Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les mitochondries respiratoires à partir de cellules cultivées ou de tissus de souris, puis d’évaluer la force de leur potentiel membranaire comme mesure de l’état cellulaire. Pour les cellules cultivées, cela se fait d’abord par placage puis traitement des cellules. Ensuite, les cellules sont homogénéisées et l’homogénat est passé à travers une aiguille pour libérer davantage les mitochondries des cellules.

Pour les tissus de souris, le foie est excisé de la souris, puis homogénéisé sur de la glace avec les deux types de matériel de départ. La centrifugation différentielle est ensuite utilisée pour isoler les mitochondries du reste du contenu cellulaire. Une fois que les mitochondries sont soumises à un certain traitement, y compris l’ajout du colorant fluorescent sensible au potentiel membranaire, des mesures de fluorescence TMRE sont effectuées pour calculer l’intensité du potentiel membranaire.

En fin de compte, la fonction mitochondriale et les perturbations du potentiel de membrane mitochondriale peuvent être évaluées à l’aide d’un colorant fluorescent sensible au potentiel de membrane en conjonction avec un lecteur de plaque fluorescente Lorsqu’elle est traitée avec des mitochondries communes sur des coupleurs et des inhibiteurs, bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’apoptose induite par les cytokines et du dysfonctionnement des mitochondries dans un LS.It peut également être appliquée à tout autre système où la comparaison entre deux ou plusieurs échantillons différents de recherchés tels que en bonne santé ou maladie ou deux espèces différentes d’un animal avec des taux métaboliques différents. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme les étapes d’isolement des mitochondries sont difficiles à apprendre.

En effet, il y a beaucoup de nuances lors de l’exécution de la technique qui peuvent être négligées dans les sections de méthode traditionnelles. Commencer cette procédure avec la croissance de cellules rénales embryonnaires humaines comme décrit dans le protocole textuel 48 heures avant la plaque de traitement aux cytokines, 160 000 cellules dans une fiole T 1 75 pour obtenir une densité d’environ 70 % au moment du traitement. Ensuite, le sérum affamera les cellules 24 heures plus tard en aspirant le milieu et en le remplaçant par le même volume de milieu sans sérum.

Enfin, traitez les cellules affamées de sérum en ajoutant des cytokines solubilisées directement sur le milieu de culture cellulaire pour effectuer l’isolement des mitochondries. Aspirez d’abord le milieu et lavez les cellules d’adhérence deux fois avec 15 millilitres d’une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Chaque fois après le lavage, aspirez le tampon et raclez le ballon pour retirer les cellules adhérentes du fond.

Ajoutez ensuite 15 millilitres d’un XPBS dans chaque flacon, remuez et transférez dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres sur de la glace. Une fois le raclage terminé, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 700 fois G quatre degrés Celsius, à l’aide d’une centrifugeuse de table avec un rotor à godets oscillant après la centrifugation, l’aspiration des surnageants et la réanimation. Suspendez chaque pastille dans un millilitre de tampon d’isolement mitochondrial.

Ensuite, combinez les deux suspensions et transférez-les dans un petit récipient en verre pour l’homogénéisation au niveau des mitochondries remises en suspension et le tampon d’isolement mitochondrial au récipient en verre jusqu’à ce que la solution atteigne la première ligne Avec le pilon attaché à une perceuse, procédez à l’homogénéisation des cellules sur la glace à vitesse moyenne pendant trois passages. Il faut veiller à éliminer les bulles d’air lors de la mise en place du pilon dans la solution, à ne pas retirer le pilon au-dessus du liquide et à utiliser une vitesse constante avec des passages continus. Transférez la solution homogénéisée dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, aspirez la solution dans une seringue de trois millilitres à l’aide d’une aiguille de calibre 18, un dans un demi-pouce et expulsez-la dans le tube conique sur de la glace avec une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27. Prenez soin d’expulser la solution contre la paroi intérieure du tube pour utiliser cette force pour la rupture de la membrane cellulaire. Répétez les étapes de la seringue cinq fois au total, puis transférez la solution dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 600 fois G quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de table à l’aide d’un rotor à godets oscillant.

