Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

L'objectif général de cette procédure est d'isoler rapidement des mitochondries pures et fonctionnelles au niveau de la respiration à partir de tissu de rat. Cela est réalisé en associant et en homogénéisant d'abord les échantillons de tissu. Les étapes suivantes consistent à mélanger la subin A à l'homogénat et à incuber sur glace.

Cela est suivi par la filtration de l'homogénat, le mélange avec de l'albumine sérique bovine (BSA) et une nouvelle filtration. Les étapes finales consistent à centrifuger le filtrat et à resuspendre les pastilles mitochondriales dans un tampon de respiration. En fin de compte, les résultats peuvent démontrer que les mitochondries isolées sont viables et capables de respirer grâce à une analyse de la respiration et à un dosage luminescent de l'ATP.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui indiquent des durées d'isolement mitochondrial allant de 60 à cent minutes, est qu'il est possible d'isoler des mitochondries viables et capables de respirer en moins de 30 minutes. Allison Mackay, une technicienne d'un laboratoire partenaire, démontrera le dosage de la luminescence de l'ATP juste avant le début. Dissoudre la subine A dans un millilitre de tampon d'homogénéisation et dissoudre également l'albumine sérique bovine (BSA) dans un millilitre de tampon d'homogénéisation.

Commencez maintenant par prélever deux échantillons de tissu frais à l’aide d’un punch de biopsie de six millimètres de diamètre, puis conservez-les dans un tube à centrifuger de 50 litres contenant du XPBS sur de la glace. Lorsque vous êtes prêt, transférez le tissu dans un tube de dissociation C contenant cinq millilitres de tampon d’homogénéisation glacé. Ensuite, homogénéisez le tissu en fixant le tube sur l’appareil de dissociation tissulaire et en sélectionnant le cycle préréglé d’isolement mitochondrial.

Lorsque l'opération est terminée, remettez le tube sur la glace et ajoutez 250 microlitres de sub à lyin dans une solution mère. Mélangez par retournement. Lorsque le mélange apparaît uniformément réparti, incubez l'homogénat sur la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, placez un filtre en maille de 40 microns sur un tube conique de centrifugeuse de 50 millilitres et placez ce tube dans la glace. Humidifiez le filtre avec du tampon d'homogénéisation et jetez le tampon dans un récipient pour déchets. Puis, une fois que tout est prêt, versez l'homogénat à travers le filtre pour obtenir le filtrat.

Ajoutez 250 microlitres de solution mère de BSA et mélangez par retournement. Toutefois, cette étape doit être omise pour l'analyse des protéines mitochondriales. Préparez maintenant deux autres.

Placer des tubes coniques de centrifugeuse de 50 millilitres sur de la glace, munis l'un d'un filtre de 40 microns et l'autre d'un filtre de 10 microns. Humidifier les deux filtres avec un peu de tampon d'homogénéisation et jeter ce tampon. Verser ensuite l'homogénat d'abord à travers le filtre de 40 microns, puis à travers le filtre de 10 microns.

Ces étapes de filtration améliorent considérablement la pureté des mitochondries. Répartissez maintenant le filtrat entre deux tubes microcentrifugeurs prérefroidis de 1,5 millilitre et centrifugez-les à 9 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez puis combinez les deux culots mitochondriaux purifiés.

Dans un millilitre de tampon de respiration glacé, il est essentiel que l'ensemble de la procédure soit effectuée à quatre degrés Celsius. Les mitochondries purifiées peuvent désormais être analysées afin de déterminer l'activité métabolique des mitochondries isolées. Un dosage luminescent de l'ATP peut être réalisé à l'aide d'un kit de dosage de l'ATP.

Tout d'abord, porter les réactifs du kit à température ambiante. Ensuite, préparer la solution mère de HT P et la placer sur de la glace. L'étape suivante consiste à ajouter cinq millilitres de tampon de substrat à la solution de substrat lyophilisée.

