Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

L'objectif général de cette procédure est de mesurer simultanément la liaison aux récepteurs et d'observer la signalisation calcique induite par la liaison au niveau d'une cellule unique. Cela est réalisé en isolant d'abord la biotine et en ajustant l'osmolarité des globules rouges humains, ou GR, afin de les utiliser comme transducteur de force ultra-sensible. La deuxième étape consiste à fonctionnaliser des billes en verre de taille microscopique, ce qui inclut le nettoyage, la dilatation et le revêtement par un ligand.

Ensuite, les lymphocytes T sont isolés et incubés avec le colorant calcique Fluo-2 AM, ce qui permet d'observer la concentration intracellulaire en ions calcium. La dernière étape consiste à préparer les micropipettes dans la chambre expérimentale, spécialement requises pour le montage de l'expérience. Enfin, la technique de la sonde de force biomembranaire à fluorescence, ou BFP, est utilisée pour visualiser l'adhésion d'une cellule à une microbille revêtue de ligand, mesurer la cinétique de liaison récepteur-ligand, et simultanément surveiller le niveau de calcium intracellulaire.

Cette technique est utile pour comprendre comment la force mécanique est perçue par les lymphocytes T via la reconnaissance de l'androgène. Un avantage majeur de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la FBIP peut mesurer simultanément la cinétique de liaison récepteur-ligand et une signalisation intracellulaire. Les étapes délicates de ce protocole comprennent la production manuelle de micro pep paths aux diamètres appropriés, la manipulation des cellules et des bees à l’aide de micro PEPs, ainsi que l’assemblage de la sonde de force, qui peut échouer au départ, bien qu’il n’ait pas pu être présent pour la démonstration de cette vidéo.

Le coauteur Arnold G., qui a récemment terminé son doctorat dans mon laboratoire, a contribué de manière significative à la validation initiale de la fabrication du protocole FBAP. Prélevez huit à dix microlitres de sang par piqûre du doigt et ajoutez-les à un millilitre de tampon carbonique bicarbonique, laissez agiter sur vortex ou mélangez à l’aide d’une pipette, puis centrifugez pendant une minute à 900 ×g. Éliminez le surnageant avant d’effectuer le lavage avec le tampon carbonique bicarbonique. Lavez une fois de plus.

Ensuite, mélangez 10 microlitres du culot de GR obtenu avec 171 microlitres de tampon carbonate-bicarbonate et 1049 microlitres de biotine. Solution de lien PEG NHS et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. En utilisant les mêmes procédures de lavage qu'auparavant, lavez le mélange de GR obtenu une fois avec du tampon carbonate-bicarbonate, puis deux fois avec du N deux tampon à 5 %.

Ensuite, diluez la nystatine dans le tampon N deux 5 %. Pour obtenir une concentration finale de 40 microlitres par millilitre, mélangez cinq microlitres des globules rouges biotinylés avec 71,4 microlitres de solution de nystatine et incubez pendant une heure à zéro degré Celsius. Enfin, lavez les échantillons deux fois avec le tampon N deux 5 % et conservez les globules rouges biotinylés dans le tampon N deux 5 % contenant 0,5 % de BSA au réfrigérateur. Fixez un morceau de micropipette de trois pouces sur le tireur de micropipettes.

Cliquez sur le bouton de traction afin que le milieu du capillaire soit chauffé par la machine et que le capillaire soit étiré à ses deux extrémités pour former deux capillaires à extrémités pointues, qui constituent les pipettes brutes. Ensuite, fixez une pipette brute sur le porte-pipette du micro-four ; chauffez pour faire fondre la sphère de verre sur le four. Insérez l'extrémité de la pipette brute à l'intérieur de la sphère de verre.

