Haute résolution spatio-temporelle d'analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et d’analyser leur emplacement, leur mouvement et leur association dynamique en complexes supramoléculaires. Ceci est réalisé en exprimant des récepteurs marqués snap à de très faibles niveaux à la surface des cellules vivantes et en les marquant avec des fluorophores organiques brillants pour permettre la détection d’une seule molécule. Dans un deuxième temps, les cellules sont visualisées par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, ce qui permet d’acquérir une séquence d’image rapide des particules réceptrices individuelles se déplaçant à la surface de la cellule.

Ensuite, des algorithmes automatisés de détection et de suivi sont appliqués à la séquence d’images afin d’obtenir la position et l’intensité de chaque particule réceptrice au fil du temps. On obtient des résultats qui montrent une analyse précise de la taille des complexes récepteurs, dans cet exemple, des récepteurs bêta deux adrénergiques basés sur un ajustement gaussien mixte de la distribution d’intensité des particules au début de la séquence d’images. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que la façon dont nos récepteurs s’organisent dans certains domaines de la surface des cellules vivantes.

Comment interagissent-ils les uns avec les autres pour former des dimères et des oligomères, et comment se déroulent réellement les événements dynamiques à la base de la signalisation des récepteurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes biochimiques et de microscopie standard est qu’elle étudie le comportement de récepteurs uniques dans l’environnement naturel, ce qui nous permet d’étudier des aspects importants qui sont généralement cachés dans les mesures d’ensemble. Les lamelles de recouvrement des échantillons doivent être nettoyées en profondeur pour minimiser la fluorescence de fond. Pendant l’imagerie, utilisez une pince à épiler propre pour placer un diamètre de 24 millimètres.

Le couvercle en verre se glisse dans un porte-couvercle qui sépare les différents couvercles. Mettez le support avec les lamelles dans un bécher et ajoutez du chloroforme jusqu’à ce que les lamelles soient couvertes. Couvrez le bécher avec du papier d’aluminium pour réduire l’évaporation et sonicate dans un bain.

Sonicate pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, sortez le porte-couvercle du bécher et laissez sécher les lamelles. Ensuite, placez le support avec les lamelles dans un autre bécher et ajoutez une solution d’hydroxyde de sodium à cinq molaires jusqu’à ce que les lamelles soient recouvertes.

Comme précédemment, couvrez le bécher d’une feuille d’aluminium et d’un sonicate pendant une heure à température ambiante, transférez le porte-couvercle dans un nouveau bécher et lavez-le trois fois à l’eau distillée. Enfin, placez les lamelles nettoyées dans une boîte de culture cellulaire en verre remplie d’éthanol à 100 %. On voit ici des lamelles de recouvrement avant et après le nettoyage, imagées par fluorescence à réflexion interne totale ou microscopie sur gazon.

Les échantillons d’étalonnage Cal sont utilisés pour estimer l’intensité des molécules fluorescentes uniques pendant la microscopie du gazon. Pour préparer les échantillons, dissolvez le colorant fluorescent dans le solvant approprié. Préparez une dilution en série d’une à 10 du colorant fluorescent allant d’une molaire picamolaire à une molaire ano.

Dans l’eau stérilisée par filtre. Lavez les lamelles préalablement nettoyées en les transférant dans une boîte de culture cellulaire remplie d’eau stérilisée par filtre. Après cela, placez chaque lamelle dans un puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits et attendez qu’ils placent à sec 20 microlitres de chaque dilution de colorant fluorescent sur une lamelle distincte nettoyée.

Laissez la housse sécher sous une hotte stérile. Protégez les lamelles de la lumière et de la poussière jusqu’à leur utilisation avant la transfection. Préparez une plaque de culture cellulaire à six puits Lavez les lamelles nettoyées avec du PBS stérile et placez une lamelle dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire à six puits.

Les cellules CHO à transfecter pour cette étude sont cultivées à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 dans un mélange de nutriments ECCO modifié Eagle Medium F 12 complété par 10 % de sérum bovin fœtal, de pénicilline et de streptomycine après trypsine et en comptant les cellules selon les méthodes standard, ensemencer à une densité de trois fois 10 à la cinquième cellule par puits. Dans la plaque de culture cellulaire du sixième puits contenant les lamelles de couverture, laissez les cellules se développer dans un incubateur pendant 24 heures afin d’atteindre une fluidité d’environ 80 %, ce qui correspond à la densité cellulaire optimale. Pour la transfection.

L’aspect le plus difficile de ce protocole est d’obtenir un niveau d’expression extrêmement faible des récepteurs membranaires à la surface de la cellule pour assurer le succès. La condition de transfection. Par exemple, la quantité de médias positifs NA et le temps après la transfection doivent être optimisés le jour de la transfection.

Préparez les réactifs de transfection pour chaque volonté de diluer deux microgrammes de l’ADN plaid souhaité dans 500 microlitres de milieu optimal dans un autre tube. Pour chaque puits, diluez six microlitres de Lipectomy 2000 dans 500 microlitres de milieu Optum. Incuber les deux tubes à température ambiante pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, combinez les deux solutions dans un seul tube et mélangez pour obtenir un mélange de transfection. Incuber le mélange de transfection à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps, préparez les cellules CHO.

Après le deuxième lavage, remplacez le PBS par un millilitre par puits de milieu D-M-E-M-F 12 sans rouge de phénol complété par 10 % de FBS, mais sans antibiotiques. Ajoutez un millilitre du mélange de transfection, goutte à goutte dans chaque puits et balancez doucement la plaque d’avant en arrière pour assurer un mélange complet. Incuber à 37 degrés Celsius dans 5 %CO2 pendant deux à quatre heures avant de procéder immédiatement au marquage des protéines.

