Name: Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Apprenez l'hybridation génomique comparative sur puce pour détecter les variations de nombre de copies chez Medicago truncatula. Cette méthode sensible facilite l'étude du développement des nodosités chez les légumineuses.

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De ce travail est financé en partie par une subvention de NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

Remarque : la Figure 1 illustre les cinq étapes pour le tableau protocole CGH. Ils sont : 1) préparation du matériel végétal ; 2) isolation haute qualité d’échantillons d’ADN ; Labeling 3) et la purification des échantillons d’ADN ; 4) hybridation, lavage et balayage des tableaux du génome entier ; et 5) analyse de données HGC. Tableaux de carrelage pour le génome entier M. truncatula contiennent un total de 971 041 sondes oligo unique ciblant plus de 50 000 gènes ou modèles de gène dans le génome (voir le tableau des matériaux). Les sondes uniques sont espacées approximativement chaque 150 paires de bases (bp) dans les régions silenceur et 261 bp intronic régions du génome M. truncatula.
 1. préparation des matières végétales <ol><li>Scarify sauvage (WT ; Cv de M. truncatula Jemalong A17) et graines mutantes FN6191 avec l’acide sulfurique concentré pendant 8 min (voir Table des matières). Retirer et jeter de l’acide sulfurique pour un conteneur à déchets liquid.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau désionisée autoclavé triple.</li>
	<li>Surface de stériliser les graines avec Javel 20 % pendant 10 min.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau désionisée autoclavé triple.</li>
	<li>Graines de magasin à 4 ° C pendant 3 jours. Après vernalisation, transférer et faire germer des graines dans le sol pour une semaine en chambre de croissance avec 16 h/8 h cycle lumière/obscurité et 150 µE/m 2/s d’intensité lumineuse.</li>
	<li>Transplantation des semis dans des pots de 1 gallon et cultivez-les dans une serre à cycle lumière/obscurité de 16 h/8 h, 150 µE/m 2/s intensité lumineuse pendant trois à quatre semaines. Recueillir des échantillons de jeunes feuilles de la plante pour l’isolement de l’ADN.</li>
</ol> 2. Isolement des échantillons d’ADN de haute qualité <ol><li>prendre 1 gramme de tissus de jeunes feuilles d’une plante unique et congelez-la immédiatement dans l’azote liquide.</li>
	<li>Moudre des tissus congelés dans l’azote liquide avec un mortier et un pilon de poudre fine.</li>
	<li>Isoler l’ADN génomique avec un isolement d’ADN nécessaire (voir la Table des matières).</li>
	<li>Remettre purifié des échantillons d’ADN dans 50 µL d’autoclave double désionisée H 2 O (ddH 2 O) ou 1 x tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).</li>
	<li>Concentrations d’ADN de mesure avec un spectrophotomètre (voir Table des matières).</li>
	<li>Évaluer 260 nm/280 nm et des 260 nm/230 nm ratios d’échantillons d’ADN. 
	NOTE : Échantillons d’ADN de qualité doivent avoir un rapport de 260 nm/280 nm &#8805; 1.8 et un rapport de 260 nm/230 nm &#8805; 2.0.</li>
	<li>Encore évaluer des échantillons d’ADN en les exécutant dans 1 % des gels d’agarose. 
