Name: Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie par fluorescence pour surveiller le trafic des protéines membranaires en temps réel. Cette technique utilise le pHluorin superecliptique et la microscopie TIRF sur des cellules neuroblastome de souris.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu en partie par le National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, le National Institute on Drug Abuse DA 038817 et le National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Culture cellulaire et transfection <ol><li> Maintenir le neuroblastome de souris 2a (N2a) , les cellules dans des milieux de croissance. <ol><li> Obtenir 500 ml de milieu de croissance N2a de 200 ml de milieu d&#39;Eagle selon Dulbecco (DMEM) riche en glucose avec 250 ml de sérum réduit support, 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline / streptomycine (100x). </li><li> Maintenir les cellules dans un flacon T75 à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Fractionner les cellules 1:15 lorsque cela est nécessaire, ou à environ 80-90% de confluence. Cela est généralement 2-3 fois par semaine. </li></ol></li><li> Coat 35 mm verre plat en bas de poly-D-lysine. <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, ajouter 200 ul de 0,1 ug / ml de poly-D-lysine sur du verre plat zone inférieure stérile de 35 mm. </li><li> Placez plat dans un incubateur à 37 ° pendant 1 heure. </li><li> Rincer soigneusement plat avec ddH 2 O 3-4 fois. </li><li> Laisser la vaisselle sécher complètement pendant plus de 1 h. </li><li> Steriliser plats en utilisant la lumière UV dans l&#39;enceinte de sécurité biologique si nécessaire. </li></ol></li><li> Plaque cellules N2a pour l&#39; imagerie TIRFM. <ol><li> Retirez le support de croissance à partir de cellules adhérentes. </li><li> Détacher les cellules du flacon par incubation avec 1 ml de 1 x trypsine (+ EDTA) pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Inactiver trypsine en ajoutant 9 ml de milieu de croissance. Mélanger les médias, la trypsine et les cellules détachées à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Visuellement compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et calculer le volume correct d&#39;ajouter 90.000 cellules à chaque verre enduit plat fond poly-D-lysine. Cette densité est nécessaire pour la transfection efficace et simple imagerie TIRF cellulaire. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de croissance à chaque plat à fond de verre contenant 90.000 cellules. </li><li> Incuber la boîte à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 16 à 24 heures. </li></ol></li><li> N2a transfection <ol><li> Obtenir un produit d&#39;assemblage de plasmide contenant un fluorophore incorporé septembredans la région extracellulaire de la protéine d&#39;intérêt. Des techniques de clonage standard , telles que l&#39; amplification par PCR 5 peuvent être utilisés pour générer la construction. NOTE: SEP doit être incorporé dans la région extracellulaire de la protéine membranaire de sorte qu&#39;il se trouve dans la lumière du reticulum endoplasmique ou le trafic des vésicules et est exposée à une solution extracellulaire lors de la membrane plasmique. Septembre est similaire en taille à la GFP et les stratégies de clonage similaires peuvent être utilisés. </li><li> Remplacer le milieu de croissance sur les cellules ensemencées avec 1,5 ml de milieu sérique réduite (par exemple, Opti-MEM), soit environ 30 minutes avant l&#39;addition du réactif de transfection. REMARQUE: Pour étudier les changements de drogue induite dans les récepteurs, une concentration appropriée de médicament peut être ajouté au moment de la transfection. </li><li> Ajouter 500 ng de chaque plasmide souhaité construire à 250 pi réduite médias de sérum (tube 1). </li><li> Ajouter 2 ul du réactif de transfection dans un tube séparé contenant 250 ul de milieu de sérum réduit. Incuber tube 2 à la température ambiante pendant 5 min. Le rapport du réactif de transfection à l&#39;ADN plasmidique doit être optimisé pour exprimer chaque protéine d&#39;intérêt. </li><li> Combinez tubes 1 et 2 pour obtenir une solution contenant 500 pi de réactif de transfection et le plasmide mélange. Incuber à température ambiante pendant 25 min. </li><li> Ajouter les cellules pré-métallisés 500 ul transfection mélange pour un volume total de 2 ml par boîte. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 24 heures. </li><li> Après 24 heures, retirer le mélange de transfection et rincer les cellules avec un milieu de croissance, puis ajouter 2 ml de milieu de croissance à chaque plat. REMARQUE: si un médicament a été ajouté au moment de la transfection, elle peut être réapprovisionnée à nouveau à cette étape. