Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d'imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

L'objectif général de cette procédure est de permettre l'analyse en laps de temps de divers processus de développement à l'aide d'un microscope stéréoscopique fluorescent, en utilisant des stratégies simples de réalignement après un déplacement dans n'importe quelle direction. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, car elle permet l'observation directe du développement des tissus et des organes chez des embryons vivants pendant plusieurs heures. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle constitue une alternative abordable et facile à utiliser par rapport aux techniques plus complexes habituellement employées pour l'enregistrement en laps de temps du développement des tissus et des organes, telles que la microscopie à balayage laser ou la microscopie à éclairage structuré.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les modifications spatiales et temporelles survenant au cours du développement de l'embryon et des larves de poisson balai, elle peut également être appliquée pour étudier les processus développementaux précoces et d'autres organismes modèles. En outre, elle convient à l'observation de processus dynamiques chez les organismes adultes, tels que la cicatrisation et la régénération des racines. En préparation, identifier les poissons adultes fortement reproducteurs provenant de la lignée transgénique exprimant la GFP.

Le soir précédant l'injection microscopique des plantules, installer cinq couples mâle-femelle de poissons reproducteurs dans cinq récipients d'accouplement. Dans les récipients, maintenir le mâle et la femelle séparés par un tamis amovible pendant la nuit. Le lendemain matin, juste après l'allumage des lumières, réunir le mâle et la femelle au-dessus du tamis, ce qui les empêchera de consommer leurs œufs.

Observe maintenant les poissons pendant qu'ils se reproduisent. Une fois que le couple a produit environ 50 œufs, séparez-les. Ensuite, transférez les œufs à l'aide d'une pipette Pasteur dans une boîte de Pétri remplie d'eau pour embryons afin de procéder à un premier cycle d'injection.

Répétez ce processus pour chaque couple accouplé. Si des œufs supplémentaires sont nécessaires, les mêmes couples d'accouplement peuvent être réunis et séparés plusieurs fois. Pour la micro-injection, la préparation avancée des boîtes et des aiguilles d'injection est réalisée de manière assez standard.

Les détails sont disponibles dans le protocole écrit. Commencez par charger une aiguille d'injection préparée. À l’aide d’une micropipette de chargement, remplissez l’aiguille par aspiration avec deux microlitres de solution working d’ARNO, puis fixez l’aiguille sur un micromanipulateur.

Ensuite, la pointe de l'aiguille peut être ouverte. En l'observant au microscope stéréoscopique, utilisez une pince pour pincer l'extrémité afin de l'ouvrir, ou poussez la pointe contre une surface rigide. Étalonner ensuite le volume d'injection en injectant la solution de MO dans une goutte d'huile minérale déposée sur une micrométrique.

Régler l'injection de manière à obtenir des gouttelettes de 75 microns, ce qui correspond à environ 200 picolitres de solution. Ensuite, préparer les embryons à injecter. Disposer les embryons d'environ 21 cellules le long de la rainure de la boîte de micro-injection, avec le pôle végétatif orienté vers l'approche de l'aiguille de micro-injection, qui se trouve à un angle de 45 degrés par rapport à la rainure.

Injectez maintenant les embryons. À l’aide de l’aiguille, percez la chorio-allantoïde et le vitellus, puis injectez la solution de Morpholino chargée dans le vitellus. Cette méthode fonctionne pour les embryons au stade d’une ou deux cellules.

Après avoir injecté tous les embryons, utilisez une pipette Pasteur à large orifice pour les récupérer. Transférez les embryons injectés dans des boîtes de Pétri remplies d'eau pour embryons, puis incubez-les à 28,5 degrés Celsius. Plus tard dans l'après-midi, aspirez les embryons morts et remplacez l'eau pour embryons.

Le lendemain matin, après que les embryons ont terminé la gastrulation, inhibez leur mélanisation en remplaçant leur eau par de l'eau pour embryons contenant une trace de PTU. Soyez prudent : le PTU perturbe le développement normal avant la gastrulation. Plus tard, au stade de développement souhaité, déchorionnez les embryons à l’aide de pinces fines.

À l’aide du microscope, saisissez le chorion avec une première paire de pinces et tentez de saisir l’autre côté du chorion avec une deuxième paire de pinces. Ensuite, écartez délicatement les pinces sans perturber l’embryon. Puis, anesthésiez les embryons avec de la tricaine, et procédez à l’encapsulation des embryons et de l’agarose sur une grille de relocalisation de 15 microns placée dans une micro-plaque à fond en verre couvre-objet.