	NOTE : Échantillons d’ADN de qualité devraient avoir de poids moléculaire élevé et ne doivent pas être contaminés par l’ARN. Idéalement, la concentration finale d’échantillons d’ADN devrait être environ 150 ng/µL.</li>
</ol> 3. Purification et marquage ADN <ol><li>diluer 1 µg d’ADN génomique des échantillons avec les ddH 2 O pour un volume final de 20 µL dans un tube à centrifuger 500 µL.</li>
	<li>Ajouter 5 µL d’une amorce aléatoire (voir Table des matières) dans le tube.</li>
	<li>Vortex le tube brièvement et mettez-la dans un thermocycleur à incuber et dénaturer l’ADN à 98 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Prenez le tuyau hors du thermocycleur et mettez-le immédiatement sur l’eau glacée pour se détendre pendant 5 min.</li>
	<li>Marquage de préparer deux mélanges comme indiqué dans le tableau 1.</li>
	<li>Ajouter 25 µL de l’étiquetage des mélanges 1 et 2 à l’ADN de référence et échantillon ADN tubes, respectivement.</li>
	<li>Mélanger le mélange et l’ADN étiquetage en pipettant également, trois fois et faire tourner les tubes brièvement.</li>
	<li>Mettre les tubes dans un thermocycleur à incuber à 37 ° C pendant 2 h, puis à 65 ° C pendant 20 min inactiver l’enzyme Klenow-exo (voir Table des matières).</li>
	<li>430 ajouter µL de 1 x tampon TE dans chaque tube.</li>
	<li>Mélanger le contenu et faire tourner les tubes brièvement.</li>
	<li>Transfert la solution dans le tube dans une colonne de purification avec une collection de 2 mL de tube (voir Table des matières).</li>
	<li>Centrifuger la colonne de purification à 14 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Jeter le passage dans la solution.</li>
	<li>Ajouter 480 µL 1 x tampon TE à chaque colonne.</li>
	<li>Centrifuger la colonne nouveau à 14 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Jeter la solution pass-through.</li>
	<li>Transférer l’échantillon d’ADN marqué qui reste à la partie inférieure de la colonne dans un nouveau tube à centrifuger.</li>
	<li>Mesurer le volume de l’échantillon d’ADN marqué à l’aide d’une pipette et porter le volume final à 80 µL avec 1 x tampon TE.</li>
	<li>Mesurer la concentration de l’échantillon d’ADN marqué à l’aide d’un spectrophotomètre (voir Table des matières).</li>
	<li>Mélanger une quantité égale de l’étiquette échantillon ADN et ADN de référence et de porter le volume final à 160 µL avec 1 x tampon TE.</li>
	<li>Ajouter 256 µL de 2 x tampon d’hybridation, 50 µL de l’ADN humain Cot-1 et 50 µL de 10 × aCGH agent de blocage (voir la Table des matières) et mélangez-les bien en pipettant également, trois fois.</li>
	<li>Faites tourner les tubes brièvement et mettez-les dans un thermocycleur à incuber à 98 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber les tubes à 37 ° C pendant 20 min.</li>
</ol> 4. L’hybridation, lavage et analyse des tableaux du génome <ol><li>Préchauffer le four d’hybridation à 67 ° C au moins 4 h avant le début de l’hybridation.</li>
	<li>Placez un joint sur la base d’une chambre de l’hybridation.</li>
	<li>Charge 490 µL de solution d’hybridation de 3,23 étape sur le toboggan joint.</li>
	<li>Joint colorer avec une puce de microarray de génome de Medicago truncatula pour former une chambre hybridation.</li>
	<li>Mis sur les couvercles de chambre de l’hybridation et vissez la chambre avec des pinces.</li>
	<li>Mettre la chambre hybridation assemblé dans le four à hybridation et incuber à 67 ° C pendant 40 à 48 h.</li>
	<li>Préparer trois diapositives, laver la vaisselle : deux avec 250 mL de tampon de lavage j’ai gardé à température ambiante, et une avec lavage tampon II maintenue à 37 ° C.</li>
	<li>Diapositive de préparer deux pots de lavage : une avec 70 mL d’acétonitrile et une stabilisation de 70 mL et solution de séchage, garder les deux dans une hotte de laboratoire à température ambiante (voir Table des matières).</li>
	<li>Sortir de la chambre de l’hybridation du four et retirez les attaches de la chambre et la couverture.</li>
	<li>Déplacer le microarray chip et le joint de glissent dans un plat à laver diapositive avec tampon de lavage j’ai et séparent la puce de la diapositive de couverture.</li>
	<li>Déplacer le microarray chip pour le deuxième lavage diapositive plat avec tampon de lavage j’ai et doucement faire circuler la solution avec une barre de remuer sur une plaque d’agitation magnétique à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Transfert le microarray chip à la diapositive troisième lavage vaisselle avec du tampon de lavage préchauffé II et laver délicatement avec une barre de remuer sur une plaque d’agitation magnétique à 37 ° C pendant 1 min.</li>
	<li>La puce de microarray de transfert à une diapositive lavé récipient avec de l’acétonitrile dans une hotte aspirante et laver pendant 30 s.</li>
	<li>La puce de microarray de transfert à une diapositive jar avec stabilisation de lavage et de séchage solution et laver pendant 30 s.</li>
	<li>Retirez la puce lentement et sécher pendant 1 min.</li>
	<li>Scan la puce « microarray » à l’aide d’un scanner (voir Table des matières), moins de 2 µm de résolution. Définir les paramètres pour enregistrer plusieurs images et tout les scans de diapos. Régler les canaux 1 et 2 des gains à 100 % et annuler le gain auto.</li>
</ol> 5. Analyse de données HGC <ol><li>extrait la fluorescence Cy3 et Cy5 intensités pour chaque sonde sur le tableau à l’aide du logiciel de numérisation (voir Table des matières).</li>
