Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

L’objectif global de ce protocole d’hybridation génomique comparative basé sur une puce est d’identifier rapidement les variations du nombre de copies dans les mutants induits par le bombardement de neutrons rapides de la légumineuse Medicago truncatula. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des légumineuses. Par exemple, faciliter l’identification des empathogènes sur les sites bas impliqués dans la régulation du développement des nodules chez les légumineuses.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est de la plus haute réputation et sensible à la détection des variations du nombre de copies telles que les mutations de délétion dans les mutants de bombardement de neutrons de la légumineuse Medicago truncatula. La démonstration de cette procédure sera faite par moi-même et Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows du Laboratoire de génétique. Congelez rapidement un gramme de tissu de jeunes feuilles prélevé sur des plantes uniques dans de l’azote liquide.

Ensuite, utilisez un mortier et un pilon et broyez le tissu foliaire congelé en poudre fine dans l’azote liquide. Extrayez les échantillons d’ADN génomique de type sauvage et mutant de la poudre fine à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN. Utilisez des tubes à centrifuger de 500 microlitres pour diluer un microgramme de chaque ADN génomique sauvage et mutant avec de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 20 microlitres.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’amorce aléatoire dans les tubes à centrifuger. Vortex rapidement les tubes, et après une rotation rapide, placez-les dans un thermocycleur pendant 10 minutes pour dénaturer les échantillons d’ADN à 98 degrés Celsius. Au bout de 10 minutes, retirez les tubes du thermocycleur et placez-les instantanément sur de l’eau glacée pendant cinq minutes.

Ensuite, préparez deux mélanges d’étiquetage et ajoutez 25 microlitres de mélange d’étiquetage en un et deux dans les tubes d’ADN de type sauvage et mutant respectivement. Pipetez l’ADN et le mélange d’étiquetage trois fois, puis faites tourner brièvement les tubes. Après l’essorage, incubez les tubes dans le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour inactiver l’enzyme exo Klenow.

Ensuite, ajoutez 430 microlitres de tampon One X TE et mélangez le contenu dans chaque tube. Ensuite, faites tourner brièvement les tubes et transférez la solution dans les tubes dans des colonnes de purification avec des tubes de collecte de deux millilitres. Centrifugez les colonnes de purification à 14 000 fois G pendant 10 minutes et jetez le flux.

Ajoutez 480 microlitres de One X TE Buffer dans chaque colonne, puis centrifugez à nouveau à 14 000 fois G pendant 10 minutes. Jetez le flux. Transférez chacun des ADN marqués de type sauvage et mutant du bas de la colonne dans de nouveaux tubes à centrifuger.

Après avoir mesuré le volume de chacun des ADN marqués à l’aide de la pipette, ajustez le volume final à 80 microlitres avec un tampon One X TE, puis mesurez la concentration des ADN marqués dans un spectrophotomètre. Ensuite, mélangez des volumes équivalents d’ADN mutants et de type sauvage pour hybrider les sondes sur une puce de micro-réseau pour une hybridation comparative. Portez le volume final à 160 microlitres avec One X TE Buffer.

Ensuite, préparez la solution d’hybridation et pipetez-la trois fois pour bien mélanger trois agents avec de l’ADN mélangé. Après avoir brièvement fait tourner les tubes, incubez-les dans un thermocycleur à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes et à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. N’oubliez pas de régler la température à 67 degrés Celsius pour préchauffer le four d’hybridation quatre heures avant l’hybridation.

Ensuite, placez une glissière d’étanchéité sur la base de la chambre d’hybridation et chargez-y 490 microlitres de solution d’hybridation après 20 minutes d’incubation à 37 degrés Celsius dans le thermocycleur. Pour former la chambre d’hybridation, couvrez la lame d’étanchéité avec la puce de micro-réseau de génome de Medicago truncatula, puis couvrez la chambre d’hybridation et serrez-la solidement avec les pinces. Incuber la chambre d’hybridation assemblée dans le four d’hybridation à 67 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures.

