Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Hi.In cette vidéo, nous présentons une expérience complète de suivi quantique unique. Un algorithme dédié a été entièrement conçu en collaboration avec les experts d’image ISIS. Au cours de cette vidéo, nous utiliserons le récepteur du facteur de croissance épidermique comme modèle pour décrire la méthode de cette technique.

Le récepteur du facteur de croissance épidermique est une protéine transmembranaire. Ce récepteur sera marqué à l’aide d’un anticorps monoclonal, qui est réduit pour ne garder que le fragment A a B. Le fragment A a B est biotinylé, et après cela, lié à la streptavidine de la boîte quantique, le système de paroi reconnaîtra précisément le récepteur EGF.

Notre objectif est de fournir une vue complète de la dynamique des récepteurs de surface cellulaire. En effet, les trajectoires moléculaires peuvent dévier de la diffusion de brot en étant confinées dans des domaines nano. Par exemple, et cela peut être la signature d’une interaction sous-jacente avec, par exemple, des partenaires de signalisation ou des échafaudages moléculaires.

Notre objectif est de décrire de manière exhaustive ces événements en les cartographiant sur la cellule, ce qui nécessite de travailler à une résolution temporelle SPECT élevée avec une densité de marquage élevée. C’est pourquoi nous appelons cette approche le traçage multi-cibles. La première étape de l’expérience est la préparation de l’échantillon.

Nous travaillons sur des cellules vivantes sans antibiotiques. Ici, nous utilisons sept cellules, qui expriment de manière endogène les récepteurs EGF. Après avoir détaché la cellule, nous devons confirmer précisément afin d’avoir le même nombre de cellules dans h puits du laboratoire.

Un nombre précis de cellules est très important pour augmenter la prévisibilité du nombre de points quantiques par cellule Après avoir distribué la cellule en H, eh bien, vous devez incuber le labate pendant 24 heures à 37 degrés avec 7 % de CO2. L’étape suivante est la préparation de la boîte quantique couplée à des anticorps. Les points quantiques sont de petites nanoparticules fluorescentes.

Ces particules ont un très grand intérêt ici car elles sont très brillantes et stables par rapport aux sondes et signaux fluorescents classiques. Le rapport du nez est très important pour ce type d’expérience. Dans ce cas, nous utilisons un support complet pour saturer les bandes autour des points quantiques et pour éviter l’agrégation.

Après cela, nous avons eu les points quantiques dans la protéine bioTE exaltée ou les anticorps d’intérêt avec un rapport de un à un afin d’avoir statistiquement plus de points quantiques monovalents. Dans cette expérience, nous utilisons un fragment a b contre le récepteur EGF produit en laboratoire à partir d’anticorps monoclonaux et qui sont ciblés par la biotine. Pendant l’incubation d’environ 15 minutes, vous pouvez maintenir le contrôle sous agrégation et homogénéité à l’aide d’un agitateur à 1 200 rotation par minute et deux cinq degrés.

Lorsque le mélange est prêt, vous pouvez l’ajouter sur vos cellules. Retirez le milieu du puits très doucement pour éviter le détachement des cellules sur le technicien de laboratoire et ajoutez la quantité nécessaire de mélange pour votre expérience. Dans ce cas, nous ajouterons 100 microlitres de mélange par puits.

Après l’ajout du mélange, vous pouvez incuber votre cellule pendant 15 minutes. Dans ce cas à 37 degrés avec 7 % de CO2. Après cette incubation, vous pouvez trouver un grand nombre de points jumeaux fréquents en suspension sur le milieu.

Ces points quantiques doivent être retirés avant l’imagerie. À cause du bruit que nous apportons. C’est pourquoi nous devons laver chacun, enfin plusieurs fois dans ce cas, cinq fois pour vous laver.

Utilisez un support d’imagerie sans autofluorescence. Ici, nous utilisons le tampon HBSS avec aps. Vos cellules sont maintenant prêtes.

Il est temps de passer à la configuration pour l’acquisition. L’installation est composée de quatre parties principales, un microscope inversé, une caméra avec sensibilité oculaire, une puissante lampe à mercure et un incubateur pour maintenir la cellule à 37 degrés. La lumière de la lampe au mercure passe à travers une fibre et à travers une roue à filtres avant d’éclairer l’échantillon.

L’eSense de la grippe de l’échantillon est filtré et collecté par une caméra E-M-C-C-D sur la gauche. Nous utilisons actuellement des objectifs à ouverture numérique de 1,3 et 1,49. L’étape centrale de cette expérience est l’acquisition par elle-même.

Une fois que les cellules sont mises au point, nous examinons une cellule représentative avec une étiquette forte. Dans les points quantiques, nous acquérons d’abord une seule image en lumière blanche transmise, qui peut ensuite être utilisée pour vérifier l’aspect cellulaire et la limite spéciale du podie LA. Nous acquérons ensuite des vidéos généralement à une fréquence de 36 millisecondes, la vitesse la plus rapide autorisée en plein format.

Nous utilisons un CCD multiplicateur d’électrons pour atteindre la sensibilité d’une molécule unique avec un rapport signal/nord suffisant au moins supérieur à 20 décibels. Généralement autour de 25 décibels, nous acquérons généralement 300 images. Pour évaluer un ensemble de données donné, il vous suffit de fournir le mot de passe au répertoire contenant les fichiers vidéo.