	<li>Analyse de segmentation d’utilisation du logiciel pour détecter les variations nombre de copie (CNV) entre l’échantillon ADN et l’ADN de référence. Utilisez un seuil des segment moyen journal 2 échantillon/référence ratio ± 2,5 écarts-types pour déterminer la CNV.</li>
	<li>Inspecter la distribution des rapports de journal 2 échantillon/référence au sein du génome entier à l’aide d’un logiciel de cartographie de signal (voir Table des matières).</li>
</ol>

<ol><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genome+release+%28version+Mt4.0%29+for+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312(2014).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+H+%22Floriculture%2C+Ornamental+and+Plant+Biotechnology%3A+Advances+and+Topical+Issues%22">Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues</a>. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+components+of+the+ethylene-response+pathway+identified+in+a+screen+for+weak+ethylene-insensitive+mutants+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).</li>
<li>Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RGA+gene+encodes+a+transcriptional+regulator+repressing+the+gibberellin+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway.</a> Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).</li>
<li>Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleteagene%3A+a+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+gene+knockout+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants.</a> Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).</li>
<li>Bolon, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+genomic+analyses+of+a+fast+neutron+mutant+population+resource+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean.</a> Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).</li>
<li>Men, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43443373_Fast_Neutron_Mutagenesis_of_Soybean_Glycine_soja_L_Produces_a_Supernodulating_Mutant_Containing_a_Large_Deletion_in_Linkage_Group_H">Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H.</a> Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).</li>
<li>Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+deficiency+caused+by+fast+neutron+mutagenesis+of+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus.</a> J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+reverse+genetics+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants.</a> Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).</li>
<li>Bourcy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+DNF2+is+a+PI-PLC-XD-containing+protein+required+for+bacteroid+persistence+and+prevention+of+nodule+early+senescence+and+defense-like+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+phytol%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions.</a> New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dissected+leaf+morphology+by+a+Cys%282%29His%282%29+zinc+finger+transcription+factor+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).</li>
<li>Ge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+seed+size+and+quality+by+manipulating+BIG+SEEDS1+in+legume+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).</li>
<li>Kalo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+signaling+in+legumes+requires+NSP2%2C+a+member+of+the+GRAS+family+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators.</a> Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).</li>
<li>Oldroyd, G. E., Long, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nodulation-signaling+pathway+2%2C+a+gene+of+Medicago+truncatula+involved+in+Nod+actor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling.</a> Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+compound+leaf+development+in+Medicago+truncatula+by+fused+compound+leaf1%2C+a+class+M+KNOX+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene.</a> Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).</li>
<li>Tsujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+TOBAMOVIRUS+MULTIPLICATION+%28TOM%29+2+locus+encodes+a+transmembrane+protein+that+interacts+with+TOM1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1.</a> EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nodule-specific+protein+secretory+pathway+required+for+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis.</a> Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).</li>
<li>Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+array-based+comparative+genomic+hybridization+to+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics.</a> J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).</li>
<li>Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+shapes+genome-wide+patterns+of+copy-number+polymorphism+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster.</a> Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).</li>
<li>Gong, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+rapid+cloning+of+an+ion+accumulation+deletion+mutant+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).</li>
<li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+functional+impact+of+DNA+copy+number+variation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat.</a> Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).</li>
<li>Haun, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li>
<li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li>
<li>Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+%28oaCGH%29+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402(2007).</li>