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 24 heures. </li><li> cellules d&#39;image 48 h après la transfection. </li></ol></li></ol> 2. imagerie de cellules vivantes par Total EnRéflexion externe Fluorescence Microscopy (TIRFM) <ol><li> Mise en place d&#39; imagerie <ol><li> Réaliser une imagerie avec un microscope à fluorescence inversé mis en place avec une étape de balayage tel que représenté sur la figure 1. Ceci requiert un alignement d&#39;une source laser à SSAD 488 nm, un moteur pas à pas pour ajuster la position du faisceau 488 nm et une ouverture numérique (NA 1,49) 60X ou 100X objectif à immersion d&#39;huile. </li><li> Passez le faisceau laser à travers le filtre d&#39;excitation appropriée (bande passante 488/10 nm). Aligner le faisceau laser polarisé à travers une fibre optique monomode reliée à un lanceur monté sur un moteur pas à pas. En mode épifluorescence, le faisceau d&#39;excitation est centré au milieu de l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif. </li><li> Pour atteindre FRBR, utilisez le moteur pas à pas pour traduire le faisceau laser focalisé sur l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif jusqu&#39;à ce que l&#39;angle critique est atteinte et le faisceau est plus transmis à travers l&#39;échantillon et est plutôt totalement réfléchi sur le verre-cell &#39;interface. </li><li> Capture d&#39;images en utilisant un EMCCD (512 x 512 pixels) contrôlé avec le logiciel d&#39;imagerie (par exemple Metamorph) avec le filtre d&#39;émission approprié monté dans la voie d&#39;émission (525/50 nm). </li></ol></li><li> Préparer la solution d&#39;imagerie <ol><li> Préparer 200 ml d&#39;une solution extracellulaire (ECS) en mélangeant 150 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM et 10 mM de glucose dans ddH 2 O. solutions mères de NaCl, KCl, MgCl 2, et CaCl 2 peut être préparé à l&#39; avance et combiné avec de l&#39; HEPES et du glucose frais le jour de l&#39; imagerie. </li><li> Ajuster le pH d&#39;une solution contenant 100 ml d&#39;ECS à un pH de 7,4. Ajustez les 100 ml restants de ECS à un pH de 5,4. Rincer les cellules transfectées avec 2 ml d&#39;ECS (pH 7,4). </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;ECS (pH 7,4) pour les cellules transfectées avant l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Imagerie cellulaire Live in FRBR <ol><li> Allumez l&#39;ensemble du système, including 488 nm laser, appareil photo, le stade de la traduction, et le programme d&#39;imagerie. Concentrez le faisceau épifluorescence et ajuster la puissance à environ 1 mW à l&#39;objectif 60X. </li><li> Ajouter l&#39;huile à l&#39;objectif et placer un plat de cellules transfectées sur la scène de la traduction. Fixer le plat en place en utilisant les montures de scène pour assurer qu&#39;il ne bouge pas par rapport à l&#39;étape de sorte que les cellules peuvent être visualisés à plusieurs reprises. </li><li> En mode épifluorescence, focaliser le microscope et de localiser les cellules fluorescentes, transfectées. Les cellules resteront axées sur plusieurs plans de mise au point. Repérez simples, des cellules isolées pour procéder à la FRBR. </li><li> Dans le programme d&#39;imagerie, réglez le temps d&#39;exposition à 200 msec et d&#39;optimiser l&#39;intensité de fluorescence en réglant le gain EM. </li><li> Passer le faisceau laser en TIRF en traduisant le faisceau à travers l&#39;objectif d&#39;une manière progressive à l&#39;aide du moteur pas à pas. À l&#39;approche de l&#39;angle critique, le faisceau sera visiblement traduire à travers le bord du plat jusqu&#39;à ce qu&#39;il converge à thpoint de réflexion interne totale sur le plan de l&#39;échantillon e. </li><li> Vérifiez que les cellules sont en mode FRBR en ajustant le bouton de mise au point. Dans TIRF, un seul plan de cellules peut être concentré ( par exemple à environ 150 nm de l&#39; interface verre), produisant une image bien définie avec une résolution élevée de la membrane plasmique. </li></ol></li><li> Imagerie septembre pour déterminer la localisation subcellulaire <ol><li> Localiser transfectées, les cellules saines, simples dans le plan d&#39;imagerie. </li><li> Acquérir une image focalisée de la cellule à pH 7,4. Septembre marqué des récepteurs sur la membrane plasmique et réticulum endoplasmique doit être visible. </li><li> bloquer rapidement le faisceau laser atteigne l&#39;échantillon pour prévenir le photoblanchiment. </li><li> Mémoriser les positions de scène correspondant à chaque cellule en utilisant un logiciel d&#39;imagerie de microscope capable d&#39;enregistrer plusieurs emplacements xy. </li><li> Répétez les étapes 2.4.1-2.4.4 pour 20-30 cellules par boîte tout en utilisant le logiciel pour enregistrer la position de chaque cellule. </li><li> Un Fter toutes les images de cellules à un pH de 7,4 sont recueillies, retirer manuellement la solution ECS à pH 7,4 à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ne touchez pas le plat car cela pourrait