Name: Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Apprenez la technique d'hybridation génomique comparative sur puce pour détecter les variants du nombre de copies dans l'ADN patient. Cette méthode améliore le diagnostic des syndromes génétiques en laboratoire clinique.

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1. L&#39;étiquetage Réaction <ol><li> Avant d&#39;utiliser, dUTP pré-aliquote cyanine 3 et 5 nucléotides marqués, non marqués et des amorces aléatoires aux concentrations recommandées par le fabricant et magasin en plaques à 96 puits à -20 C prêt à l&#39;emploi. Pour les fins de ce protocole, aliquote 10,5 pi de la dUTP marqué de appropriée et 10,5 ul nucléotides non marqués et des amorces aléatoires à chaque puits. </li><li> Décongeler la plaque prête à l&#39;emploi de 96 puits de nucléotides et des amorces à 4 ° C pendant environ 1 heure, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Une fois décongelé, équilibrer cette plaque à température ambiante pendant au moins 30 min, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Equilibrer échantillons d&#39;ADN à 60 ° C pendant au moins 15 min. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un robot de manipulation liquide, distribuer de l&#39;eau sans nucléase à chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. NOTE: Le volume d&#39;eau dépendra de la concentration de chaque échantillon d&#39;ADN d&#39;entrée et doit être suffisante pour donner une concentration finale de 50 ng / ul. </li><li> Utilisation d&#39;un liquide hanmani- robot, pipette 1 ug d&#39;ADN dans un puits de la plaque à 96 puits (voir 1.5) pour porter le volume total à 20 ul. NOTE: quantités d&#39;ADN inférieures peuvent être utilisés même si la qualité des données qui en résulte peut être compromise (pour les échantillons précieux, les quantités d&#39;ADN d&#39;entrée vers le bas à 400 ng peuvent être utilisés). </li><li> En utilisant un robot de manipulation de liquide, transférer 20 pi de nucleotides et des amorces équilibrée dans chaque puits de la plaque de l&#39;ADN dilué. </li><li> Sceller la plaque 96 puits avec des bouchons de bande (un joint étanche est essentiel). </li><li> Dénaturer l&#39;ADN à 99 ° C pendant 10 min dans une machine PCR avec un couvercle chauffé et puis enclenchez refroidir sur glace pendant 5 min à des amorces de recuit. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un robot de manipulation de liquide, ajouter 10 pi de l&#39;ADN Klenow Exo enzyme polymérase ADN à chaque pipette et mélanger soigneusement. NOTE: Le volume total devrait être de 50 pi. </li><li> Sceller la plaque à 96 puits et incuber à 37 ° C pendant 16 heures. REMARQUE: Une incubation plus courte de 4 heures est suffisante cependant un O / N danscubation peut être plus pratique. </li><li> En utilisant un robot de manipulation de liquide, ajouter 5 ul de tampon d&#39;arrêt à chaque puits. REMARQUE: Un résumé des réactifs utilisés pour la réaction de marquage est indiqué dans le Tableau 1. </li></ol> 2. Suppression non constituées en nucléotides <ol><li> Retirer nucléotides non constituées en société en utilisant la silice-membrane à base de colonnes de spin et un robot de spin de traitement de la colonne dédiée (les colonnes de spin peuvent également être traitées manuellement). Suivez les instructions du fabricant. <ol><li> Transférer le contenu de chaque puits dans un tube de 2 ml; pré-label-ci avec ID et de. REMARQUE: Cette étape peut être réalisée manuellement ou de préférence en utilisant un robot de manipulation de liquide. </li><li> Si l&#39;on utilise un robot de traitement de colonne de centrifugation, puis charger le robot avec 2 ml des tubes, des colonnes de centrifugation de purification de l&#39;ADN et des tampons associés. </li><li> Ajouter 250 ul de haute teneur en sel, tampon de liaison (tampon PB) l&#39;ADN à la réaction de marquage pour lier l&#39;ADN marqué à la silicemembrane. </li><li> Éliminer les impuretés en lavant la membrane deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (tampon PE). </li><li> Ajouter 15 pi de tampon d&#39;élution faible de sel (tampon EB) à la membrane pour récupérer l&#39;ADN purifié, marqué dans un volume de ~ 12 ul. </li></ol></li></ol> 3. Mélanger Paires Hyb <ol><li> Combiner les paires appropriées de la cyanine 3 et 5 de l&#39;ADN marqué, COT-1 ADN, un mélange de blocage fourni par le fabricant et un tampon d&#39;hybridation fourni par le fabricant en utilisant un robot de manipulation de liquide. NOTE: Ces paires Hyb peut être un échantillon et une référence, ou un échantillon vs échantillon si CNV partagé ne sont pas un problème (par exemple, nous jumelons