À faire et à ne pas faire de cryo-microscopie électronique: Notions sur la préparation de l'échantillon et de collecte de données de haute qualité pour la reconstruction 3D macromoléculaire

L’objectif de l’expérience suivante est de pouvoir imager des macromolécules dans leur état hydraté congelé avec le microscope électronique à transmission. Ceci est réalisé en plongeant la grille avec l’échantillon sur le cryogène pour obtenir un échantillon vitrifié mince. Dans un deuxième temps, l’échantillon est exposé au faisceau d’électrons, qui formera une image de projection des macromolécules.

Ensuite, les images sont traitées sur l’ordinateur afin d’obtenir la reconstruction 3D de la macromolécule. Les résultats montrent une structure 3D très détaillée de la macromolécule, sa confirmation et la localisation 3D de ses partenaires moléculaires. Il y a un avantage principal de cette technique, par rapport aux autres méthodes de préparation d’échantillons pour l’électromicroscopie.

En cryo, l’image est directement formée par les électrons à l’intérieur de la macromolécule. Cela reflète plus fidèlement sa structure presque autochtone. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

La préparation de la grille cryogénique et est transférée au microscope électronique sont difficiles à apprendre en raison de la complication supplémentaire lors du travail à des températures cryogéniques, Le cycle de réchauffement est utilisé au début de la séquence de pompage et après une séance de cryo EM. Pour commencer cette procédure, insérez le support cryogénique dans l’un des orifices de pompage de la station de pompage. Démarrez l’option de cycle de préchauffage.

Dans le contrôleur d’étage froid, ouvrez la vanne papillon V deux, et lorsque le vide dans la station de pompage turbo se stabilise et indique 10 puissance moins trois, tournez ou mieux ouvrez la vanne papillon V un. Une fois que la température dans le support est stable au-dessus de la température ambiante et que le cycle de préchauffage est terminé. Basse V un et arrêtez le cycle.

Ensuite, démarrez l’option de cycle de lumière ze et sélectionnez le temps nécessaire pour obtenir un bon vide dans la plage de un à deux fois 10 puissance moins quatre tor. Lorsque le vide atteint 10 puissance moins trois pour s’étendre, ouvrez la vanne d’évacuation de l’uranium appauvri, B, trois et la soupape du support cryogénique. Lorsque le cycle est terminé, levez les vannes dans l’ordre opposé à celui dans lequel elles ont été ouvertes.

À l’aide d’une pince à épiler, laissez un morceau de MICA exposer deux nouvelles surfaces. Placez les nouvelles surfaces de mica exposées face vers le haut sur une feuille de papier blanc dans une boîte de Pétri. Après avoir placé la boîte de Pétri dans le pot d’un évaporateur de carbone, effectuez la séquence de pompage jusqu’à ce que le vide soit inférieur à 10 à moins six pour enduire le mica d’une fine couche de carbone.

Transférez ensuite le carbone mince sur la grille. Qu’un morceau de mica enrobé de 0,5 centimètre sur un centimètre et fasse flotter le carbone sur la surface plane de l’eau déminéralisée filtrée. À l’aide de la pince à épiler, mettez le côté en carbone sacré de la grille en contact avec la surface supérieure de la couche de carbone flottante et ramassez-la.

Placez la grille avec le côté carbone vers le haut sur une lame de verre de 7,5 x 2,5 centimètres recouverte d’un film d’alimentation. Placez ensuite la glissière de verre dans la chambre de l’équipement de décharge lumineuse et fermez la chambre. Pompez la cloche et allumez-vous.

Déchargez pendant 20 secondes à 25 milliampères et sept fois 10 à moins deux millibars. À ce stade, allumez l’appareil de congélation en plongée. Tirez le récipient Ethan vers le bas en remplissant le réservoir d’azote liquide.

Une fois que l’azote liquide cesse de bouillir, placez l’extrémité du tube provenant du réservoir Ethan dans la chambre intérieure et ouvrez la vanne très lentement. Liquéfiez l’éthane dans la chambre intérieure et remplissez-le à un millimètre du haut. Allumez l’humidité.