déplacer les positions de scène mémorisées. </li><li> Soigneusement ajouter 2 ml de pH 5,4 ECS au plat et attendre 10 min. Pendant ce temps, enregistrer des images précédemment acquises. </li><li> Sous le même ensemble de conditions utilisées pour recueillir des images à pH 7,4, déplacer la scène à chaque position enregistrée et d&#39;acquérir une image de la même cellule à pH 5,4. Les cellules doivent regarder moins définis puisque toute fluorescence détectée est originaire de réticulum endoplasmique confinés septembre récepteurs marqués. Enregistrez les images de cellules pH 5,4. </li></ol></li><li> Imaging simples événements d&#39;insertion des vésicules dans les cellules vivantes <ol><li> Remplacer les médias de cellules transfectées de croissance avec 2 ml pH 7,4 ECS, ou L-15 des médias Leibovitz. Le pH de L-15 de médias Leibovitz est CO 2 indépendant, permettant l&#39; imagerie à se dérouler sur une longue période de temps si nécessaire. </li><li> Place la boîte de cellules transfectées sur la platine du microscope. Fixer et se concentrer une seule cellule dans la FRBR suivant l&#39;étape 2.3 ci-dessus. </li><li> Le cas échéant, régler la mise au point automatique de sorte que la mise au point ne dérive pas sur la période de l&#39;imagerie. </li><li> Enregistrement d&#39;une série de 1000 images, capture en continu des images à une vitesse de 200 msec de cadre. Eclats de fluorescence seront visibles pendant ce temps, correspondant à des vésicules à faible pH de trafic de fusion avec la membrane plasmique, exposant la SEP au pH extracellulaire 7.4. </li><li> Trouver un autre cellule unique et répétez l&#39;étape ci-dessus. Réinitialiser autofocus si nécessaire. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de l&#39;image et de traitement de données <ol><li> L&#39; analyse de la fluorescence septembre afin de déterminer la localisation subcellulaire <ol><li> Ouvrez les images de cellules en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image tels que Metamorph ou ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Soustraire l&#39;arrière-plan à la fois 5,4 pH et de pH 7,4 images en utilisant le réglage de roulement à billes.</li><li> Utiliser un seuil basé sur l&#39;intensité de fluorescence pour quantifier à partir d&#39;une seule cellule. sélectionner manuellement une région d&#39;intérêt autour de la cellule dans l&#39;image de pH 7,4. </li><li> Mesurer la surface cellulaire, intensité moyenne, et la densité intégrée à l&#39;aide d&#39;un plugin dans ImageJ ou en utilisant le construit en fonction &quot;Mesure&quot; sous l&#39;onglet Analyser. </li><li> Répéter les étapes 3.1.1-3.1.3 pour la même cellule, à un pH de 5,4, en ajustant avec soin le seuil en fonction de l&#39;intensité et de la région d&#39;intérêt de la même manière. </li><li> Une fois la densité intégrée est obtenue pour des images de cellules à la fois à pH 7,4 et 5,4, calculer la densité intégrée de la membrane plasmique en soustrayant la valeur de pH 5,4 à partir de la valeur de pH 7,4. La différence correspond au nombre des récepteurs par rapport à la membrane plasmique au sein de la région d&#39;excitation TIRF. </li><li> En tant que mesure de la traite, de calculer le pourcentage relatif de septembre marqué des récepteurs situés sur la membrane plasmatique par rapport aux récepteurs visibles dans les excitati TIRF restantessur le volume en divisant la membrane plasmique densité intégrée par la densité totale intégrée à un pH de 7,4, multipliée par 100. </li></ol></li><li> L&#39; analyse des événements d&#39;insertion unique vésiculaires <ol><li> Ouvrez la série de 1000 images TIFF en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Soustraire l&#39;arrière-plan de toutes les trames en utilisant le réglage de roulement à billes. </li><li> Réglez la balance des couleurs de l&#39;enregistrement afin de maximiser les régions intenses correspondant aux vésicules événements d&#39;insertion. compter manuellement les rafales de fluorescence d&#39;une durée de 3 images (&gt; 600 msec). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li>
<li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li>
<li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease--a+stereological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li>
<li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+%CE%B17+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+%CE%B2-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+%CE%B14%2A+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li>
<li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotine+metabolite%2C+cotinine%2C+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li>
<li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8764371">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li>
<li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li>