régulièrement des échantillons de phénotype correspondent pas, comme une dysplasie des patients rénale vs un patient de craniosténose, car ils sont très peu probable pour transporter le même cliniquement significative CNV). Si l&#39;on utilise un ADN de référence, une source d&#39;ADN du commerce est recommandée, et il doit être traité le long de l&#39;échantillon. <ol><li> Utilisation d&#39;une manipulation de liquides robot, ajouter COT-1 ADN (3333 ng / ul), le fabricant fournies blocage mélange et un tampon d&#39;hybridation à chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits de sorte que chaque puits contient 1,1 ul COT-1 ADN, 4,95 ul de mélange de blocage et 24,75 ul du tampon d&#39;hybridation. </li><li> Ajouter 9,35 ul de l&#39;ADN approprié cyanine 3-marqué dans chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage. </li><li> Ajouter 9,35 ul de l&#39;ADN approprié cyanine 5 marqué à chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage. </li><li> Sceller la plaque à 96 puits et vortex pendant 1 min. Faites tourner la plaque à 96 puits pour recueillir le contenu au fond de chaque puits. </li></ol></li></ol> 4. Hybridation <ol><li> Préchauffer un four à hybridation à 65 ° C et préchauffer une diapositive de support et une chambre d&#39;hybridation pour chaque diapositive de tableau. <ol><li> Dénaturer l&#39;ADN marqué à une pré-incubation avant l&#39;hybridation étant à appliquer sur les tableaux. Effectuer une hybridation dans un four rotatif pendant 24 heures. </li><li> Incuber la plaque à 96 puits à 70 ° C pendant 30 minutes, puis laisser à 37 ° C pendant au moins 5 min. </li><li> Travailler sur une plate-forme chauffée à 42 ° C, charger la sauvegarde chaque diapositive dans une chambre d&#39;hybridation avant de l&#39;utiliser. Assurez-vous que la partie transparente de la lame de joint se aligne avec la partie «fenêtré» de la chambre d&#39;hybridation. </li><li> Pipet 42 ul du mélange d&#39;hybridation préparé précédemment (voir section 3) sur la position appropriée sur le réseau sauvegarde diapositive. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage. Pipet lentement sur le centre de chaque position, assurant que le liquide ne touche pas la limite de l&#39;anneau en caoutchouc. </li><li> Une fois toutes les positions sur la lame de support sont remplis, abaissez délicatement la lame de tableau sur elle et assembler la chambre d&#39;hybridation. Assurez-vous que le côté du tableau avec écrit sur elle est confrontée à la diapositive de support. Veillez à serrer l&#39;hybridation vis de chambre entièrement. </li><li> Inspectez la chambre d&#39;hybridation assemblé. ENSure qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuite de mélange d&#39;hybridation à l&#39;extérieur des limites de la bague en caoutchouc et chaque bulle d&#39;air est d&#39;environ 4 mm de hauteur lorsque la chambre d&#39;hybridation est reposé sur son extrémité verticalement. Tournez la chambre d&#39;hybridation et vérifier qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air qui sont coincés en position et ne bouge pas. Se il ya toutes ces choses, donner la chambre forte d&#39;un robinet sur le banc. Vérifiez que toutes les bulles d&#39;air se déplacent. </li><li> Placer la chambre d&#39;hybridation dans le four rotatif à 65 ° C pendant 24 heures. Assurez-vous que le rotor four est équilibrée; utiliser d&#39;autres chambres vides si nécessaire. </li></ol></li></ol> 5. Lavage et diapositives Numérisation <ol><li> Laver tableaux pour éliminer l&#39;ADN marqué excès et puis analyser pour mesurer la fluorescence de chaque sonde. <ol><li> Prenez chambres d&#39;hybridation sortie du four et à démonter. Les diapositives de tableaux et joints seront collées; plonger ceux-ci dans une tampon de lavage et utiliser une paire de pinces en plastique, plat tranchant pour les forcer à part. </li><li> DiSCard la diapositive de joint et placer la lame de tableau dans un rack immergée dans un tampon 1. </li><li> Laver la glissière de tableau dans ~ 700 ml de tampon de lavage fraîche 1 pendant 5 min, en remuant vigoureusement (utiliser une puce et d&#39;un agitateur magnétique). </li><li> Transférer la lame de tableau à ~ 700 ml tampon de lavage 2 et laver pendant 90 secondes, en remuant vigoureusement. Soulevez doucement les diapositives de tableaux sur tampon de lavage 2, ils devraient émerger sec. </li><li> Charger la lame de matrice dans un porte-lame du dispositif de balayage, en utilisant un protecteur de lame. Chargez la diapositive dans le scanner de réseau et de numérisation en suivant les instructions du fabricant du tableau. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

