Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’hybridation génomique comparative afin d’identifier les déséquilibres dans le génome qui peuvent conduire à une grande variété de maladies génétiques. Pour ce faire, l’ADN du patient est d’abord marqué à l’aide d’un colorant fluorescent. Dans la deuxième étape, le patient, l’ADN et un ADN de référence étiqueté différemment, sont hybridés à la puce.

Ensuite, le réseau est scanné pour mesurer la quantité de DN de référence du patient et de référence abondante dans chaque sonde. Dans la dernière étape, l’image numérisée est traitée pour identifier les régions du génome où l’ADN du patient a plus ou moins de matériel que l’ADN de référence finalement. L’hybridation génomique comparative est utilisée pour déterminer si le patient est porteur d’une variante du nombre de copies qui entraîne un syndrome génétique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’assemblage de la lame de réseau peut être difficile et il est facile pour l’hybridation. Mélangez le déversement hors de la chambre avant de commencer la réaction d’étiquetage. Décongelez la plaque de nucléotides et d’amorces prête à l’emploi à 96 puits à quatre degrés Celsius et à l’abri de la lumière pendant environ une heure.

Une fois décongelé, équilibrez la plaque recouverte pendant encore 30 minutes à température ambiante, équilibrez les échantillons d’ADN pendant 15 minutes à 60 degrés Celsius à ce moment-là également. Pendant que les échantillons se réchauffent, utilisez un robot de manipulation de liquides pour distribuer suffisamment d’eau sans nucléases dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits. Ensuite, lorsque l’ADN est prêt, transférez un microgramme d’échantillon par puits dans la plaque d’eau de 96 puits.

Transférez maintenant 20 microlitres de nucléotides et d’amorces d’équilibrage dans chacune des plaques contenant les échantillons d’ADN dilués et scellez la plaque avec des capuchons de bandelettes en prenant soin de faire une fermeture étanche. Ensuite, dénaturez l’ADN à 99 degrés Celsius dans une machine PCR avec un couvercle chauffé après 10 minutes et mettez les amorces à genoux en refroidissant la plaque sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez le robot de manipulation de liquide pour ajouter 10 microlitres d’enzyme exo ADN polymérase à chaque échantillon.

Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette, puis scellez et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Le lendemain, terminez la réaction avec cinq microlitres de tampon d’arrêt par puits, puis retirez les nucléotides non incorporés. Transférez le contenu de chaque puits dans des tubes individuels de deux millilitres pré-étiquetés.

Chargez les échantillons et les colonnes de purification de l’ADN dans un robot de traitement des colonnes de rotation, ainsi que les tampons associés appropriés. Selon les instructions du fabricant, le robot de traitement de la colonne de spin liera l’ADN marqué à la membrane de silice avec 250 microlitres de tampon de liaison à l’ADN à haute teneur en sel par tube, après quoi les impuretés seront éliminées des membranes avec deux lavages de 500 microlitres de tampon de lavage chacun. Le robot ajoutera ensuite 15 microlitres de tampon de solution à faible teneur en sel aux membranes pour récupérer les échantillons d’ADN marqués purifiés dans des volumes d’environ 12 microlitres pour hybrider les échantillons.

Ensuite, préchauffez un four d’hybridation à 65 degrés Celsius et préchauffez les lames de support et les chambres d’hybridation. Pour préparer le mélange d’hybridation, combinez 1,1 microlitres de lit 1D NA, 4,95 microlitres de mélange de blocage fourni par le fabricant et 24,75 microlitres de tampon d’hybridation. Utilisez le robot de manipulation des liquides pour répartir ce mélange dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits, en prémouillant chaque pointe pour améliorer la précision du transfert.

Pipette suivante 9,35 microlitres de la signature appropriée, trois d’ADN marqués, suivis de 9,35 microlitres de la signature appropriée, cinq d’ADN marqués. Pour bien sceller la plaque, quatre fois les échantillons pendant une minute et faire tourner rapidement la plaque pour recueillir le contenu au fond de chacune. Eh bien, dénaturer l’ADN marqué dans un incubateur de pré-hybridation.