<li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li>
<li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14%CE%B22+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity%3A+pharmacology%2C+stoichiometry%2C+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-3768-4">Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies</a>. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).</li>
<li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08006079">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+of+the+secretory+pathway%3A+measurement%2C+determinants%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La sensibilité au pH de septembre permet à des récepteurs se trouvant sur la membrane plasmique à distinguer des récepteurs intracellulaires dans le réticulum endoplasmique, et il peut être utilisé pour résoudre des événements d&#39;insertion de vésicules 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 récepteur tr...

Les changements dans l&#39; expression du récepteur, la distribution et l&#39; assemblage ont été connectés à une grande variété de maladies, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la fibrose kystique et la toxicomanie 1, 2, 3, 4, 5. Par exemple, la nicotine et d&#39; autres ligands nicotiniques influencent le trafic des récepteurs nicotiniques de l&#39; acétylcholine (nAChR) conduisant à des changements dans le trafic, l&#39; expression et la régulation positive 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotine augmente le nombre total de nAChR assemblés dans une cellule, le trafic augmente vers la membrane plasmique, und modifie l&#39;assemblage de sous-unités pour favoriser une version haute sensibilité de certains sous-types. Résoudre des changements distincts dans le trafic, l&#39;assemblage et l&#39;expression des récepteurs dans un modèle de la maladie fournit des détails cruciaux mécanistes qui sont essentielles pour définir des cibles de médicaments. Une approche idéale serait rapidement différencier les récepteurs intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Cela est particulièrement difficile dans les cas où une majorité d&#39;une protéine particulière réside intracellulaire, comme avec nAChR. Puisque la majorité des nAChR sont localisées dans le réticulum endoplasmique, les mesures traditionnelles manquent la résolution spatio-temporelle nécessaire pour identifier la localisation et la traite des changements le long de la voie sécrétoire. Trafic de récepteurs et d&#39; expression des études de nAChR ont principalement été réalisées en utilisant radioligand de liaison 11, des essais de biotinylation 12, western blot 13, ou immunoprécipitation techniq<html> ues 12. Celles-ci dépendent de la spécificité de liaison d&#39;une molécule rapporteur ou la fixation des cellules et ne sont pas capables de distinguer simultanément entre résident de la membrane plasmique et les récepteurs intracellulaires. Par conséquent, les études de montage de canal ionique et vésiculaires dynamique ont largement compté sur les bas-débit techniques électrophysiologiques 14. résolution spatiale et temporelle supérieure est possible avec les progrès de la microscopie par fluorescence. Molécules reporters codés génétiquement, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes, d&#39; éliminer les problèmes de liaison non spécifiques et d&#39; augmenter la sensibilité 15. Une variante sensible au pH de la GFP, connu sous superecliptic pHluorin (SEP), peut être utilisé pour exploiter les différences de pH inhérentes entre les compartiments à l&#39; intérieur d&#39; une cellule pour déterminer la localisation 5, 7, 8,ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. septembre fluoresce lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d&#39; arrêt à un pH inférieur. Par conséquent, les récepteurs marqués avec SEP sur leur côté luminal sont détectés lorsqu&#39;ils sont présents dans le réticulum endoplasmique ( ER) ou lors de l&#39;insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de traite. la manipulation du pH extracellulaire en contact avec des récepteurs sur la membrane plasmique modifie par conséquent la fluorescence et donc la détection de ces récepteurs. Si la même cellule, séquentiellement imagée à la fois à un pH extracellulaire neutre et un pH inférieur à 6, la différence entre les images est attribuée à des récepteurs situés sur la membrane plasmatique. Ceci permet une mesure simultanée de intracellulaire (ER périphérique) et les récepteurs de la membrane plasmique résidentes 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. événements unique d&#39;insertion des vésicules peuvent également être résolus lorsque le pH extracellulaire est neutre. Une fois qu&#39;un faible trafic vésiculaire pH fusionne avec la membrane plasmique, la partie luminale de la vésicule est exposée à la solution extracellulaire