CGH array ne détectera pas remaniements équilibrés ou des anomalies de ploïdie tels que la triploïdie. En outre, les déséquilibres mosaïque de bas niveau ne peuvent pas être détectés. Cependant, CGH array a une résolution plus élevée pour la détection CNV que l&#39;analyse des chromosomes bandes G laquelle il a remplacé dans de nombreux laboratoires de cytogénétique. Ce est donc la norme de référence actuelle pour la détection du génome entier CNV. Elle peut être remplacée par des technologies de séquençage de prochaine...

Il a été connu depuis de nombreuses années que les suppressions ou des copies supplémentaires de segments chromosomiques causent une déficience intellectuelle, une dysmorphie et des malformations congentical, et dans certains cas provoquer des syndromes génétiques 1. Cependant, la seule technologie disponible jusqu&#39;au milieu des années 2000 pour la détection du génome entier de ces changements était G-bandes analyse des chromosomes, qui a une résolution de l&#39;ordre 5-10Mb, selon la région et la nature du déséquilibre, et qui ne peut pas détecter chromosomes anormaux où la matière a été remplacé par une région d&#39;un chromosome différent avec le même motif de bandes. Techniques cytogénétiques auxiliaires tels que l&#39;hybridation fluorescente in situ et multiplex sonde amplification spécifique de ligature en ont été disponibles pour l&#39;interrogation des loci spécifiques, en cas de suspicion déséquilibre syndromique spécifique, mais ce ne est que l&#39;introduction d&#39;hybridation génomique comparative (CGH array) en s diagnostic clinique de routineervice 2-5 que la détection du génome entier du nombre de copies variantes (CNV) est devenu possible à une résolution considérablement augmenté (généralement autour de 120kb). Travaux de service clinique parallèlement à des études de recherche ont montré que CNV pour certaines régions sont très répandues dans la population normale 6-7, tandis que d&#39;autres CNV, auparavant indétectable, sont associés à neurodisabilities comme l&#39;autisme et l&#39;épilepsie 8-11. Le protocole décrit dans ce document est utilisé dans notre laboratoire de diagnostic clinique UK National Health Service (NHS); nous utilisons de nouvelles stratégies d&#39;hybridation, les tests par lots et de la robotique de minimiser les coûts de ce service financé par l&#39;Etat. Avant le protocole détaillé ci-dessous, l&#39;ADN de haute qualité doit être extraite de la matière de départ appropriée, habituellement du sang, des cellules cultivées ou des échantillons de tissus. Spectrophotométrie peut être utilisé pour mesurer la concentration (devrait être&gt; 50 ng / ul) et vérifier 260: 280 rapports d&#39;absorbance (b devraite 1,8 à 2,0). L&#39;électrophorèse sur gel peut être utilisée pour vérifier que l&#39;ADN soit de haut poids moléculaire sans dégradation significative. Ce protocole est conçu pour les laboratoires de débit plus élevés qui sont étiquetage 96 échantillons par exécution à l&#39;aide automatisés robotique de manipulation de liquides. Cependant, il peut être adapté pour les laboratoires de débit inférieurs sans automatisation.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH tampons de lavage</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridation</td><td>buffer Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute kit de purification</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH kit d’étiquetage Enzo</td><td></td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

tableau hybridation génomique comparative (cgh array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

