Name: Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Apprenez l'hybridation génomique comparative sur puce pour détecter les variations de nombre de copies chez Medicago truncatula. Cette méthode sensible facilite l'étude du développement des nodosités chez les légumineuses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ce travail est financé en partie par une subvention de NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

Remarque : la Figure 1 illustre les cinq étapes pour le tableau protocole CGH. Ils sont : 1) préparation du matériel végétal ; 2) isolation haute qualité d’échantillons d’ADN ; Labeling 3) et la purification des échantillons d’ADN ; 4) hybridation, lavage et balayage des tableaux du génome entier ; et 5) analyse de données HGC. Tableaux de carrelage pour le génome entier M. truncatula contiennent un total de 971 041 sondes oligo unique ciblant plus de 50 000 gènes ou modèles de gène dans le génome (voir le tableau des matériaux). Les sondes uniques sont espacées approximativement chaque 150 paires de bases (bp) dans les régions silenceur et 261 bp intronic régions du génome M. truncatula.
 1. préparation des matières végétales <ol><li>Scarify sauvage (WT ; Cv de M. truncatula Jemalong A17) et graines mutantes FN6191 avec l’acide sulfurique concentré pendant 8 min (voir Table des matières). Retirer et jeter de l’acide sulfurique pour un conteneur à déchets liquid.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau désionisée autoclavé triple.</li>
	<li>Surface de stériliser les graines avec Javel 20 % pendant 10 min.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau désionisée autoclavé triple.</li>
	<li>Graines de magasin à 4 ° C pendant 3 jours. Après vernalisation, transférer et faire germer des graines dans le sol pour une semaine en chambre de croissance avec 16 h/8 h cycle lumière/obscurité et 150 µE/m 2/s d’intensité lumineuse.</li>
	<li>Transplantation des semis dans des pots de 1 gallon et cultivez-les dans une serre à cycle lumière/obscurité de 16 h/8 h, 150 µE/m 2/s intensité lumineuse pendant trois à quatre semaines. Recueillir des échantillons de jeunes feuilles de la plante pour l’isolement de l’ADN.</li>
</ol> 2. Isolement des échantillons d’ADN de haute qualité <ol><li>prendre 1 gramme de tissus de jeunes feuilles d’une plante unique et congelez-la immédiatement dans l’azote liquide.</li>
	<li>Moudre des tissus congelés dans l’azote liquide avec un mortier et un pilon de poudre fine.</li>
	<li>Isoler l’ADN génomique avec un isolement d’ADN nécessaire (voir la Table des matières).</li>
	<li>Remettre purifié des échantillons d’ADN dans 50 µL d’autoclave double désionisée H 2 O (ddH 2 O) ou 1 x tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).</li>
	<li>Concentrations d’ADN de mesure avec un spectrophotomètre (voir Table des matières).</li>
	<li>Évaluer 260 nm/280 nm et des 260 nm/230 nm ratios d’échantillons d’ADN. 
	NOTE : Échantillons d’ADN de qualité doivent avoir un rapport de 260 nm/280 nm &#8805; 1.8 et un rapport de 260 nm/230 nm &#8805; 2.0.</li>
	<li>Encore évaluer des échantillons d’ADN en les exécutant dans 1 % des gels d’agarose. 
	NOTE : Échantillons d’ADN de qualité devraient avoir de poids moléculaire élevé et ne doivent pas être contaminés par l’ARN. Idéalement, la concentration finale d’échantillons d’ADN devrait être environ 150 ng/µL.</li>
</ol> 3. Purification et marquage ADN <ol><li>diluer 1 µg d’ADN génomique des échantillons avec les ddH 2 O pour un volume final de 20 µL dans un tube à centrifuger 500 µL.</li>
	<li>Ajouter 5 µL d’une amorce aléatoire (voir Table des matières) dans le tube.</li>
	<li>Vortex le tube brièvement et mettez-la dans un thermocycleur à incuber et dénaturer l’ADN à 98 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Prenez le tuyau hors du thermocycleur et mettez-le immédiatement sur l’eau glacée pour se détendre pendant 5 min.</li>
	<li>Marquage de préparer deux mélanges comme indiqué dans le tableau 1.</li>
	<li>Ajouter 25 µL de l’étiquetage des mélanges 1 et 2 à l’ADN de référence et échantillon ADN tubes, respectivement.</li>
	<li>Mélanger le mélange et l’ADN étiquetage en pipettant également, trois fois et faire tourner les tubes brièvement.</li>
	<li>Mettre les tubes dans un thermocycleur à incuber à 37 ° C pendant 2 h, puis à 65 ° C pendant 20 min inactiver l’enzyme Klenow-exo (voir Table des matières).</li>
	<li>430 ajouter µL de 1 x tampon TE dans chaque tube.</li>
	<li>Mélanger le contenu et faire tourner les tubes brièvement.</li>