<li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis%3A+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li>
<li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development%3A+Gene+identification+by+transcript-based+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li>
<li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381(2008).</li>
<li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expression+arrays+for+copy+number+detection%3A+an+example+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).</li>
<li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li>
<li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+esn1+defines+a+genetic+locus+involved+in+nodule+senescence+and+symbiotic+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation.</a> Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).</li>
<li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li>
<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Nous avons développé une plate-forme CGH array pour la détection et la caractérisation du bombardement de neutrons rapides (FNB)-induite des mutants chez M. truncatula CV Jemalong A17. Pour illustrer l’utilisation du tableau méthode CGH dans la détection des mutations du gène, nous avons réalisé aCGH analyse du mutant FN6191, qui présentaient un phénotype hyper nodulation contrairement aux plantes de type sauvage, lorsqu’ils sont inoculés avec S. meliloti Sm1021. Pour l’analyse de la segmentation, un se...

Légumineuses (Fabaceae) sont la troisième plus grande famille de plantes dicotylédones, avec de nombreuses espèces économiquement importantes telles que le soja (Glycine max) et de la luzerne (Medicago sativa). Plantes légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol fixatrices d’azote, généralement appelées Rhizobia pour développer des nodules racinaires où le diazote atmosphérique est réduit à l’ammoniaque pour utilisation par la plante-hôte. Ainsi, la culture des légumineuses nécessite peu d’apport d’engrais azotés et contribue ainsi à une agriculture durable. Les cultures de légumineuses produisent des feuilles et les graines à haute teneur en protéines, servant d’excellents fourrages et de céréales. Cependant, les espèces de légumineuses cultivées ont généralement des structures génome complexe, faisant des études fonctionnelles des gènes qui jouent un rôle clé dans les processus de légumineuses spécifiques encombrants. Medicago truncatula a été largement adopté comme espèce modèle pour des études de légumineuse essentiellement parce que (1) il possède un génome diploïde avec une taille de génome haploïde relativement faible (~ 550 Mbp) ; (2) plantes peuvent être stablement transformés pour des études fonctionnelles de gène ; et (3), il est étroitement lié à la luzerne (M. sativa), la Reine des plantes fourragères et de nombreuses autres cultures d’importance économique pour études translationnelles. Récemment, la séquence du génome de M. truncatula cv Jemalong A17 a été libéré1,2. Annotation du génome montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes prédits ou modèles de gène dans le génome. Pour déterminer la fonction de la plupart des gènes chez le M. truncatula génome est une tâche difficile. Afin de faciliter les études fonctionnelles des gènes, une vaste collection de mutants de l’ordre de plus 150 000 lignes de1 M a été générée à l’aide de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Neutrons rapides, mutagène haute énergie d’ionisation, a été utilisé dans la génération de mutants chez de nombreuses espèces végétales dont Arabidopsis5,6,7de riz (Oryza sativa), tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, orge (Hordeum vulgare) et Lotus japonicus10. Une grande partie des mutations dérivé de mutagenèse FNB résultent de destructions d’ADN qui varient en taille de quelques paires de bases au mega paires de bases9,11. De nombreux gènes associés à phénotype ont été correctement identifié et caractérisé les4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. auparavant, le clonage moléculaire des gènes sous-jacents des mutants de la FNB s’est fondé sur une approche axée sur la carte, ce qui prend du temps et limite le nombre de mutants à être caractérisée au niveau moléculaire. Récemment, plusieurs approches complémentaires y compris des méthodes axées sur la transcription, génome revêtement basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) pour la détection de variation numéro copie l’ADN et le séquençage du génome entier, ont été employée pour faciliter la caractérisation de mutants de délétion dans divers organismes, y compris les animaux et les plantes20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Afin de faciliter la caractérisation de mutants FNB chez M. truncatula, une génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) plate-forme a été développée et validée. Tel que rapporté dans les systèmes animaux, la plate-forme CGH array permet de détecter des variations nombre de copie (CNV) au niveau du génome chez les mutants FNB M. truncatula . En outre, des lésions peuvent être confirmées par PCR et frontières de suppression peuvent être identifiés par séquençage. Dans l’ensemble, la plate-forme CGH array est un outil efficace pour identifier les lésions chez les mutants FNB M. truncatula . Ici, la procédure CGH array et la caractérisation de la PCR des frontières de suppression dans un mutant FNB M. truncatula sont illustrées.
