Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

L’objectif global de cette procédure est de mesurer simultanément le type de récepteur et la liaison et d’observer la signalisation calcique induite par la liaison sur une seule cellule. Ceci est accompli en isolant d’abord la biotine et en ajustant l’osmolarité des globules rouges humains ou GR pour les utiliser comme un transducteur de force ultra-sensible. La deuxième étape consiste à fonctionnaliser des billes de verre à l’échelle microscopique, ce qui comprend le nettoyage, la dilatation et l’enrobage de ligands.

Ensuite, les lymphocytes T sont isolés et incubés avec le colorant calcique moins de 2h00 du matin, ce qui permet d’observer la concentration intracellulaire des ions calcium. La dernière étape consiste à préparer les micro-pipettes dans la chambre expérimentale qui sont spécialement nécessaires à la configuration de l’expérience. En fin de compte, la sonde de force biomembranaire de fluorescence ou technique BFP est utilisée pour montrer l’adhésion d’une cellule à une bille recouverte d’un ligand, mesurer la cinétique de liaison du ligand du récepteur et, pendant ce temps, surveiller le niveau de calcium intracellulaire.

Cette technique est utile pour comprendre comment la force mécanique est détectée par les lymphocytes T via la reconnaissance des androgènes. L’un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la FBIP peut mesurer simultanément la cinétique de liaison du ligand du récepteur et une signalisation intracellulaire. Les parties difficiles de ce protocole comprennent la production manuelle de micro-trajectoires de pep des diamètres corrects, la collecte de cellules et d’abeilles avec des micro-PEP et l’assemblage de la sonde de force, qui peut échouer au début, bien qu’il n’ait pas pu être ici pour la démonstration de cette vidéo.

Le co-auteur Arnold G, qui a récemment terminé son doctorat dans mon laboratoire, a contribué de manière significative à la validation initiale de la fabrication du protocole FBAP. Prélever huit à 10 microlitres de sang à partir d’une piqûre au doigt et ajouter à un millilitre de bicarbonate de carbonate, tampon à jet de sortie vortex ou pipette le mélange et centrifuger pendant une minute à 900 G.Jeter le surnageant avant d’effectuer le tampon de bicarbonate de carbonate. Lavez une fois de plus.

Ensuite, mélangez 10 microlitres du pack de globules rouges résultant, 171 microlitres de tampon de bicarbonate et 1049 microlitres de biotine. solution de liaison PEG NHS et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. En utilisant les mêmes procédures de lavage avant de laver le mélange de globules rouges obtenu une fois avec un tampon de bicarbonate de carbonate, puis deux fois avec un tampon de 5 % de N.

Diluez ensuite la nystatine dans un tampon de 5 % en N. Pour obtenir une concentration finale de 40 microlitres par millilitre, mélangez cinq microlitres de globules rouges biotinylés avec 71,4 microlitres de solution de nystatine et incubez pendant une heure à zéro degré Celsius. Enfin, lavez les échantillons deux fois avec N deux 5 % tampon et conservez les globules rouges biotinylés avec N deux 5 % plus 0,5 % BSA dans le réfrigérateur, montez un morceau de micro-pipette de trois pouces sur l’extracteur de micro-pipette.

Cliquez sur le bouton de traction pour que le milieu du capillaire soit chauffé par la machine et que le capillaire soit tiré sur les deux extrémités pour faire deux capillaires aux pointes pointues, qui sont les pipettes brutes. Ensuite, montez une pipette brute sur le support de pipette de la micro-pipette Forge pour faire fondre la sphère de verre sur la forge. Insérez l’extrémité de la pipette brute à l’intérieur de la sphère de verre.

Refroidissez la sphère de verre et tirez sur la pipette brute pour la casser de l’extérieur, en laissant sa pointe à l’intérieur de la sphère. Répétez cette procédure jusqu’à ce que l’orifice de pointe souhaité soit obtenu pour construire la chambre de la cellule, d’abord coupée à 40 millimètres par 22 millimètres par 0,2 millimètre à l’aide d’un coupe-verre en deux morceaux de 40 millimètres par 11 millimètres par 0,2 millimètre. La chambre cellulaire est construite sur la base d’un support de chambre fait maison composé de deux morceaux de carrés métalliques et d’une poignée qui les relie ensemble.

À l’aide de la colle de grâce, fixez une lamelle sur le côté inférieur du support de chambre de manière à ce qu’elle relie les deux carrés métalliques. De même, collez l’autre lamelle sur la face supérieure, ce qui formera une chambre cellulaire de lamelle parallèle. Ensuite, à l’aide de la pipette, injectez 200 microlitres de tampon expérimental entre les deux lamelles.

Assurez-vous que le tampon se fixe aux deux caillouts. Tournez doucement et secouez la chambre pour laisser le tampon toucher les deux extrémités de la chambre. Ensuite, injectez soigneusement de l’huile minérale dans les deux côtés de la chambre, en flanquant la zone tampon expérimentale, scellant ainsi le tampon de l’air libre.

Les billes sont des cellules et des cibles situées respectivement dans les régions supérieure, moyenne et inférieure de la zone tampon. Pour commencer l’expérience BFP, allumez le microscope et la source lumineuse.

Placez la chambre sur la platine principale du microscope. L’étape suivante consiste à installer les trois micro-pipettes du BFP. La sonde à gauche sert à saisir A RBC.

L’objectif à droite est de saisir la cellule et l’assistant en bas à droite sert à saisir une perle à installer, utilisez un micro-injecteur pour remplir une micro pipette avec un tampon expérimental. Retirez la micro-pipette du porte-pipette et maintenez-la à un endroit plus bas pour permettre au liquide de s’écouler de la pointe. Insérez rapidement la micro-pipette dans l’embout du support, en vous assurant qu’aucune bulle d’air ne pénètre dans la micro-pipette.