	<li>Transfert la solution dans le tube dans une colonne de purification avec une collection de 2 mL de tube (voir Table des matières).</li>
	<li>Centrifuger la colonne de purification à 14 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Jeter le passage dans la solution.</li>
	<li>Ajouter 480 µL 1 x tampon TE à chaque colonne.</li>
	<li>Centrifuger la colonne nouveau à 14 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Jeter la solution pass-through.</li>
	<li>Transférer l’échantillon d’ADN marqué qui reste à la partie inférieure de la colonne dans un nouveau tube à centrifuger.</li>
	<li>Mesurer le volume de l’échantillon d’ADN marqué à l’aide d’une pipette et porter le volume final à 80 µL avec 1 x tampon TE.</li>
	<li>Mesurer la concentration de l’échantillon d’ADN marqué à l’aide d’un spectrophotomètre (voir Table des matières).</li>
	<li>Mélanger une quantité égale de l’étiquette échantillon ADN et ADN de référence et de porter le volume final à 160 µL avec 1 x tampon TE.</li>
	<li>Ajouter 256 µL de 2 x tampon d’hybridation, 50 µL de l’ADN humain Cot-1 et 50 µL de 10 × aCGH agent de blocage (voir la Table des matières) et mélangez-les bien en pipettant également, trois fois.</li>
	<li>Faites tourner les tubes brièvement et mettez-les dans un thermocycleur à incuber à 98 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber les tubes à 37 ° C pendant 20 min.</li>
</ol> 4. L’hybridation, lavage et analyse des tableaux du génome <ol><li>Préchauffer le four d’hybridation à 67 ° C au moins 4 h avant le début de l’hybridation.</li>
	<li>Placez un joint sur la base d’une chambre de l’hybridation.</li>
	<li>Charge 490 µL de solution d’hybridation de 3,23 étape sur le toboggan joint.</li>
	<li>Joint colorer avec une puce de microarray de génome de Medicago truncatula pour former une chambre hybridation.</li>
	<li>Mis sur les couvercles de chambre de l’hybridation et vissez la chambre avec des pinces.</li>
	<li>Mettre la chambre hybridation assemblé dans le four à hybridation et incuber à 67 ° C pendant 40 à 48 h.</li>
	<li>Préparer trois diapositives, laver la vaisselle : deux avec 250 mL de tampon de lavage j’ai gardé à température ambiante, et une avec lavage tampon II maintenue à 37 ° C.</li>
	<li>Diapositive de préparer deux pots de lavage : une avec 70 mL d’acétonitrile et une stabilisation de 70 mL et solution de séchage, garder les deux dans une hotte de laboratoire à température ambiante (voir Table des matières).</li>
	<li>Sortir de la chambre de l’hybridation du four et retirez les attaches de la chambre et la couverture.</li>
	<li>Déplacer le microarray chip et le joint de glissent dans un plat à laver diapositive avec tampon de lavage j’ai et séparent la puce de la diapositive de couverture.</li>
	<li>Déplacer le microarray chip pour le deuxième lavage diapositive plat avec tampon de lavage j’ai et doucement faire circuler la solution avec une barre de remuer sur une plaque d’agitation magnétique à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Transfert le microarray chip à la diapositive troisième lavage vaisselle avec du tampon de lavage préchauffé II et laver délicatement avec une barre de remuer sur une plaque d’agitation magnétique à 37 ° C pendant 1 min.</li>
	<li>La puce de microarray de transfert à une diapositive lavé récipient avec de l’acétonitrile dans une hotte aspirante et laver pendant 30 s.</li>
	<li>La puce de microarray de transfert à une diapositive jar avec stabilisation de lavage et de séchage solution et laver pendant 30 s.</li>
	<li>Retirez la puce lentement et sécher pendant 1 min.</li>
	<li>Scan la puce « microarray » à l’aide d’un scanner (voir Table des matières), moins de 2 µm de résolution. Définir les paramètres pour enregistrer plusieurs images et tout les scans de diapos. Régler les canaux 1 et 2 des gains à 100 % et annuler le gain auto.</li>
</ol> 5. Analyse de données HGC <ol><li>extrait la fluorescence Cy3 et Cy5 intensités pour chaque sonde sur le tableau à l’aide du logiciel de numérisation (voir Table des matières).</li>
	<li>Analyse de segmentation d’utilisation du logiciel pour détecter les variations nombre de copie (CNV) entre l’échantillon ADN et l’ADN de référence. Utilisez un seuil des segment moyen journal 2 échantillon/référence ratio ± 2,5 écarts-types pour déterminer la CNV.</li>
	<li>Inspecter la distribution des rapports de journal 2 échantillon/référence au sein du génome entier à l’aide d’un logiciel de cartographie de signal (voir Table des matières).</li>
</ol>