Le protocole suivant donne les étapes expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à réaliser l’analyse du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) du nombre de copies variations dans les plantes. À titre d’exemple, Medicago truncatula FN6191 mutant a été utilisé pour identifier les régions de suppression et de gènes candidats associées aux phénotypes mutants. M. truncatula FN6191 mutant, isolé à l’origine d’un neutron rapide suppression induite par le bombardement mutant collection32 (voir Table des matières), présentaient un phénotype hyper nodulation après inoculation avec le sol bactérie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, contrairement aux plantes de type sauvage.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula réseau génomique, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td><td>Maison</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (référence)</td><td>Maison</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag Kit de marquage ADN</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Amorce aléatoire</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Solution de stabilisation et de séchage</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Kit d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’étanchéité de la chambre d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 et 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’hybridation, acier inoxydable</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de purification</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Scanner laser</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Carte</td><td>des signaux 5225035001</td><td></td>Nimblegen</tr><tr><td>1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>Signalmap1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre variations chez les mutants induite par neutrons rapides medicago truncatula

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Les mutants sont inestimables ressources génétiques pour les études de fonction de gènes. Pour générer des collections de mutants, trois types d’agents mutagènes peuvent être utilisés, y compris biologiques telles que l’ADN-T ou transposon, chimique notamment le méthanesulfonate d’éthyle (EMS), ou physique comme le rayonnement de l’ionisation. Le type de mutation observée varie selon le mutagène utilisé. Des mutants de rayonnement induit par ionisation, mutations incluent délétion, duplication ou réarrangement. T-DNA ou mutagenèse axée sur le transposon est limitée aux espèces qui sont sensibles à la transformation, mutagenèse chimique ou physique peut être appliquée à une vaste gamme d’espèces. Cependant, la caractérisation des mutations dérivé de mutagenèse chimique ou physique traditionnellement repose sur une approche de clonage positionnel, qui est le travail intensif et beaucoup de temps. Ici, nous montrons qu’une plate-forme de basées sur l’hybridation génomique comparative (aCGH) haute densité génome peut être appliquée pour efficacement détecter et caractériser les variations numéros copie (CNV) chez les mutants dérivés de mutagénèse de bombardement (FNB) de neutrons rapides dans Medicago truncatula, une espèce de légumineuse. Le séquençage du génome entier montre qu’il n’y a plus de 50 000 gènes ou modèles de gènes chez le M. truncatula. À présents, induite par le FNB mutants chez le M. truncatula proviennent de plus de 150 000 lignes M1, ce qui représente de précieuses ressources génétiques pour l’étude fonctionnelle de gènes dans le génome. La plate-forme aCGH décrite ici est un outil efficace pour la caractérisation des mutants induite par le FNB chez le M. truncatula.

La figure 2 montre la répartition des ratios2 journal normalisée du mutant contre WT signaux au sein du génome entier. Analyse des données CGH a révélé une approximation annoté de 22KO délétion sur le chromosome 4 qui englobe l' ensemble du gène SUNN 33 et plusieurs autres gènes chez le mutant FN6191 (Figure 2, Figure 3). La région candidate portait 73 sond...