Pour commencer cette procédure, diluez un microlitre du dérivé conjugué de benzo guine fluoro quatre ou de la solution mère de fluoro four BG dans un millilitre de milieu D-M-E-M-F 12 complété par 10 % de FBS pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire. Récupérez les cellules transfectées de l’incubateur et lavez-les deux fois avec du PBS préchauffé. Remplacez le PBS par un millilitre d’une solution micromolaire de fluoro quatre BG et incubez à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO2 pendant 20 minutes.

Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du milieu D-M-E-M-F 12 complété par 10 % de FBS à chaque fois, suivi d’une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pince à épiler utilisée pour transférer des lamelles de recouvrement avec des cellules étiquetées dans une chambre d’imagerie. Laver deux fois avec 300 microlitres de tampon d’imagerie.

Ajoutez 300 microlitres de tampon d’imagerie frais et procédez immédiatement à l’acquisition des images d’imagerie. À l’aide d’un microscope sur gazon équipé d’un objectif à immersion dans l’huile, d’un objectif à haute ouverture numérique, de lasers appropriés, d’un dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons, d’une caméra et d’un incubateur, et d’un contrôle de la température. Réglez les paramètres de microscope souhaités, c’est-à-dire la ligne laser, le gazon, l’angle, la durée d’exposition, la fréquence d’images et le nombre d’images par film.

Mettez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 100 x du microscope. Placez la chambre d’imagerie avec les cellules marquées sur le porte-échantillon du microscope et faites la mise au point sur les cellules. Utilisation de l’éclairage en fond clair.

Passez à l’éclairage du gazon. Maintenez la puissance laser aussi faible que possible pour permettre la recherche de la cellule souhaitée, tout en minimisant le blanchiment photo. Sélectionnez la cellule souhaitée et affinez.

Ajustez la mise au point. Augmentez la puissance du laser à un niveau qui permet de visualiser les quatre flores uniques. Acquérez une séquence d’images et enregistrez-la sous forme de fichier tiff pour l’étalonnage.

Assemblez chaque échantillon d’étalonnage dans la chambre d’imagerie et placez-le sur le microscope. Choisissez un échantillon contenant une diffraction bien séparée. Des taches limitées qui blanchissent en une seule étape.

Les séquences d’images de gazon sont ensuite acquises de la même manière que celle démontrée pour les cellules marquées. Pour préparer une séquence d’images, utilisez un logiciel de traitement d’images tel que Image J pour recadrer les images. Enregistrez les images individuelles en tant qu’images TIFF distinctes dans un nouveau dossier indiquant le numéro d’image sur chaque image.

La détection et le suivi des particules sont effectués à l’aide d’un logiciel non commercial tel que U Track dans un environnement MATLAB. À partir de l’invite de commande MATLAB, tapez movie selector, GUI. Pour ouvrir l’interface de sélection de films, suivez les instructions pour créer une nouvelle base de données de films à partir des images séparées précédemment enregistrées.

Indiquez la taille des pixels en nanomètres, l’intervalle de temps en secondes, l’ouverture numérique, la profondeur de bits de la caméra et la longueur d’onde d’émission du fluorophore nécessaires à la détection et au suivi des particules. Enregistrez la base de données de films à partir de l’interface de sélection de films. Exécutez l’analyse en choisissant des particules uniques comme type d’objet.

Exécutez l’algorithme de détection, puis exécutez l’algorithme de suivi. Utilisez la routine de visionneuse de films contenue dans le package URAC pour visualiser les traces et vérifier la qualité de la détection et du suivi. Ouvrez le fichier de points MAT pour voir la position et l’amplitude des particules suivies à chaque image.

La taille des particules peut également être calculée à partir des données acquises. Voici la première image d’une séquence d’images typique d’une cellule transfectée avec des récepteurs bêta-deux adrénergiques marqués par enclenchement et marquée avec un dérivé de benzylguine conjugué à quatre fluoros. Les taches représentent des récepteurs uniques ou des complexes de récepteurs.

Un algorithme de détection est appliqué à la même séquence d’images et chaque particule détectée est indiquée par l’application d’un cercle bleu d’un algorithme de suivi. La même séquence d’images donne les trajectoires des particules individuelles indiquées en bleu. Les segments verts représentent les événements de fusion et les segments rouges représentent les événements de division.

Cette méthode capture également les événements dynamiques. Dans cet exemple, deux particules subissent une interaction transitoire, se déplacent ensemble sur plusieurs images et se divisent à nouveau. Les trajectoires des particules individuelles sont utilisées pour calculer leurs coefficients de diffusion.

Ce résultat représentatif montre que le récepteur bêta-deux adrénergique a une grande mobilité. Bien que le récepteur gaba B ait une mobilité limitée, la taille des complexes récepteurs peut être estimée avec précision en ajustant les distributions des intensités de particules avec un modèle gaussien mixte. Cette analyse peut également révéler la coexistence de monomères et de dimères.

Voici des exemples de blanchiment de particules de récepteur monomère en une étape et de blanchiment de particules de récepteur diamétralement en deux étapes. Ces procédures peuvent être étendues et adaptées pour fonctionner avec d’autres protéines de surface cellulaire, méthodes de nivellement et modèles cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un sommeil propre, comment obtenir de faibles niveaux d’expression et un marquage efficace avec des fluoros organiques brillants, ainsi que comment acquérir et analyser des images de gazon, qui représentent toutes les étapes clés pour une molécule unique réussie.