Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est <30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler rapidement les mitochondries pures et aptes à la respiration du tissu du rat. Pour ce faire, on associe et homogénéise d’abord des échantillons de tissus. Les étapes suivantes consistent à mélanger le subin A dans l’homogénat et à l’incuber sur de la glace.

S’ensuit le filtrage de l’homogénat de mélange dans BSA et son filtrage à nouveau. Les dernières étapes consistent à faire tourner le filtrat et à remettre en suspension les culots mitochondriaux dans un tampon respiratoire. En fin de compte, les résultats peuvent montrer que les mitochondries isolées sont viables et aptes à la respiration grâce à l’analyse de la respiration et à un test de luminescence A TP.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes qui rapportent des temps d’isolement mitochondrial allant de 60 à cent minutes, est que les mitochondries viables et aptes à respirer peuvent être isolées en moins de 30 minutes. Allison mackay, technicienne d’un laboratoire collaborateur, fera la démonstration du test de luminescence A TP juste avant de commencer. Dissoudre la subine A dans un millilitre de tampon d’homogénéisation et dissoudre le BSA également dans un millilitre de tampon d’homogénéisation.

Commencez maintenant par prélever deux échantillons de tissus frais à l’aide d’un poinçon de biopsie de six millimètres, et stockez-les dans un XPBS sur de la glace dans un tube à centrifuger de 50 litres. Lorsque vous êtes prêt, transférez le tissu dans un tube de dissociation C contenant cinq millilitres de tampon d’homogénéisation glacé. Ensuite, homogénéisez le tissu en ajustant le tube à la dissociation tissulaire et en sélectionnant le cycle d’isolement mitochondrial prédéfini.

Une fois terminé, remettez le tube sur de la glace et ajoutez 250 microlitres de sous-marin à lyin dans une solution mère. Mélangez cela par inversion. Lorsque le mélange semble uniformément réparti, incubez l’homogénat sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, placez un filtre à mailles de 40 microns sur un tube à centrifuger conique de 50 millilitres et emballez-le dans la glace. Humidifiez le filtre avec un tampon d’homogénéisation et jetez le tampon dans un conteneur à déchets. Ensuite, une fois que tout est prêt, versez l’homogénat dans le filtrat.

Ajoutez 250 microlitres de solution mère BSA et mélangez-la par inversion. Cependant, cette étape doit être sautée pour l’analyse des protéines mitochondriales. Maintenant, préparez-en deux autres.

tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres sur glace s’adaptent l’un avec un filtre de 40 microns et l’autre avec un filtre de 10 microns. Mouillez les deux filtres avec un peu de tampon d’homogénéisation et jetez ce tampon. Versez ensuite l’homogénat d’abord à travers le filtre de 40 microns, puis à travers le filtre de 10 microns.

Ces étapes de filtration améliorent considérablement la pureté des mitochondries. Répartissez maintenant le filtrat entre deux micro-tubes de fuge de 1,5 millilitre pré-refroidis et centrifugez-les à 9 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le surnageant et remettez en suspension et combinez les deux granules mitochondriales purifiées.

Dans un millilitre de tampon de respiration glacé, il est essentiel que toute la procédure soit effectuée à quatre degrés Celsius. Les mitochondries purifiées peuvent maintenant être testées pour déterminer l’activité métabolique des mitochondries isolées. Un test de luminescence A TP peut être effectué à l’aide d’un kit de test A TP.

Tout d’abord, amenez les réactifs du kit à température ambiante. Ensuite, préparez la solution mère de HT P et placez-la sur de la glace. L’étape suivante consiste à ajouter cinq millilitres de tampon de substrat à la solution de substrat lyophilisé.

Mélangez doucement et placez dans l’obscurité. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon respiratoire à chaque puits d’une plaque de 96 puits noir opaque. Ajoutez 10 microlitres de mitochondries préparées dans des puits en dessous des normes A TP.

Chaque échantillon mitochondrial unique doit être plaqué dans une plaque en trois exemplaires de trois puits de tampon respiratoire seul comme contrôle négatif. Continuez en ajoutant 50 microlitres de solution de lyse cellulaire de mammifère à chaque puits une fois chargé. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un agitateur orbital à 120 tr/min.

Pendant l’incubation, préparez des dilutions de l’étalon A TP allant d’un 10e millimolaire à un 10e micromolaire. Après l’incubation, ajouter 10 microlitres de chacun des étalons A TP aux puits correspondants indiqués sur la carte des plaques. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution de substrat reconstituée à chacun.

Ensuite, incubez à nouveau l’assiette, comme précédemment, pendant cinq minutes. Procédez en examinant les plaques au niveau du lecteur de plaques. Ouvrez le logiciel sous.

Créez un nouvel élément. Cliquez sur expérimenter. Cliquez ensuite sur le protocole par défaut et cliquez sur OK.

Dans la colonne de gauche, sélectionnez Protocole. Ensuite, sélectionnez Délai et réglez-le sur 10 minutes. Alors d’accord, l’entrée.

Maintenant, sélectionnez, lisez et choisissez luminescence dans le menu déroulant. Ajustez les autres paramètres comme suit. Temps d’intégration du point de terminaison de type lecture.

Une seconde. Le filtre définit une position optique de trou d’émission, une sensibilité supérieure de 100, un décalage vertical de la sonde supérieure d’un millimètre. Après avoir effectué ces modifications de paramètres, cliquez sur OK.

Cliquez sur la disposition de la plaque et configurez-la en conséquence. Cliquez sur OK. Maintenant que tout est réglé, cliquez sur l’icône de la plaque de lecture sur la ligne supérieure et cliquez sur lire.

Lorsque le spectrophotomètre s’ouvre, placez la plaque dans le plateau avec le puits A dans le coin supérieur gauche. Maintenant, une boîte affichant la température s’ouvre, cliquez sur OK, puis procédez à l’analyse des données. Des échantillons de muscles squelettiques pesant environ 0,18 gramme d’humidité ont donné environ 24 milliards de mitochondries sur la base du comptage de la taille des particules.

Des échantillons de foie de la même taille ont donné quelques milliards de plus. Les lectures de l’hémocytomètre des mitochondries ont été sous-estimées à l’aide du compteur de particules. Un tracé représentatif a été obtenu, qui montre que les mitochondries isolées sont localisées sous un pic d’un diamètre moyen d’environ quatre dixièmes de micron.

Ceci est en accord avec les rapports précédents utilisant le dosage biacide. La protéine mitochondriale a été mesurée à quelques milligrammes par gramme de tissu du muscle squelettique et du foie. Le produit était viable et apte à respirer.

Mitochondries isolées dans un délai compatible pour une intervention thérapeutique clinique et chirurgicale. Les micrographies électroniques à transmission ont indiqué que les mitochondries isolées étaient toutes des dents électroniques avec des dommages de moins d’un sur 10 000, la contamination était de moins d’un sur cent mille Un test de TP. Les résultats ont révélé que les mitochondries étaient viables et que la teneur en TP était d’environ 11 ou 15 nanomoles par milligramme de protéine mitochondriale.

L’analyse de la respiration mitochondriale a été réalisée à l’aide d’une électrode de type Clark et a révélé que la consommation d’oxygène était d’environ 180 MLE d’oxygène par minute. Pour chaque milligramme de protéine mitochondriale tandis que les valeurs RCI étaient chacune d’environ 2,5 avec un score hépatique légèrement plus élevé Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 30 minutes si elle est correctement exécutée.