<ol><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genome+release+%28version+Mt4.0%29+for+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312(2014).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+H+%22Floriculture%2C+Ornamental+and+Plant+Biotechnology%3A+Advances+and+Topical+Issues%22">Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues</a>. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+components+of+the+ethylene-response+pathway+identified+in+a+screen+for+weak+ethylene-insensitive+mutants+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).</li>
<li>Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RGA+gene+encodes+a+transcriptional+regulator+repressing+the+gibberellin+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway.</a> Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).</li>
<li>Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleteagene%3A+a+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+gene+knockout+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants.</a> Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).</li>
<li>Bolon, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+genomic+analyses+of+a+fast+neutron+mutant+population+resource+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean.</a> Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).</li>
<li>Men, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43443373_Fast_Neutron_Mutagenesis_of_Soybean_Glycine_soja_L_Produces_a_Supernodulating_Mutant_Containing_a_Large_Deletion_in_Linkage_Group_H">Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H.</a> Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).</li>
<li>Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+deficiency+caused+by+fast+neutron+mutagenesis+of+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus.</a> J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+reverse+genetics+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants.</a> Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).</li>
<li>Bourcy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+DNF2+is+a+PI-PLC-XD-containing+protein+required+for+bacteroid+persistence+and+prevention+of+nodule+early+senescence+and+defense-like+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+phytol%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions.</a> New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dissected+leaf+morphology+by+a+Cys%282%29His%282%29+zinc+finger+transcription+factor+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).</li>
<li>Ge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+seed+size+and+quality+by+manipulating+BIG+SEEDS1+in+legume+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).</li>
<li>Kalo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+signaling+in+legumes+requires+NSP2%2C+a+member+of+the+GRAS+family+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators.</a> Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).</li>
<li>Oldroyd, G. E., Long, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nodulation-signaling+pathway+2%2C+a+gene+of+Medicago+truncatula+involved+in+Nod+actor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling.</a> Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+compound+leaf+development+in+Medicago+truncatula+by+fused+compound+leaf1%2C+a+class+M+KNOX+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene.</a> Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).</li>
<li>Tsujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+TOBAMOVIRUS+MULTIPLICATION+%28TOM%29+2+locus+encodes+a+transmembrane+protein+that+interacts+with+TOM1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1.</a> EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nodule-specific+protein+secretory+pathway+required+for+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis.</a> Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).</li>
<li>Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+array-based+comparative+genomic+hybridization+to+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics.</a> J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).</li>
<li>Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+shapes+genome-wide+patterns+of+copy-number+polymorphism+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster.</a> Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).</li>
<li>Gong, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+rapid+cloning+of+an+ion+accumulation+deletion+mutant+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).</li>
<li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+functional+impact+of+DNA+copy+number+variation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat.</a> Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).</li>
<li>Haun, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li>
<li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li>
<li>Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+%28oaCGH%29+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402(2007).</li>
<li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis%3A+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li>
<li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development%3A+Gene+identification+by+transcript-based+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li>
<li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381(2008).</li>
<li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expression+arrays+for+copy+number+detection%3A+an+example+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).</li>
<li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li>
<li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+esn1+defines+a+genetic+locus+involved+in+nodule+senescence+and+symbiotic+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation.</a> Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).</li>
<li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li>
<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Nous avons développé une plate-forme CGH array pour la détection et la caractérisation du bombardement de neutrons rapides (FNB)-induite des mutants chez M. truncatula CV Jemalong A17. Pour illustrer l’utilisation du tableau méthode CGH dans la détection des mutations du gène, nous avons réalisé aCGH analyse du mutant FN6191, qui présentaient un phénotype hyper nodulation contrairement aux plantes de type sauvage, lorsqu’ils sont inoculés avec S. meliloti Sm1021. Pour l’analyse de la segmentation, un se...