Mélangez délicatement et placez à l’obscurité. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de respiration dans chaque puits d’une plaque de 96 puits opaque noire. Ajoutez 10 microlitres des mitochondries préparées dans les puits situés sous les étalons d’ATP.

Chaque échantillon mitochondrial unique doit être mis en place en triple, en plaçant trois puits contenant uniquement du tampon de respiration comme témoin négatif. Poursuivre en ajoutant 50 microlitres de solution de lyse de cellules de mammifères dans chaque puits une fois chargés. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un agitateur orbital à 120 tr/min.

Pendant l'incubation, préparez des dilutions de l'étalon d'ATP allant de un dixième de millimolaire à un dixième de micromolaire. Après l'incubation, ajoutez 10 microlitres de chacun des étalons d'ATP dans les puits correspondants indiqués sur la carte de la plaque. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution de substrat reconstituée à chacun.

Ensuite, incuber à nouveau la plaque, comme précédemment pendant cinq minutes. Procéder ensuite à l'examen des plaques au lecteur de plaques. Ouvrir le logiciel sous.

Créez un nouvel élément. Cliquez sur l'expérience. Ensuite, cliquez sur le protocole par défaut puis sur OK.

Dans la colonne de gauche, sélectionnez le protocole. Ensuite, la procédure, sélectionnez le délai et réglez-le sur 10 minutes. Puis validez l'entrée.

Sélectionnez maintenant luminescence dans le menu déroulant, puis lisez et choisissez cette option. Réglez les autres paramètres comme suit. Type de mesure : intégration en point final.

Une seconde. Réglez l'ensemble du filtre sur la position optique du trou d'émission, sensibilité maximale à 100, décalage vertical de la sonde supérieure à un millimètre. Après avoir effectué ces modifications de paramètres, cliquez sur OK.

Cliquez sur la disposition de la plaque et configurez-la en conséquence. Cliquez sur OK. Maintenant que tout est configuré, cliquez sur l'icône de lecture de la plaque située sur la rangée supérieure, puis cliquez sur lire.

Lorsque le spectrophotomètre s'ouvre, placez la plaque dans le plateau avec le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Une boîte affichant la température s'ouvrira alors ; cliquez sur OK, puis poursuivez avec l'analyse des données. Des échantillons de muscle squelettique pesant environ 0,18 gramme frais ont fourni environ 24 milliards de mitochondries, selon un comptage basé sur la taille des particules.

Des échantillons de foie de même taille ont donné quelques milliards de plus. Les mesures des mitochondries au cytomètre hématologique ont été sous-estimées à l’aide du compteur de particules. Un tracé représentatif a été obtenu, montrant que les mitochondries isolées sont regroupées sous un seul pic avec un diamètre moyen d’environ quatre dixièmes de micron.

Ceci est conforme aux rapports antérieurs utilisant le dosage biacide. La protéine mitochondriale a été mesurée à quelques milligrammes par gramme de tissu provenant du muscle squelettique et du foie. Le produit était viable et capable de respiration.

Mitochondries isolées dans un délai compatible avec une intervention thérapeutique clinique et chirurgicale. Des micrographies électroniques en transmission ont indiqué que les mitochondries isolées étaient toutes intactes, avec moins d'une mitochondrie endommagée sur 10 000, et une contamination inférieure à une sur cent mille selon le test de dosage de l'ATP. Les résultats ont révélé que les mitochondries étaient viables et que la teneur en ATP était d'environ 11 à 15 nanomoles par milligramme de protéine mitochondriale.

L'analyse de la respiration mitochondriale a été réalisée à l'aide d'une électrode de type Clark et a révélé que la consommation d'oxygène était d'environ 180 MLEs d'oxygène par minute par milligramme de protéine mitochondriale, les valeurs de RCI étant chacune d'environ 2,5 avec un score hépatique légèrement plus élevé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en moins de 30 minutes si elle est réalisée correctement.