D’abord pendant trois minutes à 95 degrés Celsius, puis 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ils travaillent sur une plate-forme chauffée à 42 degrés Celsius. Placez la glissière de support dans la chambre d’hybridation, en vous assurant que la partie transparente du joint s’aligne avec la partie vitrée de la chambre d’hybridation à l’aide d’embouts pré-humides.

Maintenant, pipetez lentement 42 microlitres du mélange d’hybridation au centre de la position appropriée de la lame de support du réseau. Veiller à ce que le liquide ne touche pas la limite de l’anneau en caoutchouc. Une fois que toutes les positions sont remplies, abaissez soigneusement la glissière du réseau sur la glissière de support et assemblez la chambre d’hybridation.

En veillant à ce que le côté du réseau avec l’écriture fasse face à la glissière de support, puis serrez complètement la vis de la chambre d’hybridation et inspectez la chambre d’hybridation assemblée, en confirmant qu’il n’y a pas de fuite d’hybridation. Mélangez à l’extérieur des limites de l’anneau en caoutchouc et que chaque bulle d’air mesure environ quatre millimètres de hauteur. Lorsque la chambre d’hybridation est posée sur son extrémité verticalement, faites pivoter la chambre d’hybridation pour vérifier cela.

Toutes les bulles d’air dans chaque position se déplacent. Si l’une des bulles est coincée, donnez une forte tape sur le banc de la chambre. Placez ensuite les chambres d’hybridation dans le four rotatif à 65 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, immergez les chambres d’hybridation dans le tampon de lavage un et utilisez une paire de pinces en plastique à bords plats pour séparer les lames. Ensuite, jetez les lames du joint et placez les glissières du réseau dans un rack et immergez-les dans un nouveau tampon. Lavez les lames du réseau dans environ 700 millilitres de tampon de lavage pendant une à cinq minutes, en remuant vigoureusement avec une puce et une étoile magnétique.

Transférez ensuite les lames du réseau dans environ 700 millilitres de tampon de lavage, deux pendant 90 secondes avec une agitation plus vigoureuse à la fin du deuxième lavage. Soulevez doucement les glissières de la matrice hors de la mémoire tampon. Ils devraient ressortir secs.

Chargez ensuite les lames de la matrice dans les supports de lames du scanner avec les protecteurs de lames, puis numérisez les échantillons. Selon les instructions du fabricant du réseau, chaque sonde d’un réseau hybride est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouges et verts. Les rapports entre le signal fluorescent rouge et vert pour chaque sonde sont quantifiés par le scanner et le logiciel associé les regroupe sous forme de rapports log deux en fonction de leur position génomique.

Les traces de tableau résultantes permettent l’interprétation des régions identifiées comme génomiquement déséquilibrées. Par exemple, dans cette trace d’un enfant atteint du syndrome de Williams, un syndrome de microdélétion récurrente médié par de faibles répétitions de copie dans la région proximale du chromosome sept, le déséquilibre génomique a été identifié par le logiciel avec une ligne rouge. Le rapport logarithmique fluorescent de l’hélice doit se regrouper étroitement autour de zéro, indiquant un rapport vert-rouge de un à un pour les régions normales du génome.

Les traces dispersées du réseau, telles qu’observées dans ce balayage, peuvent entraîner un appel inexact des régions anormales ou un échec à identifier le déséquilibre génomique et peuvent être causées par un certain nombre de facteurs, y compris une mauvaise qualité de l’ADN, ou la présence de rayons, des niveaux d’ozone dans la sphère atmosphérique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter les échantillons de patients pour les tests par A CGH et de produire des données de bonne qualité pour l’analyse en aval et la détection de la variation du nombre de copies.