Ensuite, en tapant la commande, le texte se reconnecte dans MetLab ou la commande MTT 23 I, qui affiche d’abord une liste d’interface graphique. Tous les paramètres utilisés lanceront l’analyse entièrement automatisée. L’analyse MTT de base est effectuée sur chaque image, en invoquant trois tâches principales, la première détection pour chaque pixel de la présence ou de l’absence d’une dette quantique cible.

Ensuite, pour chaque détection, l’estimation de la cible des paramètres pertinents tels que la position de ses pixels, l’intensité du signal, etc. Dernière reconnexion des nouvelles cibles. Avec les traces déjà construites sur les images précédentes pour chaque pixel.

En considérant une sous-région locale, nous comparons deux hypothèses de présence, soit de bruit seul, soit d’un signal. Avec la fonction d’étalement de points, ModuLite dispose d’un pic hin. Nous utilisons un seuil garantissant des fausses alarmes suffisamment basses avec moins d’une détection de lecture par image pour chaque cible détectée.

Nous effectuons ensuite une évaluation des pieds nutritifs fantômes les moins carrés pour estimer la position, la largeur et la hauteur du Goshen détecté. Cela fournit notamment la position de la cellule spic du colorant, généralement une précision d’environ 10 à 20 nanomètres pour des rapports signal/bruit typiques à des pics de haute densité peuvent souvent être trop fermés et des pics forts peuvent entraver les plus faibles pour gérer cela. Nous dégonflons les pics détectés à partir de l’image initiale en cours d’exécution.

Encore une fois, la détection sur le résidu peut généralement fausser 10 % des pics. Parvenir à une détection presque exhaustive est très fructueux pour une reconnexion précise. Ensuite, l’ensemble des nouvelles cibles est mis en correspondance avec l’ensemble des traces précédentes pour cette pupille.

Afin d’attribuer chaque trace à une cible si possible, et de gérer un éventuel clignement des yeux, nous utilisons toutes les informations statistiques disponibles obtenues à partir de l’étape de détection. Par conséquent, les cibles ne sont pas simplement attribuées à la trace la plus proche. En cas de conflits, lorsque des traces peuvent se croiser, c’est-à-dire que les régions de recherche pertinentes respectives se chevauchent, nous considérerons la valeur statistique de l’intensité, de la vitesse, de la largeur et du clignotement à la fois pour les traces et pour les cibles.

Cela permet d’obtenir un score de reconnexion statistiquement optimal. La stratégie permet d’éviter, lorsque c’est possible, de biaiser la reconnexion vers les voisins les plus proches, c’est-à-dire le mouvement le plus lent. Nous utilisons ensuite une fonction pour évaluer un éventuel confinement transitoire dans les trajectoires.

Cette fonction est inversement liée à la diffusion locale telle qu’établie par Sexton Simpson et ses collaborateurs. L’application d’un seuil permet de définir des épisodes confinés ou non. En itérant ces traces globales, nous pouvons enfin cartographier la dynamique membranaire en termes de confinement transitoire, de preuves de ralentissement, et cela peut être représenté.

Alternativement, en utilisant les valeurs binaires ou discrètes de cet indice de confinement, par défaut, MTT effectuera automatiquement ces tâches, en enregistrant pour chaque vidéo les paramètres de ligne pour chaque pic dans un fichier eski, et pour des investigations plus poussées. Des résultats typiques tels que la cartographie des traces sur chaque cellule et les tracés d’histogrammes pour les paramètres d’intérêt, les intensités de pointe, le rapport signal sur bruit, les valeurs locales déficientes, et ainsi cet aspect peut également être facilement adapté à toute investigation dédiée. Cette vidéo va maintenant résumer les résultats typiques obtenus par MTT.

Une partie importante du travail réside dans l’élaboration de l’algorithme, qu’il peut être nécessaire d’adapter à des investigations dédiées telles que les modes de mouvement ou les interactions de la souffrance. Mais l’exécution de MTT est très simple. Les utilisateurs ne doivent optimiser que quelques paramètres tels que les limites d’espace et de temps.

Lors de l’élaboration de MTT, nous avons cherché à reconsidérer entièrement les options analytiques utilisées pour chaque tâche. Nous optimisons le processus le long de deux axes difficiles. Premièrement, la gestion de densités élevées pour obtenir les meilleures informations spéciales sur la surface de surface, et deuxièmement, la gestion d’un SNR faible, qui permet généralement de travailler à faible élimination et à confinement à grande vitesse, peut être interprétée comme la signature d’une interaction sous-jacente.

Les récepteurs membranaires peuvent interagir avec le cytosquelette sous-membranaire ou les domaines prolipidiques, par exemple. De tels événements peuvent être étudiés à travers les variations d’enfermement dans l’espace et le temps. Les mesures dynamiques peuvent être comparées à des approches complémentaires telles que FRA, F, C ou fret.

Le code open source est disponible pour la recherche universitaire. Il peut être téléchargé à partir de notre page Web à l’adresse CML dot univ if an S fr sur la page de nos équipes, qui fournit un lien pour le téléchargement. Les industriels intéressés sont également invités à nous contacter.

Nous tenons à remercier tout particulièrement les membres de notre équipe et des installations communes pour le soutien et les discussions fructueuses. Ce projet est soutenu par un financement du CNRS en c MAA Université Pac Région National de La, et la Fondation Médicale est soutenue par le contrôleur de la ligue. Merci d’avoir regardé.