Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

L’objectif global de cette procédure est de délivrer divers types de molécules biologiquement significatives de manière séquentielle et contrôlable en fonction du dosage avec une efficacité élevée à l’aide du poreur microfluidique assisté par vortex, ceci est accompli en préparant d’abord quatre tubes de centrifugeuse de 50 millilitres contenant individuellement des solutions DPBS avec des cellules et des biomolécules, et en fixant chaque tube à son porte-flacon respectif connecté au système de contrôle de flux pneumatique. La deuxième étape consiste à insérer les tubes d’entrée de chaque flacon respectif dans le dispositif microfluidique avec les électrodes à 15 broches intégrées. Ensuite, les cellules sont acheminées dans l’appareil où elles sont piégées dans des tourbillons à l’échelle microscopique formés dans les chambres d’électroporation.

La dernière étape consiste à appliquer de courtes impulsions électriques aux cellules piégées, rapidement suivies de l’injection des solutions contenant les biomolécules à délivrer dans le cytosol. En fin de compte, les cellules obtenues à partir de ce processus peuvent être libérées et collectées pour une analyse en aval. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la technique proposée est capable de délivrer séquentiellement une quantité contrôlée de plusieurs molécules dans une population cellulaire identique présélectionnée avec une efficacité et une viabilité élevées.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’échange de fluide sont difficiles à apprendre en raison du moment de l’étape d’écoulement froid à chaque solution. L’étape de commutation détermine la stabilité du piégeage des cellules. Une lignée cellulaire métastatique de cancer du sein M-D-A-M-B 2 31 sera utilisée dans cette plaque d’expérience une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans un volume de 10 millilitres par T 75 Fiole de culture tissulaire dans le milieu L 15 de Leibovitz complétée par 10 % de volume par volume, de sérum de veau fœtal et de 1 % de pénicilline.

La streptomycine incube les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec un environnement à 0 % de dioxyde de carbone. Deux jours après l’ensemencement, récoltez les cellules pour les expériences. Après avoir lavé les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate de bukos ou du DPBS, traitez les cellules avec 0,25 % de tripsdans de l’EDTA pendant deux minutes.

Ajoutez huit millilitres de milieu de croissance pour inactiver l’activité enzymatique des cellules en pastilles par centrifusion pendant cinq minutes à 200 fois G et un milieu remis en suspension à une concentration finale de cinq fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. La conception et la fabrication du dispositif d’électroporation microfluidique ne seront pas présentées dans cette vidéo, mais sont décrites dans le manuscrit qui l’accompagne. Le système se compose d’entrées pour les cellules, les molécules et une solution de rinçage.

Deux canaux droits où se produit la focalisation inertielle. 10 chambres d’électroporation avec électrodes et une sortie pour mettre en place les expériences d’écoulement. Insérez une prise, un tube de polyéther, d’éther cétone ou de pointe, ainsi que l’électrode en aluminium à 15 broches pour une application à impulsion courte et haute tension aux endroits désignés via les trous du microcanal.

L’électrode à 15 broches se compose de 10 électrodes positives et de cinq électrodes négatives. Chaque électrode positive est espacée de 1,5 millimètre d’une électrode négative, et chaque électrode de même polarité est espacée de 1,35 millimètre. Connectez l’équipement électrique pour générer des impulsions à ondes carrées courtes à haute tension aux électrodes en aluminium qui sont en contact avec les solutions en écoulement.

Dans le moule PDMS, l’équipement doit être composé d’un générateur d’impulsions et d’un amplificateur haute tension construit en interne. Préparez quatre tubes à centrifuger de 50 millilitres contenant individuellement du DPBS et des solutions contenant des cellules et des molécules. Fixez chaque tube à son porte-flacon respectif connecté au système de contrôle de débit pneumatique.

Connectez le tube de pic d’entrée des porte-flacons dans les trous d’entrée respectifs du dispositif microfluidique. Ensuite, réglez. L’amplitude de l’onde carrée pulse les volts à 100 volts.

Pour que l’intensité du champ électrique à travers la chambre d’électroporation soit équivalente à 0,7 kilovolts par centimètre. Réglez le régulateur de pression sur 40 PSIA Une seule source d’azote réglable manuellement est utilisée pour pressuriser uniformément tous les flacons d’échantillons et utilise un collecteur à grande vitesse pour activer en temps opportun les orifices de solution individuels. Utilisation du logiciel de vue de laboratoire personnalisé pour le contrôle des vannes.

