Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l'étude des maladies neurologiques

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules progénitrices neuronales ou NPCs à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines, ou iPSCs, afin de créer une plateforme permettant d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant aux maladies neurologiques. Cette approche est réalisée en différenciant d'abord les iPSCs à l'aide d'inhibiteurs doubles de la voie Smad pour former des rosettes neurales. La deuxième étape consiste à récolter ces rosettes neurales et à les cultiver afin d'obtenir des populations de NPCs expansibles.

Ensuite, transduction lentivirale avec une infection par centrifugation. Cette étape, utilisée pour améliorer l'efficacité, permet de moduler l'expression génique. La dernière étape consiste à cultiver les CPN en suspension afin qu'elles forment spontanément des neurosphères.

En fin de compte, cette plateforme peut être utilisée pour analyser une variété de phénotypes cellulaires. Par exemple, mesurer l'effet d'une manipulation génétique sur la migration neuronale. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur des mécanismes cellulaires tels que la migration.

Il peut également être appliqué à l'étude d'autres processus biologiques tels que la réplication, le stress oxydatif, l'apoptose et la croissance des neurites. La différenciation de cellules souches pluripotentes induites humaines ou de cellules souches pluripotentes à haut potentiel conduit à la formation de rosettes neurales visibles, caractérisées comme des agrégats sphériques de cellules neuro-épithéliales présentant une polarité apico-basale, permettant la sélection enzymatique des rosettes neurales au jour 14. Aspirez le milieu des embryocorps adhérents ou des EBC et ajoutez un millilitre de réactif de sélection des rosettes neurales par puits d'une plaque à six puits ; incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après une heure, utilisez un pipeteur P 1000 pour retirer délicatement l'enzyme de chaque puits et ajoutez un millilitre de D-M-E-M-F 12 par puits. Pour laver les rosettes, récupérez le millilitre de D-M-E-M-F 12 et réexpulsez-le rapidement dans le puits, détachant ainsi les rosettes de la plaque.

Prélevez les rosettes dans un tube Falcon. Ajoutez un autre millilitre de DMEM/F12 à l’aide d’une pipette et expulsez-le rapidement dans le même puits afin de détacher les rosettes restantes. Évitez de trier et de briser les agrégats de rosettes. Rassemblez les rosettes neurales dans le même tube Falcon.

On peut ajouter davantage d'enzyme et répéter cette procédure si les rosettes ne se détachent pas facilement une fois que toutes les rosettes neurales ont été collectées. Faire centrifuger le tube Falcon à 300 ×g pendant trois minutes. Aspirer le liquide de lavage et resuspendre.

Suspendez les rosettes dans deux millilitres de milieu pour cellules progénitrices neuronales. Transférez les cellules dans une plaque hexapuits revêtue de poly-L-ornithine laminée et faites-les croître à 37 degrés Celsius pendant une semaine. Dans ce laboratoire, les cellules progénitrices neuronales, ou CPN, sont cultivées sur des plaques de matrigel, nourries tous les deux jours et maintenues à une densité très élevée.

Pour fractionner les CPN, aspirez d'abord le milieu, puis ajoutez un millilitre d'Accutase chaud par puits d'une plaque à six puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Transférez délicatement les cellules détachées dans un tube de 15 millilitres contenant du DMEM/F12, en appliquant un stress mécanique aussi faible que possible. N'agitez pas vigoureusement les cellules. Pelletez les cellules par centrifugation à 1000 ×g pendant cinq minutes, aspirez le surnageant après la centrifugation, puis resuspendez les CPN.

Environ un millilitre de milieu NPC par puits d'origine d'une plaque à six puits permet d'obtenir cinq à dix millions de cellules par puits confluent d'une plaque à six puits après resuspension et comptage cellulaire. Repiquez la plaque de NPCs avec environ un à deux millions de cellules par puits d'une plaque à six puits afin de maintenir les NPCs. L'efficacité de formation des neurosphères varie selon les expériences et les lignées cellulaires, mais elle est généralement optimale lorsque entre 200 000 et un million de cellules sont ensemencées par puits d'une plaque non adhérente à six puits ; si des agrégats se forment, réduisez le nombre de cellules ensemencées. Idéalement, effectuez cela un à deux jours après le fractionnement.

Les NPCs NP doivent être transduits à l'aide de vecteurs lentiviraux ou rétroviraux afin d'augmenter le pourcentage de cellules transfectées. Utilisez une infection par centrifugation. Aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par les lentivirus ou rétrovirus d'expression surexprimée ou de contrôle appropriés, titrés à la multiplicité d'infection souhaitée et dilués.