La CGH à matrice pour la détection des variants du nombre de copies génomiques a remplacé l’analyse du caryotype en bande G. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic clinique. L’ADN extrait de l’échantillon d’un patient (sang, salive ou autres types de tissus) est marqué avec un fluorochrome (cyanine 5 ou cyanine 3). Un échantillon d’ADN de référence est marqué avec le fluorochrome opposé. S’ensuit une étape de nettoyage pour éliminer les nucléotides non incorporés avant que les ADN marqués ne soient mélangés et remis en suspension dans un tampon d’hybridation et appliqués à un réseau comprenant ~60 000 sondes d’oligonucléotides à partir de loci à travers le génome, avec une densité de sondes élevée dans les zones cliniquement importantes. Après l’hybridation, les réseaux sont lavés, puis balayés et les images résultantes sont analysées pour mesurer la fluorescence rouge et verte de chaque sonde. Un logiciel est utilisé pour évaluer la qualité de chaque mesure de sonde, calculer le rapport entre la fluorescence rouge et la fluorescence verte et détecter les variantes potentielles du nombre de copies.

Chaque sonde sur un réseau hybride est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert (voir Figure 1). Le ratio de rouge à un signal vert fluorescent pour chaque sonde est quantifiée par le scanner et le logiciel associé graphiquement en ratios de log2 selon leur position génomique, et identifie les régions relevant de limites prédéfinies extérieur. Les traces de tableau résultant permettent interprétation de régions identifiées comme génomiquement déséquilibrée. Par exemple, la trace d&#39;...

CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l&#39;analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'hybridation génomique comparative en matrice pour identifier les déséquilibres dans le génome pouvant entraîner une grande variété de maladies génétiques. Cela est réalisé en marquant d'abord l'ADN du patient avec un colorant fluorescent. Dans la deuxième étape, l'ADN du patient et un ADN de référence marqué différemment sont hybridés sur la matrice.Ensuite, la matrice est analysée pour mesurer la quantité d'ADN du patient et de l'ADN de référence fixée sur chaque sonde. Dans la dernière étape, l'image numérisée est traitée afin d'identifier les régions du génome où l'ADN du patient présente plus ou moins de matériel que l'ADN de référence. L'hybridation génomique comparative est utilisée pour déterminer si le patient présente une variante du nombre de copies entraînant un syndrome génétique.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car l'assemblage de la lame à puces peut s'avérer difficile et il est facile que l'hybridation provoque des débordements hors de la chambre avant le début de la réaction d'étiquetage. Décongeler la plaque de 96 puits prête à l'emploi contenant les nucléotides et les amorces à quatre degrés Celsius et à l'abri de la lumière pendant environ une heure.Une fois décongelé, laisser l'équilibre de la plaque couverte pendant encore 30 minutes à température ambiante ; en même temps, équilibrer les échantillons d'ADN pendant 15 minutes à 60 degrés Celsius. Pendant que les échantillons se réchauffent, utiliser un robot de manipulation de liquides pour distribuer suffisamment d'eau exempte de nucléase dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits. Ensuite, lorsque l'ADN est prêt, transférer un microgramme d'échantillon par puits dans la plaque 96 puits contenant l'eau.Transférez maintenant 20 microlitres des nucléotides et des amorces d'équilibre dans chacun des puits de la plaque contenant les échantillons d'ADN dilués, puis scellez la plaque avec des capuchons en bande en veillant à assurer un scellement étanche. Ensuite, dénaturez l'ADN à 99 degrés Celsius dans un thermocycleur muni d'un couvercle chauffant pendant 10 minutes, puis faites refroidir brusquement la plaque sur de la glace pendant cinq minutes afin d'hybrider les amorces. Puis, utilisez le robot de manipulation des liquides pour ajouter 10 microlitres d'enzyme polymérase exo DNA « clean out » dans chaque échantillon.Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette, puis scellez la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Le lendemain, arrêtez la réaction en ajoutant cinq microlitres de solution d’arrêt par puits. Ensuite, éliminez les nucléotides non incorporés. Transférez le contenu de chaque puits dans des tubes individuels pré-étiquetés de deux millilitres.Chargez les échantillons et les colonnes de purification d'ADN sur colonne tournante dans un robot de traitement de colonnes tournantes, ainsi que les tampons associés appropriés. Conformément aux instructions du fabricant, le robot de traitement de colonnes tournantes lie l'ADN marqué à la membrane de silice à l'aide de 250 microlitres de tampon de liaison d'ADN à forte concentration saline par tube, après quoi les impuretés sont éliminées des membranes par deux lavages successifs de 500 microlitres de tampon de lavage chacun. Le robot ajoute ensuite 15 microlitres de tampon de faible salinité sur les membranes afin de récupérer les échantillons d'ADN marqué purifié en volumes approximatifs de 12 microlitres pour l'hybridation des échantillons.Ensuite, préchauffer un four d'hybridation à 65 degrés Celsius et réchauffer préalablement les lames porte-objets et les chambres d'hybridation. Pour préparer le mélange d'hybridation, combiner 1,1 µL d'ADN cot 1D, 4,95 µL du mélange de blocage fourni par le fabricant et 24,75 µL de tampon d'hybridation. Utiliser le robot de manipulation des liquides pour distribuer ce mélange dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits, en humidifiant au préalable chaque pointe afin d'améliorer la précision du transfert.Ensuite, pipeter 9,35 microlitres du réactif d'étiquetage approprié, ADN marqué trois, suivi de 9,35 microlitres du réactif d'étiquetage approprié, ADN marqué cinq. Sceller chaque puits de la plaque, fourex les échantillons pendant une minute, puis effectuer une brève centrifugation afin de rassembler le contenu au fond de chaque puits. Dénaturaliser l'ADN marqué dans un incubateur de pré-hybridation.D'abord pendant trois minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, travaillez sur une plateforme chauffée à 42 degrés Celsius. Placez la lame porteuse dans la chambre d'hybridation, en veillant à ce que la partie transparente du joint s'aligne avec la partie fenêtrée de la chambre d'hybridation, en utilisant des pointes pré-humidifiées.Prélève maintenant lentement 42 microlitres du mélange d'hybridation au centre de la position appropriée de la lame porteuse de la matrice, en veillant à ce que le liquide n'entre pas en contact avec la limite de l'anneau en caoutchouc. Une fois que toutes les positions sont remplies, abaisse délicatement la lame de la matrice sur la lame porteuse et assemble la chambre d'hybridation.Veiller à ce que le côté du dispositif portant l'inscription soit orienté vers la lame de support, puis serrer complètement la vis de la chambre d'hybridation et examiner la chambre d'hybridation assemblée afin de confirmer qu'aucune fuite de l'hybridation ne se produit à l'extérieur des limites du joint en caoutchouc et que chaque bulle d'air mesure environ quatre millimètres de hauteur. Lorsque la chambre d'hybridation est posée verticalement sur une extrémité, la faire tourner pour vérifier ce point.Toutes les bulles d'air à chaque position sont en mouvement. Si certaines bulles sont bloquées, donnez un coup sec sur la chambre en la tapant sur le banc. Ensuite, placez les chambres d'hybridation dans l'étuve rotative à 65 degrés Celsius pendant 24 heures.Le lendemain, immergez les chambres d'hybridation dans le tampon de lavage un et utilisez une paire de pinces en plastique à extrémités plates pour séparer les lames. Ensuite, jetez les lames avec joints et placez les lames de puces dans un support immergé dans du tampon un frais. Lavez les lames de puces dans environ 700 millilitres de tampon de lavage pendant une à cinq minutes, en agitant vigoureusement à l’aide d’un agitateur magnétique et d’un barreau aimanté.Transférez ensuite les lames porte-objets munies de puces vers environ 700 millilitres de tampon de lavage, deux fois pendant 90 secondes, avec un agitation plus vigoureuse à la fin du deuxième lavage. Retirez délicatement les lames porte-objets du tampon. Elles doivent émerger sèches.Ensuite, charger les lames porte-échantillons dans les supports de lames du numériseur, avec les protections pour lames, puis numériser les échantillons. Selon les instructions du fabricant de la puce, chaque sonde sur une puce hybridée est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert. Les rapports entre le signal fluorescent rouge et vert pour chaque sonde sont quantifiés par le numériseur et le logiciel associé, puis représentés sous forme de rapports logarithmiques en base deux en fonction de leur position génomique.Les profils obtenus permettent d'interpréter les régions identifiées comme étant génomiquement déséquilibrées. Par exemple, dans ce profil provenant d'un enfant atteint du syndrome de Williams, une microdélétion récurrente médiée par des répétitions de faible copie dans la région proximale du chromosome sept, le déséquilibre génomique a été identifié par le logiciel à l'aide d'une ligne rouge. Le logarithme du rapport fluorescent prop devrait s'agréger étroitement autour de zéro, indiquant un rapport vert sur rouge de un pour un dans les régions normales du génome.Les traces en réseau dispersé observées lors de cet examen peuvent entraîner une détection inexacte des régions anormales, ou un échec à identifier le déséquilibre génomique, et peuvent être causées par plusieurs facteurs, notamment une mauvaise qualité de l'ADN ou la présence de rayons, ainsi que des niveaux d'ozone dans l'atmosphère. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les échantillons de patients pour un test par CGH sur puce et produire des données de bonne qualité destinées à l'analyse en aval et à la détection des variations du nombre de copies.