Refroidir la sphère en verre et tirer la pipette brute pour la casser depuis l'extérieur, en laissant sa pointe à l'intérieur de la sphère. Répéter cette procédure jusqu'à l'obtention de l'orifice de pointe souhaité afin de construire la chambre à cellules, découpée initialement en un couvre-objet de 40 millimètres sur 22 millimètres sur 0,2 millimètre à l'aide d'un coupe-verre en deux morceaux de 40 millimètres sur 11 millimètres sur 0,2 millimètre. La chambre à cellules est construite sur la base d'un support de chambre maison composé de deux carrés métalliques et d'une poignée qui les relie ensemble.

À l'aide d'une colle de montage, fixez une lame couvre-objet sur la face inférieure du support de chambre de manière à ce qu'elle enjambe les deux carrés métalliques. De la même manière, collez l'autre lame couvre-objet sur la face supérieure, ce qui formera une chambre parallèle en lame couvre-objet. Ensuite, utilisez la pipette pour injecter 200 microlitres de tampon expérimental entre les deux lames couvre-objets.

Veillez à ce que le tampon adhère aux deux lamelles. Faites tourner et secouer doucement la chambre pour permettre au tampon de toucher les deux extrémités de la chambre. Ensuite, injectez soigneusement de l'huile minérale des deux côtés de la chambre, de part et d'autre de la zone tampon expérimentale, scellant ainsi le tampon de l'air ambiant.

Injectez des suspensions de billes prob. Les billes sont respectivement les bcs et les cibles dans les régions supérieure, médiane et inférieure de la zone tampon. Pour commencer l'expérience de BFP, allumez le microscope et la source lumineuse.

Placer la chambre sur la platine principale du microscope. L'étape suivante consiste à installer les trois micropipettes du BFP. La sonde située à gauche sert à saisir un GR.

La cible située à droite permet d'attraper la cellule, et l'outil auxiliaire en bas à droite sert à saisir une bille à installer. Utilisez un micro-injecteur pour remplir par l'arrière une micropipette avec le tampon expérimental. Retirez la micropipette du support de pipette et tenez-la plus bas afin de permettre à un liquide de goutter de l'extrémité. Insérez rapidement la micropipette dans l'embout du support, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air n'entre dans la micropipette.

Pendant l'insertion, serrez la vis du support, puis fixez chaque support de pipette sur son micromanipulateur correspondant. Avancez la micropipette vers la chambre afin que leurs extrémités pénètrent dans la zone tampon de la chambre. Ajustez la position de la micropipette et localisez-les dans le champ de vision du microscope.

Déplacez-vous sur la platine du support de chambre pour localiser les colonies des trois éléments. Un par un, ajustez la position de la micropipette correspondante en tournant les molettes des manipulateurs afin que la pointe de la micropipette s'approche d'une cellule ou d'une billette, puis aspirez la cellule ou la billette. En ajustant la pression à l'intérieur de chaque micropipette correspondante, les trois micropipettes captureront leurs éléments respectifs.

Déplacez le porte-chambre sur la platine afin de trouver un espace libre, éloigné des colonies des éléments injectés, où sera réalisée l'expérience. Passez en mode visuel au microscope pour visualiser l'image sur le logiciel de l'ordinateur. Déplacez les trois éléments présents sur les embouts de pipette dans le champ de vision du logiciel.

Ensuite, alignez la billette témoin et le GR, puis manoeuvrez soigneusement la billette témoin jusqu'à l'apex du GR. Appuyez brièvement la billette contre le GR, puis retirez-la délicatement et ajustez la pression de la micropipette auxiliaire pour souffler doucement la billette afin qu'elle reste collée à l'apex du GR. Éloignez la pipette auxiliaire, puis alignez la cible et la billette témoin dans le programme.

Dans la fenêtre du champ de vision, utilisez les outils du programme pour mesurer les rayons respectifs de la micropipette de sonde, des hématies et de la zone de contact circulaire entre l'hématie et la microbille de sonde. Ces valeurs permettent d'estimer la constante de raideur de l'hématie à l'aide de l'équation indiquée dans le protocole textuel. Après avoir saisi la constante de raideur souhaitée pour l'hématie dans le programme, tracez une ligne horizontale traversant l'apex de l'hématie, ce qui produira une courbe dans la fenêtre adjacente indiquant la luminosité de chaque pixel.