Ce protocole donne des mesures expérimentales de réactifs, équipements et outils d’analyse pour les chercheurs qui s’intéressent à effectuer du génome entier basées sur l’hybridation génomique comparative (CGH) analyse des variations numéros de copie plantes.

Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

L’objectif global de ce protocole d’hybridation génomique comparative basé sur une puce est d’identifier rapidement les variations du nombre de copies dans les mutants induits par le bombardement de neutrons rapides de la légumineuse Medicago truncatula. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des légumineuses. Par exemple, faciliter l’identification des empathogènes sur les sites bas impliqués dans la régulation du développement des nodules chez les légumineuses.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est de la plus haute réputation et sensible à la détection des variations du nombre de copies telles que les mutations de délétion dans les mutants de bombardement de neutrons de la légumineuse Medicago truncatula. La démonstration de cette procédure sera faite par moi-même et Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows du Laboratoire de génétique. Congelez rapidement un gramme de tissu de jeunes feuilles prélevé sur des plantes uniques dans de l’azote liquide.Ensuite, utilisez un mortier et un pilon et broyez le tissu foliaire congelé en poudre fine dans l’azote liquide. Extrayez les échantillons d’ADN génomique de type sauvage et mutant de la poudre fine à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN. Utilisez des tubes à centrifuger de 500 microlitres pour diluer un microgramme de chaque ADN génomique sauvage et mutant avec de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 20 microlitres.Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’amorce aléatoire dans les tubes à centrifuger. Vortex rapidement les tubes, et après une rotation rapide, placez-les dans un thermocycleur pendant 10 minutes pour dénaturer les échantillons d’ADN à 98 degrés Celsius. Au bout de 10 minutes, retirez les tubes du thermocycleur et placez-les instantanément sur de l’eau glacée pendant cinq minutes.Ensuite, préparez deux mélanges d’étiquetage et ajoutez 25 microlitres de mélange d’étiquetage en un et deux dans les tubes d’ADN de type sauvage et mutant respectivement. Pipetez l’ADN et le mélange d’étiquetage trois fois, puis faites tourner brièvement les tubes. Après l’essorage, incubez les tubes dans le thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour inactiver l’enzyme exo Klenow.Ensuite, ajoutez 430 microlitres de tampon One X TE et mélangez le contenu dans chaque tube. Ensuite, faites tourner brièvement les tubes et transférez la solution dans les tubes dans des colonnes de purification avec des tubes de collecte de deux millilitres. Centrifugez les colonnes de purification à 14 000 fois G pendant 10 minutes et jetez le flux.Ajoutez 480 microlitres de One X TE Buffer dans chaque colonne, puis centrifugez à nouveau à 14 000 fois G pendant 10 minutes. Jetez le flux. Transférez chacun des ADN marqués de type sauvage et mutant du bas de la colonne dans de nouveaux tubes à centrifuger.Après avoir mesuré le volume de chacun des ADN marqués à l’aide de la pipette, ajustez le volume final à 80 microlitres avec un tampon One X TE, puis mesurez la concentration des ADN marqués dans un spectrophotomètre. Ensuite, mélangez des volumes équivalents d’ADN mutants et de type sauvage pour hybrider les sondes sur une puce de micro-réseau pour une hybridation comparative. Portez le volume final à 160 microlitres avec One X TE Buffer.Ensuite, préparez la solution d’hybridation et pipetez-la trois fois pour bien mélanger trois agents avec de l’ADN mélangé. Après avoir brièvement fait tourner les tubes, incubez-les dans un thermocycleur à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes et à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. N’oubliez pas de régler la température à 67 degrés Celsius pour préchauffer le four d’hybridation quatre heures avant l’hybridation.Ensuite, placez une glissière d’étanchéité sur la base de la chambre d’hybridation et chargez-y 490 microlitres de solution d’hybridation après 20 minutes d’incubation à 37 degrés Celsius dans le thermocycleur. Pour former la chambre d’hybridation, couvrez la lame d’étanchéité avec la puce de micro-réseau de génome de Medicago truncatula, puis couvrez la chambre d’hybridation et serrez-la