Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'hybridation génomique comparative en matrice pour identifier les déséquilibres dans le génome pouvant entraîner une grande variété de maladies génétiques. Cela est réalisé en marquant d'abord l'ADN du patient avec un colorant fluorescent. Dans la deuxième étape, l'ADN du patient et un ADN de référence marqué différemment sont hybridés sur la matrice.

Ensuite, la matrice est analysée pour mesurer la quantité d'ADN du patient et de l'ADN de référence fixée sur chaque sonde. Dans la dernière étape, l'image numérisée est traitée afin d'identifier les régions du génome où l'ADN du patient présente plus ou moins de matériel que l'ADN de référence. L'hybridation génomique comparative est utilisée pour déterminer si le patient présente une variante du nombre de copies entraînant un syndrome génétique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'assemblage de la lame à puces peut s'avérer difficile et il est facile que l'hybridation provoque des débordements hors de la chambre avant le début de la réaction d'étiquetage. Décongeler la plaque de 96 puits prête à l'emploi contenant les nucléotides et les amorces à quatre degrés Celsius et à l'abri de la lumière pendant environ une heure.

Une fois décongelé, laisser l'équilibre de la plaque couverte pendant encore 30 minutes à température ambiante ; en même temps, équilibrer les échantillons d'ADN pendant 15 minutes à 60 degrés Celsius. Pendant que les échantillons se réchauffent, utiliser un robot de manipulation de liquides pour distribuer suffisamment d'eau exempte de nucléase dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits. Ensuite, lorsque l'ADN est prêt, transférer un microgramme d'échantillon par puits dans la plaque 96 puits contenant l'eau.

Transférez maintenant 20 microlitres des nucléotides et des amorces d'équilibre dans chacun des puits de la plaque contenant les échantillons d'ADN dilués, puis scellez la plaque avec des capuchons en bande en veillant à assurer un scellement étanche. Ensuite, dénaturez l'ADN à 99 degrés Celsius dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant pendant 10 minutes, puis faites refroidir brusquement la plaque sur de la glace pendant cinq minutes afin d'hybrider les amorces. Puis, utilisez le robot de manipulation des liquides pour ajouter 10 microlitres d'enzyme polymérase exo DNA « clean out » dans chaque échantillon.

Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette, puis scellez la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Le lendemain, arrêtez la réaction en ajoutant cinq microlitres de solution d’arrêt par puits. Ensuite, éliminez les nucléotides non incorporés. Transférez le contenu de chaque puits dans des tubes individuels pré-étiquetés de deux millilitres.

Chargez les échantillons et les colonnes de purification d'ADN sur colonne tournante dans un robot de traitement de colonnes tournantes, ainsi que les tampons associés appropriés. Conformément aux instructions du fabricant, le robot de traitement de colonnes tournantes lie l'ADN marqué à la membrane de silice à l'aide de 250 microlitres de tampon de liaison d'ADN à forte concentration saline par tube, après quoi les impuretés sont éliminées des membranes par deux lavages successifs de 500 microlitres de tampon de lavage chacun. Le robot ajoute ensuite 15 microlitres de tampon de faible salinité sur les membranes afin de récupérer les échantillons d'ADN marqué purifié en volumes approximatifs de 12 microlitres pour l'hybridation des échantillons.

Ensuite, préchauffer un four d'hybridation à 65 degrés Celsius et réchauffer préalablement les lames porte-objets et les chambres d'hybridation. Pour préparer le mélange d'hybridation, combiner 1,1 µL d'ADN cot 1D, 4,95 µL du mélange de blocage fourni par le fabricant et 24,75 µL de tampon d'hybridation. Utiliser le robot de manipulation des liquides pour distribuer ce mélange dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits, en humidifiant au préalable chaque pointe afin d'améliorer la précision du transfert.