Légumineuses (Fabaceae) sont la troisième plus grande famille de plantes dicotylédones, avec de nombreuses espèces économiquement importantes telles que le soja (Glycine max) et de la luzerne (Medicago sativa). Plantes légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol fixatrices d’azote, généralement appelées Rhizobia pour développer des nodules racinaires où le diazote atmosphérique est réduit à l’ammoniaque pour utilisation par la plante-hôte. Ainsi, la culture des légumineuses nécessite peu d’apport d’engrais azotés et contribue ainsi à une agriculture durable. Les cultures de légumineuses produisent des feuilles et les graines à haute teneur en protéines, servant d’excellents fourrages et de céréales. Cependant, les espèces de légumineuses cultivées ont généralement des structures génome complexe, faisant des études fonctionnelles des gènes qui jouent un rôle clé dans les processus de légumineuses spécifiques encombrants. Medicago truncatula a été largement adopté comme espèce modèle pour des études de légumineuse essentiellement parce que (1) il possède un génome diploïde avec une taille de génome haploïde relativement faible (~ 550 Mbp) ; (2) plantes peuvent être stablement transformés pour des études fonctionnelles de gène ; et (3), il est étroitement lié à la luzerne (M. sativa), la Reine des plantes fourragères et de nombreuses autres cultures d’importance économique pour études translationnelles. Récemment, la séquence du génome de M. truncatula cv Jemalong A17 a été libéré1,2. Annotation du génome montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes prédits ou modèles de gène dans le génome. Pour déterminer la fonction de la plupart des gènes chez le M. truncatula génome est une tâche difficile. Afin de faciliter les études fonctionnelles des gènes, une vaste collection de mutants de l’ordre de plus 150 000 lignes de1 M a été générée à l’aide de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrons rapides, mutagène haute énergie d’ionisation, a été utilisé dans la génération de mutants chez de nombreuses espèces végétales dont Arabidopsis5,6,7de riz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, orge (Hordeum vulgare) et Lotus japonicus10. Une grande partie des mutations dérivé de mutagenèse FNB résultent de destructions d’ADN qui varient en taille de quelques paires de bases au mega paires de bases9,11. De nombreux gènes associés à phénotype ont été correctement identifié et caractérisé les4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. auparavant, le clonage moléculaire des gènes sous-jacents des mutants de la FNB s’est fondé sur une approche axée sur la carte, ce qui prend du temps et limite le nombre de mutants à être caractérisée au niveau moléculaire. Récemment, plusieurs approches complémentaires y compris des méthodes axées sur la transcription, génome revêtement basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) pour la détection de variation numéro copie l’ADN et le séquençage du génome entier, ont été employée pour faciliter la caractérisation de mutants de délétion dans divers organismes, y compris les animaux et les plantes20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Afin de faciliter la caractérisation de mutants FNB chez M. truncatula, une génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) plate-forme a été développée et validée. Tel que rapporté dans les systèmes animaux, la plate-forme CGH array permet de détecter des variations nombre de copie (CNV) au niveau du génome chez les mutants FNB M. truncatula . En outre, des lésions peuvent être confirmées par PCR et frontières de suppression peuvent être identifiés par séquençage. Dans l’ensemble, la plate-forme CGH array est un outil efficace pour identifier les lésions chez les mutants FNB M. truncatula . Ici, la procédure CGH array et la caractérisation de la PCR des frontières de suppression dans un mutant FNB M. truncatula sont illustrées.
Le protocole suivant donne les étapes expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à réaliser l’analyse du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) du nombre de copies variations dans les plantes. À titre d’exemple, Medicago truncatula FN6191 mutant a été utilisé pour identifier les régions de suppression et de gènes candidats associées aux phénotypes mutants. M. truncatula FN6191 mutant, isolé à l’origine d’un neutron rapide suppression induite par le bombardement mutant collection32 (voir Table des matières), présentaient un phénotype hyper nodulation après inoculation avec le sol bactérie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, contrairement aux plantes de type sauvage.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula réseau génomique, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td><td>Maison</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (référence)</td><td>Maison</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag Kit de marquage ADN</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Amorce aléatoire</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Solution de stabilisation et de séchage</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’étanchéité de la chambre d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 et 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’hybridation, acier inoxydable</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de purification</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Scanner laser</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Carte</td><td>des signaux 5225035001</td><td></td>Nimblegen</tr><tr><td>1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>Signalmap1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre variations chez les mutants induite par neutrons rapides medicago truncatula