Sur cette ligne, faites glisser la ligne de seuil afin qu'elle se situe à environ la moitié de la profondeur de la courbe. Ensuite, sélectionnez le mode d'expérience souhaité : essai de fluctuation thermique, essai de fréquence d'adhésion ou essai de maintien de force. Réglez les paramètres selon vos besoins.

Cliquez sur démarrer, ce qui permet au programme de déplacer la pipette cible et de faire entrer et sortir la cible en contact avec la sonde ; la collecte des données sera effectuée en parallèle, ce qui enregistre la position de la perle de la sonde en temps réel. Arrêtez le programme en cliquant sur le bouton arrêter l'expérience, moment auquel une fenêtre apparaîtra. Pour permettre l'enregistrement des données acquises, utilisez la fonction de fluorescence du système BFP : allumez la source de lumière d'excitation et la caméra de fluorescence, qui sont contrôlées par un programme distinct.

Ensuite, sélectionnez les paramètres pour l'imagerie de fluorescence, y compris le gain, l'exposition et les canaux d'excitation. Suivez toutes les préparations décrites dans le protocole de l'expérience BFP, notamment l'alignement de la sonde et de la cible afin de permettre la visualisation en direct de l'image fluorescente de la cellule cible excitée par une lumière d'excitation de 340 nanomètres ou 380 nanomètres. Utilisez l'outil de sectionnement pour découper grossièrement la zone dans laquelle la cellule restera pendant toute la période d'enregistrement.

Ensuite, cliquez simultanément sur « enregistrement » et commencez à cliquer. L’enregistrement permet à une lumière de 340 nanomètres et de 380 nanomètres d’exciter alternativement le colorant fluorescent intracellulaire. Une paire d’images de fluorescence correspondantes sera enregistrée alternativement environ toutes les secondes.

Cliquer sur démarrer lance l'expérience BFP pour l'analyse de l'interaction moléculaire et l'expérience d'imagerie de fluorescence pour surveiller la signalisation calcique intracellulaire, puis procéder à l'analyse des données comme décrit dans le protocole textuel. Au fil du temps, les courbes de données brutes de force, la force est déduite du suivi du changement de position de la perle porteur. En l'absence d'événement d'adhésion, la force reviendra à zéro dans le signal temporel de retour de force après que la cellule cible a été retirée de la surface de la perle.

En revanche, lors d'un événement de force de rupture, l'adhésion se manifestera par une augmentation rapide de la force jusqu'à un niveau positif pendant la rétraction, suivie d'une chute rapide vers zéro. Dans un événement de durée de vie, la force positive sera maintenue constante afin de former un palier. La longueur du palier correspond à une durée de vie.

En répétant plusieurs cycles d'expériences de VFP, une courbe de la force en fonction du temps sera obtenue. On observe ici les images fluorescentes de quelques lymphocytes T, ou de deux lymphocytes T chargés, après excitation par des canaux lumineux de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Les deux images montrent des contours cellulaires nets, indiquant une bonne coloration de la cellule. Une fois les données de cinétique de liaison et les données de fluorescence obtenues à partir d'un lymphocyte T, la courbe de durée de vie cumulée et la courbe du niveau de calcium sont présentées sur la même figure afin d'établir la corrélation entre elles.

Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'expérience A-F-B-I-P. Au cours de cette procédure, il est important de vérifier s'il existe un défaut au niveau de la sonde de force, comme le diamètre de la micropipette, la longueur de la saillie en caoutchouc de la cellule ou la position de la bille.

Tout cela affectera la précision de la mesure de force. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie mécanique moléculaire pour étudier le mécanisme de transduction mécanique dans tous les systèmes biologiques possibles.