Ensuite, pipeter 9,35 microlitres du réactif d'étiquetage approprié, ADN marqué trois, suivi de 9,35 microlitres du réactif d'étiquetage approprié, ADN marqué cinq. Sceller chaque puits de la plaque, fourex les échantillons pendant une minute, puis effectuer une brève centrifugation afin de rassembler le contenu au fond de chaque puits. Dénaturaliser l'ADN marqué dans un incubateur de pré-hybridation.

D'abord pendant trois minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, travaillez sur une plateforme chauffée à 42 degrés Celsius. Placez la lame porteuse dans la chambre d'hybridation, en veillant à ce que la partie transparente du joint s'aligne avec la partie fenêtrée de la chambre d'hybridation, en utilisant des pointes pré-humidifiées.

Prélève maintenant lentement 42 microlitres du mélange d'hybridation au centre de la position appropriée de la lame porteuse de la matrice, en veillant à ce que le liquide n'entre pas en contact avec la limite de l'anneau en caoutchouc. Une fois que toutes les positions sont remplies, abaisse délicatement la lame de la matrice sur la lame porteuse et assemble la chambre d'hybridation.

Veiller à ce que le côté du dispositif portant l'inscription soit orienté vers la lame de support, puis serrer complètement la vis de la chambre d'hybridation et examiner la chambre d'hybridation assemblée afin de confirmer qu'aucune fuite de l'hybridation ne se produit à l'extérieur des limites du joint en caoutchouc et que chaque bulle d'air mesure environ quatre millimètres de hauteur. Lorsque la chambre d'hybridation est posée verticalement sur une extrémité, la faire tourner pour vérifier ce point.

Toutes les bulles d'air à chaque position sont en mouvement. Si certaines bulles sont bloquées, donnez un coup sec sur la chambre en la tapant sur le banc. Ensuite, placez les chambres d'hybridation dans l'étuve rotative à 65 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, immergez les chambres d'hybridation dans le tampon de lavage un et utilisez une paire de pinces en plastique à extrémités plates pour séparer les lames. Ensuite, jetez les lames avec joints et placez les lames de puces dans un support immergé dans du tampon un frais. Lavez les lames de puces dans environ 700 millilitres de tampon de lavage pendant une à cinq minutes, en agitant vigoureusement à l’aide d’un agitateur magnétique et d’un barreau aimanté.

Transférez ensuite les lames porte-objets munies de puces vers environ 700 millilitres de tampon de lavage, deux fois pendant 90 secondes, avec un agitation plus vigoureuse à la fin du deuxième lavage. Retirez délicatement les lames porte-objets du tampon. Elles doivent émerger sèches.

Ensuite, charger les lames porte-échantillons dans les supports de lames du numériseur, avec les protections pour lames, puis numériser les échantillons. Selon les instructions du fabricant de la puce, chaque sonde sur une puce hybridée est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert. Les rapports entre le signal fluorescent rouge et vert pour chaque sonde sont quantifiés par le numériseur et le logiciel associé, puis représentés sous forme de rapports logarithmiques en base deux en fonction de leur position génomique.

Les profils obtenus permettent d'interpréter les régions identifiées comme étant génomiquement déséquilibrées. Par exemple, dans ce profil provenant d'un enfant atteint du syndrome de Williams, une microdélétion récurrente médiée par des répétitions de faible copie dans la région proximale du chromosome sept, le déséquilibre génomique a été identifié par le logiciel à l'aide d'une ligne rouge. Le logarithme du rapport fluorescent prop devrait s'agréger étroitement autour de zéro, indiquant un rapport vert sur rouge de un pour un dans les régions normales du génome.

Les traces en réseau dispersé observées lors de cet examen peuvent entraîner une détection inexacte des régions anormales, ou un échec à identifier le déséquilibre génomique, et peuvent être causées par plusieurs facteurs, notamment une mauvaise qualité de l'ADN ou la présence de rayons, ainsi que des niveaux d'ozone dans l'atmosphère. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les échantillons de patients pour un test par CGH sur puce et produire des données de bonne qualité destinées à l'analyse en aval et à la détection des variations du nombre de copies.