Ouvrez le logiciel de vue laboratoire intitulé Valve Runner et cliquez sur Exécuter dans le menu déroulant intitulé Fonctionner. Cliquez sur l’icône de la vanne correspondante pour ouvrir la vanne du réservoir DPBS afin d’amorcer la vitesse d’écoulement requise pour la génération stable de vortex de piégeage de cellules pendant 1,5 minute. L’icône de la vanne doit passer du gris au vert lorsqu’elle est activée : le flux, le lavage et les solutions cellulaires traversent simultanément l’appareil pendant 10 secondes avant l’étape de piégeage des cellules.

Pour garantir un flux ininterrompu pendant l’étape de changement de solution, cette brève étape de co-flux doit être répétée à chaque étape de changement de solution. Basculez l’orifice de solution active de la solution de lavage à la solution de cellule pour piéger les cellules dans la chambre d’électroporation pendant 30 secondes. Dans ce film, les signaux fluorescents bleus représentent des crochets viables.

Cellules à 3, 3, 3, 4, 5 étages. Allumez l’orifice de lavage et rincez l’appareil pendant 20 secondes. Afin d’éliminer les cellules contaminantes non piégées, la solution contenant la première molécule d’intérêt s’écoule.

Iodure de propidium dans l’appareil à des fins de visualisation. Dans cette démonstration, des colorants d’acide nucléique sont utilisés à la place des brins DExT marqués par fluorescence en raison du rapport bruit/signal supérieur des colorants, appliquer cinq impulsions courtes rapidement après l’injection de la solution moléculaire, surveiller l’amplitude et le nombre des impulsions électriques appliquées en temps réel à l’aide d’un oscilloscope, les signaux fluorescents des molécules peuvent être visualisés au microscope, Incuber les cellules pendant 100 secondes dans la solution moléculaire. Ensuite, la solution contenant la deuxième molécule, le colorant d’acide nucléique, fait le yo-yo dans l’appareil.

Dans cette démonstration, la deuxième molécule est administrée sans applications d’impulsions électriques supplémentaires. Ce film confirme que les cellules expriment maintenant les trois signaux fluorescents. Vert pour le yo-yo, un, rouge pour le propidium, l’iodure et bleu pour les hameçons.

3, 3, 3, 4, 5. Libérez les cellules dans une plaque de 96 puits pour une analyse en aval en abaissant la pression de fonctionnement en dessous de cinq PSI. Environ 100 microlitres de solution avec 100 cellules sont prélevés à chaque rejet.

La procédure d’électroporation doit être répétée au moins trois fois pour collecter suffisamment de cellules pour la centrifugeuse de cytométrie en flux. La plaque de 96 puits contenant des cellules traitées à 228 fois G pendant cinq minutes. À température ambiante, retirez le surnageant qui contient l’excès de molécules fluorescentes et remettez les cellules en suspension dans le DPBS.

Si des brins DExT marqués par fluorescence ont été délivrés, les cellules sont ensuite analysées pour l’absorption moléculaire. Efficacité par cytométrie en flux. La réussite de l’administration moléculaire a été déterminée qualitativement en surveillant les changements d’intensité de fluorescence des cellules orbitales électroporées en C deux, ce qui a confirmé que 90 % des cellules traitées absorbent les 70 000 Dalton, une molécule ionique de brin DExT.

L’efficacité de chaque molécule de dextran transférée, définie comme le rapport entre le nombre de cellules occupant avec succès la molécule d’intérêt et le nombre total de cellules traitées, ne variait pas de manière substantielle en fonction du poids moléculaire ou des charges électriques. Toutes les molécules de dextran testées ont été délivrées dans le cytosol avec une efficacité supérieure à 70 %Montré ici, nos profils représentatifs de cytométrie en flux pour les cellules qui n’ont pas été traitées par électroporation. Le seuil fluorescent indiquant une administration moléculaire réussie est défini à partir des données de sorte que les signaux des échantillons de contrôle se trouvent en dessous du seuil.

Ces données de cytométrie en flux représentatives pour les cellules électroporées séquentiellement affichent le graphique de cytométrie en flux à côté des images de stries fluorescentes, les cases vertes représentent les signaux des cellules absorbant 3000, le dextran neutre Dalton uniquement, et les cases rouges représentent les signaux des cellules. Absorption de 3000 Dalton, un brin ionique DExT, uniquement des signaux fluorescents de l’absorption des cellules, les deux molécules du brin DExT indiquées en jaune indiquent une efficacité de livraison de molécules doubles de 56 % Après son développement. Cette technique sera utile aux chercheurs dans le domaine de la médecine, de la biotechnologie et de la pharmacologie pour explorer la combinaison de réactifs thérapeutiques afin d’obtenir des effets synergiques dans le traitement de maladies complexes.

N’oubliez pas que travailler avec des impulsions électriques à haute tension peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que s’assurer que vous êtes mis à la terre doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.