Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l'étude des maladies neurologiques

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules neuroprogénitrices ou NPC à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines ou de CSP élevées comme plate-forme pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant aux maladies neurologiques. Ceci est accompli en différenciant d’abord les CSP élevées à l’aide de deux inhibiteurs de smad en rosettes neurales. La deuxième étape consiste à récolter ces rosettes neurales et à leur permettre de se développer en populations N PC extensibles.

Prochaine transduction lentivirale avec une infection de spin. L’étape d’amélioration de l’efficacité est utilisée pour manipuler l’expression des gènes. La dernière étape consiste à faire pousser les NPC en suspension afin qu’ils forment spontanément des neurosphères.

En fin de compte, cette plateforme peut être utilisée pour tester une variété de phénotypes cellulaires. Par exemple, mesurer l’effet de la manipulation génétique sur la neuromigration. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des mécanismes cellulaires tels que la migration.

Il peut également être appliqué pour étudier d’autres processus biologiques tels que la réplication, le stress oxydatif, l’apoptose et la croissance des neurites. La différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme ou CSP élevées conduit à la formation de rosettes neurales visibles, qui sont caractérisées par des amas ronds de cellules neuroépithéliales avec une polarité basale aico pour la sélection enzymatique des rosettes neurales au jour 14. Aspirez le milieu des corps embryonnaires collés ou ebs et ajoutez un millilitre de réactif de sélection de rosette neurale par puits d’une plaque à six puits incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Au bout d’une heure. À l’aide d’une pipette P 1000, retirez délicatement l’enzyme de chaque puits et ajoutez un millilitre de D-M-E-M-F 12 par puits. Pour laver les rosaces, récupérez le millilitre de D-M-E-M-F 12 et expulsez-le rapidement dans le puits, détachant ainsi les rosettes de la plaque.

Récupérez les rosettes dans un tube de faucon, pipetez un autre millilitre de D-M-E-M-F 12 et expulsez-le rapidement dans le même puits pour détacher les rosettes restantes. N’essayez pas et essayez de ne pas casser les agrégats de rosette. Collectez les rosettes neurales dans le même tube de faucon.

Une plus grande quantité d’enzyme peut être ajoutée et cette procédure répétée si les rosettes ne se détachent pas facilement lorsque toutes les rosettes neurales ont été collectées. Faites tourner le tube Falcon à 300 G pendant trois minutes. Aspirez le lavage et le réuss.

Suspendez les rosettes dans deux millilitres de cellules progénitrices neurales. Transférez les cellules dans une plaque à six parois recouverte d’un stratifié poly L ornithine et cultivez-les à 37 degrés Celsius pendant une semaine. Dans ce laboratoire, des cellules progénitrices neurales ou NPC sont cultivées sur des plaques de matrigel, nourries tous les deux jours et maintenues à une très haute densité.

Pour diviser les PNJ, aspirez d’abord le média, puis ajoutez un millilitre d’accutane chaud par puits d’une plaque à six puits incubée à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Transférez doucement les cellules détachées dans un tube de 15 millilitres contenant D-M-E-M-F 12 avec le moins de contraintes mécaniques possible. Ne tritrate pas les cellules pendant que dans l’enzyme granule les cellules en tournant à 1000 G pendant cinq minutes après la centrifugation, aspirez le surnageant et remettez les NPC en suspension.

Dans environ un millilitre de média NPC par puits d’origine d’une plaque de six puits, cinq à 10 millions de cellules sont attendues par puits confluent d’une plaque de six puits après remise en suspension et comptage des cellules. Remplacez la plaque de PNJ d’environ un à 2 millions de cellules par puits d’une plaque à six puits pour maintenir les PNJ. L’efficacité de la formation des neurosphères varie entre l’expérience et les lignées cellulaires, mais se produit généralement mieux si entre 200 000 et un million de cellules sont assises par puits d’une plaque non adhérente à six parois en cas d’agglutination, réduisez le nombre de cellules assises Idéalement dans un à deux jours après la séparation.

Les NPC NP doivent être transduits avec des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées. Utilisez l’infection par rotation. Aspirer le milieu de chaque puits et le remplacer par la surexpression ou le contrôle approprié les lentivirus ou les rétrovirus titrés à la multiplicité souhaitée d’infection diluée.

