Electroporateur pour livraison séquentielle moléculaire microscopique assistée Vortex-

L'objectif général de cette procédure est d'acheminer divers types de molécules biologiquement significatives de manière séquentielle et avec un dosage contrôlable, et ce avec une haute efficacité, à l'aide du poreur microfluidique assisté par vortex. Cela est réalisé en préparant tout d'abord quatre tubes centrifugeurs de 50 millilitres contenant individuellement des solutions DPBS avec des cellules et des biomolécules, puis en raccordant chaque tube à son support de flacon respectif relié au système de contrôle pneumatique du débit. La deuxième étape consiste à insérer les tubulures d'entrée provenant de chaque flacon respectif dans le dispositif microfluidique doté de 15 électrodes intégrées. Ensuite, les cellules sont acheminées dans le dispositif où elles sont piégées dans des vortex à l'échelle microscopique formés dans les chambres d'électroporation.

La dernière étape consiste à appliquer rapidement des impulsions électriques brèves aux cellules piégées, suivie de l'injection des solutions contenant les biomolécules à délivrer dans le cytosol. En fin de compte, les cellules obtenues par ce procédé peuvent être libérées et collectées pour des analyses ultérieures. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à délivrer de façon séquentielle des quantités contrôlées de multiples molécules dans une population cellulaire identique pré-sélectionnée, avec une efficacité et une viabilité élevées.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'échange de fluide sont difficiles à apprendre en raison du moment précis de l'écoulement froid à chaque solution. L'étape de commutation détermine la stabilité du piégeage des cellules. Une lignée cellulaire de cancer du sein métastatique M-D-A-M-B 231 sera utilisée dans cette expérience : une fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre, dans un volume de 10 millilitres par flacon de culture tissulaire T 75, en milieu Leibovitz L 15 complété avec 10 % volume par volume de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline.

Incuber les cellules en présence de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius dans un environnement à 0 % de dioxyde de carbone. Deux jours après l'ensemencement, récolter les cellules pour les expériences. Après lavage des cellules avec du tampon phosphate salin au borate ou du DPBS, traiter les cellules avec une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant deux minutes.

Ajoutez huit millilitres de milieu de croissance pour inactiver l'activité enzymatique, puis centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 200 ×g et resuspendez-les dans le milieu à une concentration finale de 5 × 10⁵ cellules par millilitre. La conception et la fabrication du dispositif microfluidique d'électroporation ne seront pas montrées dans cette vidéo, mais sont décrites dans le manuscrit accompagnant. Le système comprend des entrées pour les cellules, les molécules et une solution de lavage.

Deux canaux rectilignes où a lieu la focalisation inertielle. Dix chambres d'électroporation munies d'électrodes et d'une sortie permettant la mise en place d'expériences d'écoulement. Insérez une tubulure de sortie, en polyéther, éther cétone (ou « peak »), ainsi que l'électrode en aluminium de 15 broches pour l'application de courtes impulsions à haute tension dans les emplacements prévus à cet effet, par les trous dans le microcanal.

L'électrode à 15 broches se compose de 10 électrodes positives et de cinq électrodes négatives. Chaque électrode positive est espacée de 1,5 millimètre d'une électrode négative, et chaque électrode de même polarité est espacée de 1,35 millimètre. Reliez l'appareil électrique destiné à générer des impulsions carrées brèves à haute tension aux électrodes en aluminium qui sont en contact avec les solutions en écoulement.

Dans le moule en PDMS, l'équipement doit comprendre un générateur d'impulsions et un amplificateur haute tension conçu en interne. Préparer quatre tubes centrifugeurs de 50 millilitres contenant individuellement du DPBS et des solutions avec des cellules et des molécules. Relier chaque tube à son support à flacons respectif raccordé au système de commande pneumatique d'écoulement.

Connectez le tube de raccordement d'entrée des supports de vial aux orifices d'entrée respectifs du dispositif microfluidique. Ensuite, réglez. L'amplitude des impulsions en onde carrée en volts sur 100 volts.

Afin que la force du champ électrique à travers la chambre d'électroporation soit équivalente à 0,7 kilovolt par centimètre, régler le régulateur de pression à 40 PSIA. Une source d'azote unique, réglable manuellement, est utilisée pour pressuriser uniformément tous les flacons d'échantillons et exploite un collecteur à haute vitesse afin d'activer opportunément les ports de solution individuels. Utiliser le logiciel personnalisé LabVIEW pour le contrôle des vannes.