Les mitochondries sont dans le surnageant après ce premier spin à basse vitesse, tandis que certaines membranes et cellules intactes sont granulées, éliminent soigneusement le surnageant et le répartissent dans trois tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les trois tubes dans un rotor à angle fixe à 10 000 fois G quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Les mitochondries des cellules cultivées apparaissent de couleur blanchâtre.

Excisez le foie de chaque animal et placez-y un glacial, un XPBS sans calcium ni magnésium pour rincer le sang. Transférez le tissu hépatique dans un plat sur de la glace et coupez-le en petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir fraîche pendant une minute. Ensuite, ajoutez du tissu et le tampon approprié dans le vaisseau jusqu’à ce que le tampon atteigne la première ligne.

Procédez à l’homogénéisation du tissu sur glace avec le pilon à la main pendant cinq passages. Il faut veiller à éliminer les bulles d’air lors de la mise en place du pilon dans la solution, à ne pas retirer le pilon au-dessus du liquide et à utiliser une vitesse constante avec des passages continus. Continuer à traiter les échantillons par centrifugation et homogénéisation comme demandé dans le protocole de texte.

Après avoir combiné les nouveaux surnageants avec le premier surnageant de chaque échantillon, centrifugez les tubes dans un rotor à angle fixe à 10 000 fois G quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez soigneusement la couche supérieure blanche duveteuse à l’aide d’une pointe de pipette et/ou en la poussant sur les côtés du tube. Versez ensuite doucement le reste du surnageant et du réusateur.

Suspendre les granules de mitochondries hépatiques dans 500 microlitres d’isolement mitochondrial. Les mitochondries tampons du foie sont brunes. Placez rapidement les échantillons sur de la glace immédiatement avant que les réactions ne se mettent en place.

Diluez les mitochondries à 0,5 milligramme par millilitre. Concentration de travail avec tampon expérimental. Ajoutez les traitements appropriés, comme indiqué dans le protocole de texte, pour séparer les tubes à un centième, le volume total des mitochondries diluées.

Ensuite, placez les mitochondries diluées dans chaque tube de réaction et agitez doucement chaque tube pour assurer un bon mélange. Incuber les réactions sur la paillasse pendant sept minutes. Ajoutez ensuite un volume égal de deux tétraéthyles micromolaires, domine de bâtonnet, ester éthylique, TMRE abrégé au volume de réaction mitochondriale.

Encore une fois, en agitant doucement chaque tube pour assurer un bon mélange. Après avoir incubé les réactions sur la paillasse pendant sept minutes supplémentaires, granulez les mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 fois G quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez ensuite la moitié du volume surnageant de chaque échantillon sur un 3 84.

Procédez à la lecture de la fluorescence des échantillons, puis calculez la différence de pli de fluorescence entre le contrôle et chaque traitement, comme décrit dans le protocole de texte, le traitement des cellules T HEK 2 93 avec TNF alpha, IL, un bêta et IFN gamma pendant 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de mort cellulaire. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’essais MTT qui démontrent systématiquement qu’il y a une diminution d’environ 10 % de la viabilité cellulaire avec un traitement de 24 heures et une diminution d’environ 20 %. Avec un traitement de 48 heures, les cellules traitées avec des concentrations similaires donnent des résultats de mort cellulaire similaires à 48 heures.

Et le traitement avec des cytokines individuelles révèle que la diminution de la viabilité est due à des effets combinatoires. Les données de viabilité représentent l’écart-type moyen de trois expériences distinctes. Chaque exécution en trois exemplaires et l’étanchéité des barres d’erreur démontrent la reproductibilité des données.

Le pourcentage de diminution du potentiel membranaire dans les mitochondries isolées à partir de cellules traitées aux cytokines signifie que la santé mitochondriale a été affectée par les traitements aux cytokines, corroborant les données de viabilité après cette procédure. D’autres méthodes, telles que l’évaluation d’une production totale de TP, d’un TP ou d’une consommation d’oxygène, peuvent être formées afin d’évaluer des questions supplémentaires telles que les différences d’énergie et de respiration entre les différents échantillons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des mitochondries fonctionnelles intactes et d’évaluer la force de leur potentiel membranaire en tant que reflet de l’état cellulaire.