neutre, ce qui provoque une transition détectée comme une rafale de fluorescence de 7, 18, 19, 20. Septembre permet la mesure des récepteurs localisés à la membrane plasmique et réticulum endoplasmique périphérique, et fournit un moyen de mesurer le trafic des récepteurs entre ces régions subcellulaires 5, 7, 18. Pour obtenir une résolution plus élevée à la membrane plasmique, avec un récepteur codé génétiquement septembre est imagée par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM). Cette méthode est particulièrementutile si la plupart des récepteurs sont localisés dans les régions intracellulaires, puisque TIRFM augmente la visibilité de la membrane plasmique. TIRFM permet également la résolution de la dynamique de trafic de vésicules individuelles portant des récepteurs SEP-marqués lors de l&#39;insertion dans le PM. La réflexion totale interne se produit à l&#39;interface des matériaux ayant différents indices de réfraction, par exemple entre une cellule et une lamelle couvre- objet en verre 21, 22. Septembre fluoresce lorsqu&#39;il est irradié par excitation à 488 nm, qui est orientée pour obtenir une réflexion interne totale à l&#39;interface de la solution de verre et de la cellule. Cela produit une onde évanescente qui pénètre environ 150 nm dans l&#39;échantillon, seulement fluorophores passionnantes dans ce volume. Seulement septembre contenant des récepteurs dans un environnement de pH neutre dans cette plage d&#39;excitation sont détectés, correspondant à celles se trouvant sur la membrane plasmique ou réticulum endoplasmique périphérique. Depuis la détection est limitée to excitation par l&#39;onde évanescente, la fluorescence de fond de la région intracellulaire est réduite , et le rapport signal sur bruit est augmenté de 21, 22. En outre, étant donné que le rayonnement ne pénètre pas la majeure partie de la cellule, le photovieillissement est réduite au minimum qui permet l&#39;imagerie des cellules vivantes au cours du temps. En conséquence, TIRFM couplé avec génétiquement codé septembre fournit la haute résolution et la sensibilité requise pour la mesure de localisation et de trafic dynamique subcellulaire des récepteurs membranaires le long de la voie sécrétoire.

<table><tbody><tr><td>Fioles de culture cellulaire <fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>avec capuchon filtrant, stériles, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri à fond en verre de 35 mm, stériles</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&lrm ; (DMEM), Glycémie élevée</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Réduit</td><td>Medium Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié, origine américaine, standard (filtré stérilement)&nbsp ;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), sans rouge de phénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium, sans rouge de phénol</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>facultative Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Mélanger délicatement ; Ne pas vortex</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion objective&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>Type F</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’huile 60X, 1.49 NA</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Platine motorisée</td><td>Prior</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Actionneur motorisé (moteur pas à pas)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (ou autre programme d’imagerie)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibre</td> <td>monomodeThorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Miroirs</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïque 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant receptors phluorin-taggés pour surveiller subcellular localisation et le trafic

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Comprendre protéine membranaire traite, l&#39;assemblage et l&#39;expression nécessite une approche qui établit une distinction entre ceux qui résident dans des organites intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Les mesures classiques basées sur la fluorescence manquent de la capacité de distinguer des protéines membranaires résidant dans différents organites. Méthodologies de pointe dépassent les méthodes traditionnelles de couplage des fluorophores sensibles au pH à la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM). illumination FRBR excite l&#39;échantillon jusqu&#39;à environ 150 nm à partir de l&#39;interface verre-échantillon, diminuant ainsi fond, augmenter le rapport signal sur bruit, et l&#39;amélioration de la résolution. Le volume d&#39;excitation dans TIRFM englobe la membrane plasmique et à proximité des organites tels que l&#39;ER périphérique. Superecliptic pHluorin (SEP) est une version sensible au pH de la GFP. Génétiquement