Ouvrez le logiciel de visualisation du laboratoire intitulé « valve runner » et cliquez sur « Exécuter » dans le menu déroulant appelé « Opérer ». Cliquez sur l'icône de vanne correspondante, vanne un, pour ouvrir la vanne du réservoir de DPBS afin d'amorcer le débit nécessaire à la génération stable d'un vortex de piégeage cellulaire pendant 1,5 minute. L'icône de la vanne doit passer du gris au vert lorsqu'elle est activée, permettant l'écoulement simultané des solutions de lavage et cellulaire à travers le dispositif pendant 10 secondes avant l'étape de piégeage cellulaire.

Pour garantir un écoulement ininterrompu pendant l'étape de changement de solution, cette brève étape de flux conjoint doit être répétée à chaque changement de solution. Basculez le port de solution actif de la solution de lavage vers la solution contenant les cellules afin de piéger les cellules dans la chambre d'électroporation pendant 30 secondes. Dans ce film, les signaux fluorescents bleus représentent les crochets viables.

Cellules aux stades 3, 3, 3, 4, 5. Activer le port de lavage et rincer l'appareil pendant 20 secondes. Afin d'éliminer les cellules contaminantes non piégées, faire circuler la solution contenant la première molécule d'intérêt.

Propidium iodide dans le dispositif à des fins de visualisation. Dans cette démonstration, des colorants d'acides nucléiques sont utilisés à la place de brins DExT marqués de façon fluorescente en raison du rapport signal sur bruit supérieur des colorants. Appliquez cinq impulsions courtes immédiatement après l'injection de la solution moléculaire, surveillez en temps réel l'amplitude et le nombre des impulsions électriques appliquées à l'aide d'un oscilloscope ; les signaux fluorescents des molécules peuvent être visualisés au microscope. Incubez les cellules pendant 100 secondes dans la solution moléculaire. Ensuite, faites circuler la solution contenant la seconde molécule, le colorant d'acide nucléique yo-yo un, dans le dispositif.

Dans cette démonstration, la seconde molécule est délivrée sans application d'impulsions électriques supplémentaires. Ce film confirme que les cellules expriment désormais les trois signaux fluorescents : vert pour yo-yo, un, rouge pour l'iodure de propidium, et bleu pour hooks.

3, 3, 3, 4, 5. Relâcher les cellules dans une plaque de 96 puits pour une analyse en aval en abaissant la pression de fonctionnement en dessous de cinq PSI. Environ 100 microlitres de solution contenant 100 cellules sont recueillis à partir de chaque relâchement.

La procédure d'électroporation doit être répétée au moins trois fois afin de recueillir suffisamment de cellules pour la centrifugation en cytométrie en flux. La plaque de 96 puits contenant les cellules traitées à 228 fois G pendant cinq minutes. À température ambiante, éliminer le surnageant contenant les molécules fluorescentes en excès et resuspendre les cellules dans du DPBS.

Si des brins DExT marqués de manière fluorescente ont été délivrés, les cellules sont ensuite analysées pour leur absorption moléculaire. Efficacité évaluée par cytométrie en flux. Le succès du transfert moléculaire a été déterminé qualitativement en surveillant les variations de l'intensité de fluorescence des cellules en orbite électroporées dans C deux, ce qui a confirmé que 90 % des cellules traitées absorbent la molécule de brin DExT anionique de 70 000 Dalton.

L'efficacité pour chaque molécule de dextran transférée, définie comme le rapport entre le nombre de cellules ayant intégré avec succès la molécule d'intérêt et le nombre total de cellules traitées, ne variait pas de manière significative selon le poids moléculaire ou les charges électriques. Toutes les molécules de dextran testées ont été délivrées dans le cytosol avec une efficacité supérieure à 70 %. Représentés ici, nos profils typiques de cytométrie en flux pour des cellules qui n'ont pas été traitées par électroporation. Le seuil de fluorescence indiquant un délivrance moléculaire réussi est établi à partir des données de sorte que les signaux des échantillons témoins se situent en dessous de ce seuil.

Ces données représentatives de cytométrie en flux pour des cellules électroporées de manière séquentielle affichent le tracé de cytométrie en flux à côté des images de traînées fluorescentes. Les carrés verts représentent les signaux provenant de cellules ayant internalisé uniquement du dextran neutre de 3000 Dalton, tandis que les carrés rouges représentent les signaux provenant de cellules ayant internalisé uniquement une chaîne DExT ionique de 3000 Dalton. Les signaux fluorescents provenant de cellules ayant internalisé les deux molécules de DExT, indiqués en jaune, montrent une efficacité de livraison de molécules doubles de 56 %. Après son développement, cette technique s'avérera utile aux chercheurs dans les domaines de la médecine, de la biotechnologie et de la pharmacologie pour explorer des combinaisons de réactifs thérapeutiques afin d'obtenir des effets synergiques dans le traitement de maladies complexes.

N'oubliez pas que le travail avec des impulsions électriques à haute tension peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que de s'assurer que vous êtes mis à la terre doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.