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Les mutants sont inestimables ressources génétiques pour les études de fonction de gènes. Pour générer des collections de mutants, trois types d’agents mutagènes peuvent être utilisés, y compris biologiques telles que l’ADN-T ou transposon, chimique notamment le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), ou physique comme le rayonnement de l’ionisation. Le type de mutation observée varie selon le mutagène utilisé. Des mutants de rayonnement induit par ionisation, mutations incluent délétion, duplication ou réarrangement. T-DNA ou mutagenèse axée sur le transposon est limitée aux espèces qui sont sensibles à la transformation, mutagenèse chimique ou physique peut être appliquée à une vaste gamme d’espèces. Cependant, la caractérisation des mutations dérivé de mutagenèse chimique ou physique traditionnellement repose sur une approche de clonage positionnel, qui est le travail intensif et beaucoup de temps. Ici, nous montrons qu’une plate-forme de basées sur l’hybridation génomique comparative (aCGH) haute densité génome peut être appliquée pour efficacement détecter et caractériser les variations numéros copie (CNV) chez les mutants dérivés de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans Medicago truncatula, une espèce de légumineuse. Le séquençage du génome entier montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes ou modèles de gènes chez le M. truncatula. À présents, induite par le FNB mutants chez le M. truncatula proviennent de plus de 150 000 lignes M1, ce qui représente de précieuses ressources génétiques pour l’étude fonctionnelle de gènes dans le génome. La plate-forme aCGH décrite ici est un outil efficace pour la caractérisation des mutants induite par le FNB chez le M. truncatula.

La figure 2 montre la répartition des ratios2 journal normalisée du mutant contre WT signaux au sein du génome entier. Analyse des données CGH a révélé une approximation annoté de 22KO délétion sur le chromosome 4 qui englobe l' ensemble du gène SUNN 33 et plusieurs autres gènes chez le mutant FN6191 (Figure 2, Figure 3). La région candidate portait 73 sond...

Ce protocole donne des mesures expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à effectuer du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) analyse des variations numéros de copie plantes.

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

L’objectif global de ce protocole d’hybridation génomique comparative basé sur une puce est d’identifier rapidement les variations du nombre de copies dans les mutants induits par le bombardement de neutrons rapides de la légumineuse Medicago truncatula. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des légumineuses. Par exemple, faciliter l’identification des empathogènes sur les sites bas impliqués dans la régulation du développement des nodules chez les légumineuses.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est de la plus haute réputation et sensible à la détection des variations du nombre de copies telles que les mutations de délétion dans les mutants de bombardement de neutrons de la légumineuse Medicago truncatula. La démonstration de cette procédure sera faite par moi-même et Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows du Laboratoire de génétique. Congelez rapidement un gramme de tissu de jeunes feuilles prélevé sur des plantes uniques dans de l’azote liquide.Ensuite, utilisez un mortier et un pilon et broyez le tissu foliaire congelé en poudre fine dans l’azote liquide. Extrayez les échantillons d’ADN génomique de type sauvage et mu

an-array-based-comparative-genomic-hybridization-platform-for

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Cette vidéo est une démonstration technique du protocole d'hybridation pour l'ensemble du génome de carrelage CGH array chemin, qui scanne l'ensemble du génome humain en utilisant seulement 25 à 100 ng d'ADN qui peuvent être isolées à partir de diverses sources, y compris les archives du matériel fixé au formol.

Démonstration technique de l&#39;hybridation tableau Whole Genome génomique comparative

Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.

Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

Ce protocole décrit une procédure rapide et peu consommatrice de matériaux pour l’intégration de réseaux extrachromosomiques transgéniques dans le génome de Caenorhabditis elegans en utilisant l’irradiation ultraviolette (UV). De plus, ce protocole est particulièrement bien adapté aux lignées transgéniques qui transmettent des réseaux extrachromosomiques à un rythme élevé.

Un protocole rapide pour l’intégration de puces extrachromosomiques à haut taux de transmission dans le génome de C. elegans

CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.

Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

Dans cet article, nous présentons le protocole qui est décrit comme l'analyse de fusion à haute résolution (HRM)-basée Sur les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING). Cette méthode utilise des changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d'ADN et convient au dépistage à haut débit de l'insertion/suppression (Indel) et de la sous-stition de base unique (SBS).

Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING

Le protocole présente l’ensemble des procédures en laboratoire requises pour les tests génétiques préimplantatoires pour l’aneuploïdie sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs. Nous présentons ici les étapes détaillées de l’amplification du génome entier, de la sélection des fragments d’ADN, de la construction de la bibliothèque, de la préparation du modèle et du flux de travail de séquençage avec des résultats représentatifs.

Test génétique préimplantatoire pour l’aneuploïdie sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération à base de semi-conducteurs

Apprenez l'hybridation génomique comparative sur puce pour détecter les variations de nombre de copies chez Medicago truncatula. Cette méthode sensible facilite l'étude du développement des nodosités chez les légumineuses.

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula (Vidéo) | JoVE Journal

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Explorer plus de vidéos