Ensuite, chargez une grille sur une pince à épiler et chargez trois à cinq microlitres d’échantillon sur la surface en carbone de la grille sacrée. Après avoir attendu que l’échantillon soit absorbé par la grille, effectuez un transfert Pour obtenir une fine couche de fard à joues liquide, congelez la grille en la plongeant dans l’éthane liquide. Retirez avec précaution l’ensemble de la grille de la pince à épiler de l’éthane liquide et transférez-le dans la chambre extérieure contenant de l’azote liquide.

Transférez ensuite la grille dans une petite boîte de grille immergée dans l’azote liquide. À ce stade, insérez le support cryo dans le poste de travail de transfert cryogénique. Remplissez le faiseur du support cryogénique et le récipient du poste de travail avec de l’azote liquide.

Transférez rapidement la boîte de grille cryogénique contenant la grille hydratée congelée à l’azote liquide du poste de travail. Après avoir ouvert la boîte de grille cryogénique, prenez la grille hydratée congelée et placez-la dans la fente du porte-échantillon. Ensuite, placez l’anneau de clip sur le dessus de la grille et appuyez doucement dessus avec l’extrémité émoussée de l’outil d’anneau de clip et jusqu’à ce qu’il soit fermement en place.

Fermez ensuite l’obturateur cryo. Complétez l’anti-contaminant TEM avec de l’azote liquide. Inclinez à nouveau la platine du microscope à moins 60 degrés.

Ensuite, commencez le cycle de sas PrepU sur le microscope. Une fois la séquence de sas de la pompe terminée, insérez le support de chœur dans le sas et connectez le cordon de commande de la scène froide au support pour surveiller la température. Une fois le voyant rouge éteint, tournez le support à la position zéro degré pour l’insérer dans la colonne de vide poussé du T EM.

Rétractez l’obturateur cryogénique et ouvrez les vannes de la colonne. Activez le programme à faible dose en mode recherche. Centrez la scène et réglez la hauteur centrale à l’aide de l’oscillateur alpha pour faire basculer la scène de plus ou moins 15 degrés, sélectionnez un trou approprié et placez-le au centre du terrain avec le contrôleur de scène XY.

Passez en mode mise au point et faites la mise au point sur l’image. Ensuite, mise au point l’image entre 0,5 et 4,5 microns. Passez en mode exposition et enregistrez l’image.

Enfin, revenez en mode recherche pour sélectionner le trou suivant et répéter la séquence. Des images microscopiques obtenues par les méthodes de coloration négative et de cryo EM pour quatre échantillons représentatifs avec des caractéristiques structurelles différentes sont comparées ici, les capsides virales adéno-associées colorées négativement révèlent des particules pseudo-virales et la cryo EM montre qu’elles sont vides. Les images du virus de la mosaïque du tabac montrent des tiges hélicoïdales avec le canal central rempli de colorant dans la coloration négative et vide dans les images cryo EM.

KLH assemble dans des barillets caractéristiques montrant six stries à la fois dans les images de coloration négative et de cryo EM. Les vues latérales rectangulaires et les vues circulaires et sur révèlent un vide dans une structure par cryo EM dans le récepteur odine. Des caractéristiques de surface complexes telles qu’une croix centrale et une dépression centrale se manifestent par une accumulation de coloration par coloration négative et par des régions de plus faible densité par cryoélectromagnétisme.

Des exemples typiques d’artefacts cryo EM sont la glace cristalline, la contamination par la glace, l’astigmatisme et les structures en forme de toile. L’analyse d’une seule particule et la reconstruction 3D du récepteur ine hydraté congelé 1 révèlent sa structure symétrique quadruple. Le domaine cytoplasmique forme un prisme carré et contient plusieurs domaines gulaires reproductibles formant une structure semblable à un échafaudage.

À une résolution de 10 angströms, il est possible de visualiser les HELOCs alpha en 3D. La cartographie des différences peut révéler la position de ligands importants. Les modifications de confirmation fournissent une vue dynamique de la macromolécule.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons cryo EM de haute qualité. La cryo-EM, combinée au traitement d’images, a permis aux chercheurs d’explorer la structure, l’organisation des sous-unités et la dynamique conformationnelle des machines macromoléculaires.