Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

L’objectif global de cette méthode d’imagerie par fluorescence est de surveiller les changements dans le trafic des protéines membranaires et la distribution intracellulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les changements dans le trafic des protéines, tels que l’effet des mutations génétiques ou des agents pharmacologiques sur le taux de libération des vésicules et l’expression des protéines à la surface des cellules. Le principal avantage de cette technique est que les mesures peuvent être effectuées rapidement, à haute résolution, en temps réel, sans détruire l’échantillon.

48 heures avant l’imagerie, les cellules du neuroblastome 2A de souris sont transfectées à l’aide d’une construction plasmidique contenant SEP, un fluorophore sensible au pH incorporé dans la région extracellulaire de la protéine d’intérêt. Lorsque les cellules transfectées sont prêtes pour l’imagerie, avec une microscopie à fluorescence à réflexion interne totale ou une microscopie TIRF, ajoutez deux millilitres de solution extracellulaire de pH 7,4 ou ECS aux cellules. Placez une parabole de cellules sur la platine de traduction et utilisez des supports de platine pour fixer la parabole en place.

En mode épifluorescence, focalisez le microscope et localisez les cellules transfectées par fluorescence. Les cellules resteront focalisées sur plusieurs plans de mise au point. Localisez des cellules uniques et isolées pour procéder à la gestion de la technologie TIRF.

Dans le programme d’imagerie, réglez le temps d’exposition à 200 millisecondes et optimisez l’intensité de fluorescence en réglant le gain EM. Faites passer le faisceau laser en TIRF en utilisant le moteur pas à pas pour déplacer le faisceau à travers l’objectif de manière progressive. À mesure que l’angle critique s’approche, le faisceau se déplace visiblement sur le bord de la parabole jusqu’à ce qu’il converge au point de réflexion interne totale sur le plan de l’échantillon, point auquel le faisceau n’est plus visible le long du bord de la parabole.

Vérifiez que les cellules sont en mode TIRF en ajustant le bouton de mise au point. Dans le cadre du TIRF, un seul plan de cellules peut être focalisé, produisant une image hautement définie avec une haute résolution de la membrane plasmique. Pour commencer cette procédure, localisez des cellules uniques transfectées saines dans le plan d’imagerie.

Acquérir une image focalisée des cellules à pH 7,4. Les récepteurs marqués SEP sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique doivent être visibles. Empêchez rapidement le faisceau laser d’atteindre l’échantillon pour éviter le photoblanchiment.

Utilisez un logiciel d’imagerie microscope capable d’enregistrer plusieurs emplacements XY pour enregistrer les positions de platine correspondant à chaque cellule. De cette façon, capturez des images de 20 à 30 cellules par parabole tout en utilisant le logiciel pour enregistrer la position de chaque cellule. Une fois que toutes les images cellulaires à pH 7,4 ont été collectées, retirez manuellement le SEC de pH 7,4 en pipetant sans toucher la parabole.

Ajoutez délicatement deux millilitres de pH 5,4 ECS dans le plat et attendez 10 minutes. Pendant ce temps, enregistrez les images précédemment acquises. Dans le même ensemble de conditions que celui utilisé pour collecter des images à pH 7,4, déplacez la platine vers chaque position enregistrée et acquérez une image de la même cellule à pH 5,4.

Les cellules devraient sembler moins définies puisque toute la fluorescence détectée provient de récepteurs marqués SEP confinés dans le réticulum endoplasmique. Enregistrez les images des cellules au pH 5,4. Pour imager les insertions de vésicules uniques, remplacez d’abord le milieu de croissance des cellules transfectées par deux millilitres de pH 7,4 ECS.

Ensuite, placez la boîte de cellules transfectées sur la platine du microscope et utilisez des supports de platine pour fixer la boîte en place. Focaliser une seule cellule dans TIRF comme démontré précédemment. Le cas échéant, réglez la mise au point automatique de manière à ce qu’elle ne dérive pas au cours de la période d’imagerie.

Enregistrez une série de 1 000 images en capturant des images en continu à une fréquence d’images de 200 millisecondes. Des éclats de fluorescence seront visibles pendant ce temps, correspondant à des vésicules de trafic de faible pH fusionnant avec la membrane plasmique, exposant le SEP au pH extracellulaire de 7,4. Pour commencer l’analyse de la fluorescence SEP afin de déterminer la localisation subcellulaire, ouvrez les images cellulaires à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images tel que ImageJ.

Soustrayez l’arrière-plan des images de pH 5,4 et de pH 7,4 à l’aide du réglage de la boule roulante. En utilisant le seuil basé sur l’intensité pour quantifier la fluorescence d’une seule cellule à pH 7,4, sélectionnez d’abord l’image, ajustez et seuilz. Sélectionnez ensuite manuellement une région d’intérêt autour de la cellule.

À l’aide de la fonction de mesure intégrée sous l’onglet Analyser, mesurez la surface de la cellule, l’intensité moyenne et la densité intégrée. Répétez ces mesures pour la même cellule à un pH de 5,4. Une fois que la densité intégrée est obtenue pour les images cellulaires à pH 7,4 et 5,4, calculez la densité intégrée de la membrane plasmique en soustrayant la valeur du pH 5,4 de la valeur du pH 7,4.

La différence correspond au nombre relatif de récepteurs sur la membrane plasmique dans la région d’excitation TIRF. Comme mesure du trafic, calculez le pourcentage relatif de récepteurs marqués SEP situés sur la membrane plasmique par rapport aux récepteurs restants visibles dans le volume d’excitation TIRF en divisant la densité intégrée de la membrane plasmique par la densité intégrée totale à pH 7,4, multipliée par 100. Pour analyser les événements d’insertion d’une seule vésicule, ouvrez la série de 1 000 images TIFF à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Soustrayez l’arrière-plan de toutes les images à l’aide du paramètre de boule roulante. Ajustez la balance des couleurs de l’enregistrement pour maximiser les régions intenses correspondant aux événements d’insertion de vésicules. Comptez manuellement les rafales de fluorescence d’une durée supérieure à trois images ou 600 millisecondes.

Cet exemple d’image cellulaire à pH 7,4 montre des récepteurs situés sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique. À pH 5,4, les récepteurs de la membrane plasmique ne sont pas fluorescents, de sorte que seuls les récepteurs résidents du réticulum endoplasmique sont visibles. La différence entre la densité intégrée de la fluorescence à pH 7,4 et pH 5,4 correspond à des récepteurs localisés à la membrane plasmique.

Les événements d’insertion d’une vésicule unique sont visualisés à un pH de 7,4 sous la forme d’une poussée de fluorescence au niveau de la membrane plasmique, d’une durée d’au moins 600 millisecondes. Immédiatement avant une insertion, il n’y a pas d’éclat perceptible. Une augmentation de l’intensité de la fluorescence est observée à l’arrivée d’une vésicule de transport portant SEP.

Les récepteurs marqués SEP diffusent ensuite à travers la membrane plasmique jusqu’à ce qu’ils soient indiscernables des récepteurs précédemment insérés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes par plat, si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les changements dans la distribution des protéines entre le RE périphérique et la membrane plasmique.