codant septembre dans le domaine extracellulaire d&#39;une protéine membranaire d&#39;intérêt positionne sur le fluorophorele côté luminal du RE et dans la région extracellulaire de la cellule. Septembre est fluorescent lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d&#39;arrêt à des valeurs de pH inférieures. Par conséquent, les récepteurs marqués avec une fluorescence septembre lorsqu&#39;il réside dans le réticulum endoplasmique (RE) ou lors de l&#39;insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de trafic ou d&#39;autres organites tels que l&#39;appareil de Golgi. Le pH extracellulaire peut être ajustée pour dicter la fluorescence des récepteurs sur la membrane plasmique. La différence de fluorescence entre les images TIRF à pH extracellulaire neutre et acide pour la même cellule correspond à un nombre relatif des récepteurs sur la membrane plasmique. Ceci permet une mesure simultanée de récepteurs résidant intracellulaires et membranaires plasmiques. événements unique d&#39;insertion des vésicules peuvent également être mesurés lorsque le pH extracellulaire est neutre, ce qui correspond à un faible pH vésiculaire de trafic fusionner avec la membrane plasmique et la transition vers un état fluorescent. Cette versatiltechnique de e peut être exploitée pour étudier la localisation, l&#39;expression et le trafic des protéines membranaires.

Septembre incorporation dans un récepteur permet la détection directe de ce récepteur dans une cellule vivante. Couplé à TIRFM, ce qui permet d&#39;évaluer les niveaux d&#39;expression relatifs à la membrane plasmique et la distribution des récepteurs à l&#39;intérieur des emplacements subcellulaires dans la région de l&#39;excitation TIRF. Simples événements de trafic de vésicules peuvent également être résolus. Niveaux d&#39;ex...

Etiquetage du domaine extracellulaire d&#39;une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l&#39;expression et le trafic à déterminer. les protéines d&#39;imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

L'objectif général de cette méthode d'imagerie par fluorescence est de surveiller les changements dans le trafic des protéines membranaires et leur distribution intracellulaire. Cette méthode permet d'observer les modifications du trafic protéique, telles que l'effet de mutations génétiques ou d'agents pharmacologiques sur la vitesse de livraison des vésicules et l'expression protéique à la surface cellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'effectuer des mesures rapidement, avec une haute résolution et en temps réel, sans détruire l'échantillon.48 heures avant l’imagerie, les cellules de neuroblastome 2A de souris sont transfectées avec un construct plasmidique contenant SEP, un fluorophore sensible au pH intégré dans la région extracellulaire de la protéine d’intérêt. Lorsque les cellules transfectées sont prêtes pour l’imagerie par microscopie de fluorescence en réflexion totale interne, ou microscopie TIRF, ajoutez deux millilitres de solution extracellulaire, ou ECS, de pH 7,4 aux cellules. Placez une boîte de cellules sur la platine de translation et utilisez des supports de platine pour fixer la boîte en place.En mode épifluorescence, fo

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce rapport décrit l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes et des techniques de photoblanchiment pour déterminer l'expression de surface, les voies de transport et de la cinétique du trafic de manière exogène exprimé, sensible au pH GFP-protéines marquées à la membrane plasmique des neurones.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Nous présentons ici un protocole pour quantifier la phagocytose des particules fluorescentes par la lignée cellulaire de macrophages adhérents à l’aide d’une méthode fluorométrique. Cette méthode facilite une quantification à haut débit de l’internalisation des particules ainsi que la polymérisation de l’actine qui en résulte.

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.

Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

La quantification précise des événements de trafic vésiculaire fournit souvent des informations clés sur les rôles de protéines spécifiques et les effets des mutations. Cet article présente des méthodes d’utilisation de la supécliptique pHluorin, une variante de la GFP sensible au pH, comme outil de quantification des événements endocytaires dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative et de la cytométrie en flux.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Découvrez une méthode d'imagerie par fluorescence pour surveiller le trafic des protéines membranaires en temps réel. Cette technique utilise le pHluorin superecliptique et la microscopie TIRF sur des cellules neuroblastome de souris.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Explorer plus de vidéos