Dans les milieux NPC : Utilisez 1,5 millilitre par puits d’une plaque à six puits à 1000 G et à température ambiante pendant une heure dans une centrifugeuse à plaques. Après l’essorage, remettez la plaque dans l’incubateur pour réduire la mort cellulaire. Remplacez le support dans les huit heures suivant l’infection par essorage.

Commencez cette procédure en lavant les NEUROSPHÈRES dérivées des NPC une fois dans un milieu NPC pour éliminer les débris cellulaires. Inclinez la plaque à un angle de 45 degrés et laissez les neurosphères se stabiliser, puis retirez autant de médias que possible sans aspirer les neurosphères. Remplacez par un support frais.

Ensuite, choisissez manuellement les NEUROSPHÈRES dérivées de NPC au microscope à l’aide d’une pipette P 200 pour transférer une sphère neuros dans chaque puits d’une plaque de 96 puits recouverte de matrigel. Il est important de choisir des neurosphères de tailles similaires afin de réduire la variabilité des résultats. Ajoutez 0,5 milligramme supplémentaire de matri gel dilué dans un milieu NPC froid aux neurosphères dans chaque plaque de 96 puits.

À l’aide d’une pointe de pipette, centrez manuellement chaque sphère neurologique individuelle au milieu du puits Permettez à la migration de la sphère neuros de se produire pendant 48 heures. Après avoir fixé et coloré les cellules avec les marqueurs immunohistochimiques souhaités, photographiez les neurosphères dans leur intégralité à l’aide d’un objectif de microscope Forex. Pour mesurer la migration radiale, utilisez le logiciel image J.

Utilisez l’outil de sélection à main levée pour tracer manuellement le bord des cellules migratrices les plus éloignées. Assurez-vous que cette zone est cochée dans la fenêtre des mesures définies située sous l’onglet Analyser. Ensuite, utilisez la fonction de mesure pour calculer l’aire de la forme résultante.

Utilisez la valeur de la mesure de l’aire et l’équation de l’aire d’un cercle pour déterminer le rayon extérieur de la même manière, tracez le bord de la sphère neurologique d’origine. Mesurez la surface et calculez le rayon intérieur. Calculez la migration radiale totale comme la différence entre les rayons extérieur et intérieur.

Ces images montrent les étapes de la différenciation neurale élevée des CSP élevées aux corps embryonnaires, aux rosettes neurales, aux NPC et aux neurones validés que les NPC expriment, l’imbrication du marqueur NPC et le facteur de transcription des cellules souches neurales SOX deux dans la plupart des cellules. La coloration de la tubuline bêta trois est également visible dans toutes les populations de NPC. Les NPC expriment également le facteur de transcription des cellules souches neurales PAC six et le marqueur progéniteur de la brainine 4.

TBR deux, mais pas les marqueurs du mésencéphale tels que LMX un A et FOX A deux NPC peuvent différencier à 70 à 80 % trois neurones positifs à la tubuline bêta montrés en vert et 20 à 30 % d’astrocytes positifs à la protéine acide fibrillaire gliale montrée en rouge, CSP élevée de haute qualité. Les NPC expriment neston et SOX 2 dans la plupart des cellules, tandis que les NPC de faible qualité ont des taches de SOX 2 négatifs et ne s’imbriquent que dans les cellules négatives. Les neurones âgés de quatre semaines, différenciés des NPC de haute qualité, expriment la carte deux AB et bêta trois turbulents.

Après une transduction réussie avec un vecteur lentiviral ou rétroviral à titre élevé. Plus de 80 % des cellules sont marquées par le rapporteur fluorescent. Incluse dans la génération de neurosphères vectorielles, on obtient une population de neurosphères de taille relativement homogène, qui peuvent rester saines en culture pendant environ une semaine.

Avec une alimentation régulière, la migration des neurosphères se produit de manière robuste dans les neurosphères saines, comme l’illustrent ces images en fond clair avant et après 48 heures de migration chez le matrigel. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la schizophrénie pour explorer la neuromigration dans les NPC dérivés de cellules souches PL ponent induites par l’homme. N’oubliez pas que travailler avec un rétrovirus peut être potentiellement dangereux et que tous les travaux de culture tissulaire doivent être effectués dans des conditions de BL deux plus lorsque le virus est potentiellement présent.