solidement avec les pinces. Incuber la chambre d’hybridation assemblée dans le four d’hybridation à 67 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures.Pendant ce temps, préparez deux diapositives de vaisselle avec 250 millilitres de Washing Buffer One maintenu à température ambiante. Ensuite, faites une glissière pour laver la vaisselle avec le tampon de lavage deux maintenu à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez un pot de lavage de lames avec 70 millilitres d’acétonitrile et un autre pot de lavage de lames avec 70 millilitres de solution de stabilisation et d’étirage.Placez les deux bocaux de lavage des lames dans une hotte à température ambiante. Après l’incubation, retirez la chambre d’hybridation du four d’hybridation et desserrez les pinces de la chambre pour ouvrir le couvercle. Ensuite, retirez la puce du micro-réseau dans la glissière du joint et placez-les sur la vaisselle de lavage de la glissière avec Wash Buffer One.Isolez la puce de la puce de la glissière de couverture. Ensuite, transférez la puce du microréseau sur la deuxième lame de lavage de la vaisselle avec Wash Buffer One. À l’aide d’une barre d’agitation, remuez doucement la solution sur une plaque d’agitation magnétique à température ambiante pendant cinq minutes.Placez la puce du microréseau sur la glissière avec le tampon de lavage deux préchauffé, puis remuez avec la barre d’agitation pour laver la solution à 37 degrés Celsius pendant une minute. Retirez la puce du micro-réseau et placez-la dans le pot de lavage à lames contenant de l’acétonitrile dans une hotte pour laver pendant 30 secondes. Transférez la puce de micro-réseau dans le bocal de lavage de lames avec une solution de stabilisation et de séchage et lavez à nouveau pendant 30 secondes.Retirez délicatement les copeaux et séchez-les pendant une minute à l’intérieur de la hotte. Numérisez la puce du microréseau à l’aide d’un scanner sous une résolution de deux micromètres. Un logiciel de cartographie des signaux a été utilisé comme interface pour analyser la distribution des rapports logarithmes normalisés des signaux de type mutant par rapport aux signaux de type sauvage sur huit chromosomes.Pour les suppressions présumées, la valeur du rapport logarithmique deux égale ou inférieure à moins deux virgule cinq écart-type est prise en compte. L’analyse de segmentation du logiciel montre une région de délétion estimée à 22 kilobases sur le chromosome quatre montré dans le graphique. L’analyse des limites de délétion flanquées des sondes de microréseaux montre un rapport logarithmique moyen normalisé réduit.Le graphique montre également six autres gènes annotés, y compris le gène fils englobant la région supprimée. Le gène Son est responsable du contrôle de la nodulation chez Metecago truncatula. Ensuite, l’amplification PCR effectuée pour confirmer les limites de délétion montre un produit d’un point cinq kilobase amplifié à partir du mutant FN6191, mais pas dans le type sauvage.Le séquençage de l’ADN a été effectué pour montrer la jonction de délétion chez le mutant FN6191 montré dans la flèche noire. Un séquençage a également été effectué pour confirmer l’emplacement des bordures de suppression. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en 72 heures si elle est exécutée correctement.Pour obtenir des données de haute qualité, n’oubliez pas de maintenir la concentration d’ozone à un faible niveau dans la pièce où la procédure est effectuée. À la suite de cette procédure, d’autres mesures telles que les réactions en chaîne par polymérase de tout le séquençage du génome peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la taille et les variations du nombre de copies dans le génome. L’événement et la validation de cette technique ont ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la variation du nombre de copies qu’ils induisent chez les mutants et les variantes naturelles chez les espèces végétales qui ne se prêtent pas à la mutagenèse insertionnelle telles que Garden P. N’oubliez pas que travailler avec de l’acétonitrile, une solution de stabilisation et de séchage peut être extrêmement dangereux.Des précautions, telles que le port d’une protection oculaire, éviter tout contact direct avec les agents et travailler prudemment sont absolument essentielles.

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Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

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