino dans le jaune. Cela fonctionne pour les embryons au stade d’une ou deux cellules.

Après avoir injecté tous les embryons, utilisez un Pasteur de gros calibre pour les recueillir. Transférez les embryons injectés dans des boîtes de Pétri remplies d’eau embryonnaire et incuberez-les à 28,5 degrés Celsius. Plus tard dans l’après-midi, siphonnez les embryons morts et remplacez l’eau des embryons.

Le lendemain matin, après que les embryons aient subi une gastrulation, inhibez leur mélanisation en remplaçant leur eau par de l’eau embryonnaire contenant une quantité infime de PTU. Attention, le PTU va perturber le bon développement avant la gastrulation. Plus tard, au stade de développement souhaité, déchorionnez les embryons avec une pince à épiler pointue.

À l’aide du microscope, saisissez le chorion à l’aide d’une pince à épiler et essayez de saisir l’autre côté du chorion à l’aide d’une deuxième paire de pincettes. Ensuite, séparez soigneusement la pince à épiler sans perturber l’embryon. Ensuite, anesthésez les embryons avec de la tricaïne et procédez à l’intégration des embryons et de l’agarose sur une grille de relocalisation de 15 microns placée dans une micro-boîte à fond de verre.

Ensuite, chargez des aliquotes d’un millilitre d’agarose fondue dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre. Mettez les tubes dans des blocs chauffants réglés à 36 degrés Celsius et attendez qu’ils refroidissent. Ensuite, à l’aide d’une pipette de gros calibre, transférez un embryon dans la micro-boîte.

Siphonnez l’excès d’eau de l’embryon et recouvrez l’embryon d’agarose. Pendant que l’agarose est encore liquide, utilisez deux petites pointes de pipette pour orienter les embryons. Positionnez la structure d’intérêt, dans ce cas, les pronéphros, aussi près que possible du fond de verre, et à proximité immédiate de la grille.

La grille ne doit pas se superposer à la structure d’intérêt. Il est avantageux d’intégrer jusqu’à quatre embryons dans des micro-boîtes différentes, et de prévoir l’imagerie du meilleur. Une bonne intégration nécessite un peu de pratique.

Tant que l’agarose est encore liquide, l’embryon doit être orienté dans la position souhaitée. S’il s’agit d’un pronéphros proche du fond de verre, et à une distance appropriée de la grille de relocalisation. Vérifiez régulièrement l’agarose.

Une fois qu’il est assez difficile de tenir les embryons, laissez-le reposer pendant encore deux à trois minutes. Ensuite, superposez l’embryon incrusté avec de l’eau embryonnaire contenant des traces de PTU et de tricaïne. Décantez ou siphonnez l’excès d’eau de l’embryon et verrouillez le couvercle pour éviter l’évaporation.

Le résultat ne doit pas avoir de bulles d’air. L’embryon peut maintenant être imagé avec le fond de verre face à la lentille de l’objectif. En utilisant la préparation pour faire des images en lapse, par exemple, en prenant des images Z-stack périodiquement pendant plusieurs heures, il est nécessaire de corriger la dérive focale.

Si possible, appliquez une stratégie de mise au point automatique. Basculez l’option de mise au point automatique dans la commande logicielle. Pour le canal de référence, choisissez le canal de champ clair en lumière transmise afin de minimiser la phototoxicité.

Il est également essentiel de choisir une plage de recherche dépendante de l’échantillon suffisamment grande pour que l’autofocus fonctionne correctement. Avant de collecter les images, positionnez un point particulier de la grille imprimée à proximité de la structure d’intérêt dans le réticule du logiciel, puis enregistrez cette position à l’aide d’une capture d’écran. Ensuite, juste avant la fin de chaque intervalle de temps d’imagerie, référencez la capture d’écran et réajustez la position de la platine et la mise au point si la mise au point automatique n’est pas utilisée.

La méthode présentée a été utilisée pour analyser le développement rénal dans des embryons morphés WT1A d’une lignée de poisson zèbre transgénique. Au cours du néphrogène précoce, cette lignée a choisi la fluorescence verte dans le mésoderme intermédiaire où les progéniteurs rénaux apparaissent, et plus tard au cours du développement dans les tubules en formation et les primordia du néphron. L’imagerie en accéléré a révélé une néphrogenèse normale chez le témoin Morpholino injectant des embryons.

20 heures après la fécondation, les tubules pronéphriques en développement étaient visibles. À leurs extrémités antérieures, une accumulation sphérique de cellules représentant les néphrons primordiaux en formation a pu être détectée. Au cours des heures suivantes, les tubules et les néphrons primordia ont grandi, et les primodia ont commencé à fusionner sur la ligne médiane.

En revanche, la néphrogenèse a été sévèrement perturbée chez les mutants. Bien que des structures tubulaires positives à la GFP soient visibles 20 heures après la fécondation, elles étaient diffuses et sous-développées. L’imagerie en accéléré a montré que les néphrons primorgiques ne se sont jamais formés et qu’un nombre impressionnant de cellules fluorescentes situées à l’extérieur des pronéphrons en développement ont migré ventralement, quittant le champ pronéphrique.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de se rappeler que l’absence d’équipements supplémentaires, tels que le contrôle de la température ou les tables anti-évaporation, nécessite des contrôles réguliers des dérives et des réajustements. À la suite de cette procédure, les embryons d’image peuvent être traités pour effectuer d’autres méthodes, telles que l’immunohistochimie, l’incetrohypertisation ou la PCR en temps réel, afin d’identifier des composants spécifiques de cellules, de tissus ou d’évaluer l’expression génique.