Pendant l’insertion, serrez la vis du support, puis montez chaque support de pipette sur son micromanipulateur correspondant. Poussez la micropipette vers la chambre de manière à ce que ses pointes pénètrent dans la zone tampon de la chambre. Ajustez la position de la micropipette et trouvez-la dans le champ de vision du microscope.

Déplacez-vous dans l’étape du porte-chambre pour trouver les colonies des trois éléments. Une par une, ajustez la position de la micro pipette correspondante en tournant les boutons des manipulateurs pour laisser la pointe de la micro pipette s’approcher d’une cellule ou d’une bille, aspirez la cellule ou la bille. En ajustant la pression à l’intérieur de la micro-pipette correspondante, les trois micro-pipettes captureront leurs éléments correspondants.

Déplacez-vous autour de l’étage du support de chambre pour trouver un espace ouvert loin des colonies des éléments injectés où l’expérience sera réalisée. Basculez le mode visuel du microscope pour visualiser l’image sur le programme informatique. Déplacez les trois éléments sur les pointes de la pipette dans le champ de vision du programme.

Ensuite, alignez le cordon de la sonde et le RBC et manœuvrez soigneusement le cordon de la sonde jusqu’au sommet du RBC. Maintenant, enfoncez brièvement la perle sur le RBC et rétractez-la doucement, ajustez la pression de la micropipette auxiliaire pour souffler doucement la perle afin qu’elle reste collée sur le sommet du RB. Éloignez la pipette auxiliaire et alignez la cible et la perle de sondage sur le programme.

Dans la fenêtre du champ de vision, utilisez les outils du programme pour mesurer les rayons respectifs de la micropipette de la sonde, du RBC et de la surface de contact circulaire entre le RBC et la perle de la sonde. Ces valeurs permettent d’estimer la constante de ressort du RBC par l’équation énumérée dans le protocole de texte. Après avoir entré la constante de ressort RBC souhaitée dans le programme, tracez une ligne horizontale à travers le sommet de la RBC, ce qui donnera une courbe dans la fenêtre adjacente indiquant la luminosité de chaque pixel.

Le long de cette ligne, faites glisser la ligne de seuil pour qu’elle soit à environ la moitié de la profondeur de la courbe. Ensuite, sélectionnez le mode d’expérience souhaité, le test de fluctuation thermique, le test de fréquence d’adhésion ou le test de pince de force. Réglez les paramètres comme vous le souhaitez.

Cliquez sur démarrer, ce qui permet au programme de déplacer la pipette cible et d’entraîner la cible dans et hors du contact avec la sonde, la collecte de données sera effectuée et parallèle, ce qui enregistre la position de la perle pro en temps réel. Arrêtez le programme en cliquant sur le bouton arrêter l’expérience à partir de laquelle une fenêtre apparaîtra. Pour permettre l’enregistrement des données acquises à l’aide de la fonction de fluorescence du système BFP a allumé la source lumineuse d’excitation et la caméra de fluorescence, qui sont contrôlées par un programme séparé.

Sélectionnez ensuite les paramètres de l’imagerie de fluorescence, y compris le gain, l’exposition et les canaux d’excitation. Suivez toutes les préparations du protocole de l’expérience BFP, y compris l’alignement de la sonde et de la cible pour permettre la visualisation de l’image fluorescente en direct de la cellule cible qui est excitée par une lumière d’excitation de 340 nanomètres ou 380 nanomètres. Utilisez l’outil de sectionnement pour découper grossièrement la zone dans laquelle la cellule restera pendant toute la période d’enregistrement.

Ensuite, cliquez simultanément sur enregistrer et commencez à cliquer. L’enregistrement permet à une lumière de 340 nanomètres et de 380 nanomètres d’exciter alternativement la matrice de fluorescence intracellulaire. Une paire d’images de fluorescence correspondantes sera enregistrée alternativement, environ une fois par seconde.

En cliquant sur Démarrer, l’expérience BFP pour l’analyse de l’interaction moléculaire et l’expérience d’imagerie par fluorescence pour surveiller la signalisation calcique intracellulaire poursuit l’analyse des données comme décrit dans le protocole de texte. Dans les courbes de données brutes de force temporelle, la force est dérivée du suivi du changement de position de la perle pro. Dans un événement de non-adhésion, la force reviendra à zéro dans le signal temporel d’inversion de force après que la cellule cible est rétractée de la surface du talon.

À l’inverse, dans un événement de force de rupture, l’adhérence se manifestera par une élévation rapide de la force à un niveau positif lors de la rétraction, suivie d’une chute rapide à zéro. Dans un événement de la vie, la force positive sera serrée pour réaliser un plateau. La longueur du plateau est une éternité.

En répétant les cycles d’expériences VFP, une courbe force en fonction du temps sera dérivée. Voici les images fluorescentes de quelques ou deux cellules T chargées lors de l’excitation par des canaux de lumière de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Les deux images montrent des contours clairs de la cellule, indiquant que la cellule a été bien colorée Après que les données de cinétique de liaison et les données de fluorescence ont été dérivées d’une cellule T, la courbe de durée de vie cumulative et la courbe de niveau de calcium sont présentées dans la même figure pour trouver la corrélation entre elles.

Maintenant, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une expérience A-F-B-I-P. Au cours de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de vérifier s’il y a un défaut dans la sonde de force, comme le diamètre de la micropipette, la longueur de la projection de la cellule en caoutchouc et la position de la bille.

Tout cela affectera la précision de la mesure de la force. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie mécanique moléculaire pour étudier le mécanisme de transduction mécanique dans tous les systèmes biologiques possibles.