Pendant ce temps, préparez deux diapositives de vaisselle avec 250 millilitres de Washing Buffer One maintenu à température ambiante. Ensuite, faites une glissière pour laver la vaisselle avec le tampon de lavage deux maintenu à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez un pot de lavage de lames avec 70 millilitres d’acétonitrile et un autre pot de lavage de lames avec 70 millilitres de solution de stabilisation et d’étirage.

Placez les deux bocaux de lavage des lames dans une hotte à température ambiante. Après l’incubation, retirez la chambre d’hybridation du four d’hybridation et desserrez les pinces de la chambre pour ouvrir le couvercle. Ensuite, retirez la puce du micro-réseau dans la glissière du joint et placez-les sur la vaisselle de lavage de la glissière avec Wash Buffer One.

Isolez la puce de la puce de la glissière de couverture. Ensuite, transférez la puce du microréseau sur la deuxième lame de lavage de la vaisselle avec Wash Buffer One. À l’aide d’une barre d’agitation, remuez doucement la solution sur une plaque d’agitation magnétique à température ambiante pendant cinq minutes.

Placez la puce du microréseau sur la glissière avec le tampon de lavage deux préchauffé, puis remuez avec la barre d’agitation pour laver la solution à 37 degrés Celsius pendant une minute. Retirez la puce du micro-réseau et placez-la dans le pot de lavage à lames contenant de l’acétonitrile dans une hotte pour laver pendant 30 secondes. Transférez la puce de micro-réseau dans le bocal de lavage de lames avec une solution de stabilisation et de séchage et lavez à nouveau pendant 30 secondes.

Retirez délicatement les copeaux et séchez-les pendant une minute à l’intérieur de la hotte. Numérisez la puce du microréseau à l’aide d’un scanner sous une résolution de deux micromètres. Un logiciel de cartographie des signaux a été utilisé comme interface pour analyser la distribution des rapports logarithmes normalisés des signaux de type mutant par rapport aux signaux de type sauvage sur huit chromosomes.

Pour les suppressions présumées, la valeur du rapport logarithmique deux égale ou inférieure à moins deux virgule cinq écart-type est prise en compte. L’analyse de segmentation du logiciel montre une région de délétion estimée à 22 kilobases sur le chromosome quatre montré dans le graphique. L’analyse des limites de délétion flanquées des sondes de microréseaux montre un rapport logarithmique moyen normalisé réduit.

Le graphique montre également six autres gènes annotés, y compris le gène fils englobant la région supprimée. Le gène Son est responsable du contrôle de la nodulation chez Metecago truncatula. Ensuite, l’amplification PCR effectuée pour confirmer les limites de délétion montre un produit d’un point cinq kilobase amplifié à partir du mutant FN6191, mais pas dans le type sauvage.

Le séquençage de l’ADN a été effectué pour montrer la jonction de délétion chez le mutant FN6191 montré dans la flèche noire. Un séquençage a également été effectué pour confirmer l’emplacement des bordures de suppression. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en 72 heures si elle est exécutée correctement.

Pour obtenir des données de haute qualité, n’oubliez pas de maintenir la concentration d’ozone à un faible niveau dans la pièce où la procédure est effectuée. À la suite de cette procédure, d’autres mesures telles que les réactions en chaîne par polymérase de tout le séquençage du génome peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la taille et les variations du nombre de copies dans le génome. L’événement et la validation de cette technique ont ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la variation du nombre de copies qu’ils induisent chez les mutants et les variantes naturelles chez les espèces végétales qui ne se prêtent pas à la mutagenèse insertionnelle telles que Garden P. N’oubliez pas que travailler avec de l’acétonitrile, une solution de stabilisation et de séchage peut être extrêmement dangereux.

Des précautions, telles que le port d’une protection oculaire, éviter tout contact direct avec les agents et travailler prudemment sont absolument essentielles.