Ensuite, prélevez des aliquotes de un millilitre d'agarose fondu et placez-les dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre. Placez les tubes dans des blocs chauffants réglés à 36 degrés Celsius et attendez qu'ils refroidissent. Puis, à l'aide d'une pipette à embout large, transférez un embryon dans la micro-boîte.

Aspirez l'excès d'eau des embryons et recouvrez les embryons d'agarose. Tandis que l'agarose est encore liquide, utilisez deux petites pointes de pipette pour orienter les embryons. Placez la structure d'intérêt, dans ce cas le pronephros, aussi près que possible du fond en verre et à proximité immédiate de la grille.

La grille ne doit pas recouvrir la structure d'intérêt. Il est avantageux d'incorporer jusqu'à quatre embryons dans des micro-béchers différents, puis de prévoir l'observation de celui qui sera le meilleur. Un bon encapsulage nécessite un peu d'entraînement.

Alors que l'agarose est encore liquide, l'embryon doit être orienté dans une position souhaitée. S'il s'agit d'un pronephros proche du fond en verre, et à une distance appropriée par rapport à la grille de repositionnement. Vérifiez régulièrement l'agarose.

Une fois que le milieu est suffisamment dur pour maintenir les embryons, laissez-le reposer encore deux à trois minutes. Ensuite, recouvrez l'embryon inclus de l'eau pour embryons contenant des traces de PTU et de tricaïne. Versez délicatement ou aspirez l'excès d'eau pour embryons et fixez le couvercle afin d'éviter l'évaporation.

Le résultat ne devrait présenter aucune bulle d'air. L'embryon peut désormais être observé avec le fond en verre tourné vers l'objectif. Lorsqu'on utilise ce montage pour réaliser des images en laps de temps, par exemple en acquérant périodiquement des séries d'images en Z sur plusieurs heures, il est nécessaire de corriger la dérive du point de focalisation.

Si possible, appliquez une stratégie de mise au point automatique. Activez l'option de mise au point automatique dans le contrôle logiciel. Pour le canal de référence, choisissez le canal de champ clair en lumière transmise afin de minimiser la phototoxicité.

Il est également essentiel de choisir une plage de recherche d'échantillon suffisamment grande pour que la mise au point automatique fonctionne correctement. Avant de capturer les images, positionnez un point particulier de la grille imprimée près de la structure d'intérêt au niveau du réticule du logiciel, puis enregistrez cette position à l'aide d'une capture d'écran. Ensuite, juste avant la fin de chaque intervalle d'acquisition, consultez la capture d'écran et réajustez la position de la platine et la mise au point si la mise au point automatique n'est pas utilisée.

La méthode présentée a été utilisée pour analyser le développement rénal chez des embryons de poisson-zèbre transgénique ayant subi un morpholino contre WT1A. Lors de la néphrogenèse précoce, cette lignée exprime une fluorescence verte dans le mésoderme intermédiaire, là où apparaissent les progéniteurs rénaux, puis ultérieurement au cours du développement dans les tubules en formation et les primordia de néphron. L'imagerie en temps réel a révélé une néphrogenèse normale chez les embryons contrôles injectés avec un morpholino contrôle.

À 20 heures post-fécondation, les tubules pronephrétiques en développement étaient visibles. À leurs extrémités antérieures, une accumulation sphérique de cellules représentant les primordia du néphron en formation pouvait être détectée. Au cours des heures suivantes, les tubules et les primordia du néphron ont grandi, et les primordia ont commencé à fusionner au niveau de la ligne médiane.

En revanche, la néphrogénèse était gravement perturbée chez les mutants. Bien que des structures tubulaires positives pour la GFP soient visibles 20 heures après la fécondation, elles étaient diffuses et peu développées. L'imagerie en temps réel a montré que les primordia de néphrons ne se formaient jamais, et qu'un nombre important de cellules fluorescentes situées à l'extérieur des pronephros en développement migraient de façon ventrale, quittant ainsi le territoire pronephrétique.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de garder à l'esprit que l'absence d'équipements supplémentaires, tels qu'un contrôle de température ou des tables anti-évaporation, nécessite des vérifications régulières des dérives et des réajustements. Après cette procédure, les embryons imagés peuvent être traités afin de réaliser d'autres méthodes, comme l'immunohistochimie, l'incetrohypertisation ou la PCR en temps réel, afin d'identifier des composants spécifiques des cellules ou des tissus, ou d'évaluer l'expression génique.