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Cette vidéo est une démonstration technique du protocole d'hybridation pour l'ensemble du génome de carrelage CGH array chemin, qui scanne l'ensemble du génome humain en utilisant seulement 25 à 100 ng d'ADN qui peuvent être isolées à partir de diverses sources, y compris les archives du matériel fixé au formol.

Démonstration technique de l&#39;hybridation tableau Whole Genome génomique comparative

Cet article décrit la sélection des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliquées au diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) dans un contexte clinique.

FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

séquençage cellulaire unique est un outil de plus en plus populaire et accessible pour aborder les changements génomiques à haute résolution. Nous fournissons un protocole qui utilise le séquençage d'une cellule unique pour identifier des altérations du nombre de copies dans des cellules individuelles.

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Ce protocole donne des mesures expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à effectuer du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) analyse des variations numéros de copie plantes.

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Ce manuscrit décrit l’analyse de variation numéro de copie exécutée dans l’ADN de sérum ou de plasma à l’aide de la méthode PCR en temps réel. Cette méthode convient pour la prédiction de la pharmacorésistance chez des patients de cancer de la prostate résistant à la castration, mais ça pourrait être instructif aussi pour d’autres maladies.

Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel

Le manuscrit décrit une puce numérique PCR pour détecter une variante rare du transcript CDH1 (CDH1a) en mode normal frais-congelé et tissus tumoraux obtenus de patients atteints de cancer gastrique.

Détection d’une variante de transcription Rare CDH1 dans les tissus frais congelés de Cancer gastrique par puce numérique PCR

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

Ici, nous décrivons une procédure pour l’analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans les cancers gastro-intestinaux. La procédure est pertinente pour les études qui étudient les relations entre les modèles de méthylation des gènes et les facteurs contribuant à la carcinogenèse dans les cancers gastro-intestinaux.

Analyse à l’échelle du génome de la méthylation de l’ADN dans le cancer gastro-intestinal

Le protocole présente l’ensemble des procédures en laboratoire requises pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs. Nous présentons ici les étapes détaillées de l’amplification du génome entier, de la sélection des fragments d’ADN, de la construction de la bibliothèque, de la préparation du modèle et du flux de travail de séquençage avec des résultats représentatifs.

Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs

Ce protocole décrit un flux de travail de séquençage de nouvelle génération automatisé et accrédité par ISO15189 pour détecter les altérations génomiques ciblables dans les tissus contenant de la paraffine fixée au formol pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC).

Détection d’altérations ciblables dans le cancer du poumon non à petites cellules à l’aide du séquençage de nouvelle génération

Apprenez la technique d'hybridation génomique comparative sur puce pour détecter les variants du nombre de copies dans l'ADN patient. Cette méthode améliore le diagnostic des syndromes génétiques en laboratoire clinique.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

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