Dans le milieu NPC, utiliser 1,5 millilitre par puits d'une plaque à six puits, centrifuger à 1000 ×g et à température ambiante pendant une heure dans une centrifugeuse pour plaque. Après la centrifugation, replacer la plaque dans l'incubateur afin de réduire la mort cellulaire. Remplacer le milieu dans les huit heures suivant la centrifugation infectieuse.

Commencez cette procédure en lavant une fois les NEUROSPHÈRES dérivées des NPC dans le milieu des NPC afin d'éliminer les débris cellulaires. Inclinez la plaque à un angle de 45 degrés et laissez les neurosphères se déposer, puis retirez autant de milieu que possible sans aspirer les neurosphères. Remplacez par du milieu frais.

Ensuite, sélectionnez manuellement les NEUROSPHÉROÏDES dérivés des NPC au microscope à l’aide d’une pipette P200, en transférant une neurosphéroïde dans chaque puits d’une plaque de 96 puits revêtue de matrigel. Il est important de choisir des neurosphéroïdes de taille similaire afin de réduire la variabilité des résultats. Ajoutez un supplément de 0,5 milligramme de matrigel dilué dans du milieu froid pour NPC aux neurosphéroïdes dans chaque plaque de 96 puits.

À l’aide d’une pipette, centrez manuellement chaque neurosphère individuelle au milieu du puits. Laissez la migration des neurosphères se produire pendant 48 heures. Après la fixation et la coloration des cellules avec les marqueurs immunohistochimiques souhaités, photographiez intégralement les neurosphères à l’aide d’un objectif microscopique Forex. Pour mesurer la migration radiale, utilisez le logiciel ImageJ.

Utilisez l'outil de sélection à main levée pour tracer manuellement le contour des cellules les plus éloignées ayant migré. Assurez-vous que la case « area » est cochée dans la fenêtre de paramétrage des mesures, accessible sous l'onglet analyze. Ensuite, utilisez la fonction measure pour calculer la surface de la forme obtenue.

Utilisez la valeur de la mesure de l'aire et l'équation de l'aire d'un cercle pour déterminer le rayon externe de la même manière, en traçant le bord de la neurosphère d'origine. Mesurez la surface et calculez le rayon interne. Calculez la migration radiale totale comme étant la différence entre les rayons externe et interne.

Ces images montrent les stades de la différenciation neuronale à partir de cellules souches pluripotentes (PSC) en corps embryonnaires, rosettes neurales, cellules progénitrices neuronales (NPC) et neurones. Les NPC validées expriment le marqueur de NPC nesting et le facteur de transcription de cellule souche neurale SOX deux dans la majorité des cellules. Une coloration par la bêta trois tubuline est également visible dans toutes les populations de NPC. Les NPC expriment également le facteur de transcription de cellule souche neurale PAC six et le marqueur de progéniteur cérébral four brainin.

TBR2, mais pas les marqueurs du mésencéphale tels que LMX1A et FOXA2, les NPCs peuvent se différencier en 70 à 80 % de neurones positifs pour la bêta-tubuline 3, montrés en vert, et en 20 à 30 % d'astrocytes positifs pour la protéine acide fibrillaire gliale, montrés en rouge, à partir de PSC de haute qualité. Les NPCs expriment nestine et SOX2 dans la majorité des cellules, tandis que les NPCs de faible qualité présentent des zones de cellules négatives pour SOX2 et négatives pour la nestine. Les neurones âgés de quatre semaines, différenciés à partir de NPCs de haute qualité, expriment MAP2AB et la bêta-tubuline 3.

Après une transduction réussie à l'aide d'un vecteur lentiviral ou rétroviral de haut titre, plus de 80 % des cellules sont marquées par le rapporteur fluorescent. L'inclusion du vecteur lors de la génération de neurosphères produit une population de neurosphères de taille relativement homogène, pouvant rester viable en culture pendant environ une semaine.

Grâce à un alimentation régulière, la migration des neurosphères se produit de manière robuste dans des neurosphères saines, comme le montrent ces images en champ clair avant et après 48 heures de migration dans du Matrigel après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la schizophrénie pour explorer la migration neuronale à partir de cellules progénitrices neuronales dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines. N'oubliez pas que le travail avec un rétrovirus peut présenter un danger potentiel et que toutes les manipulations en culture tissulaire doivent être effectuées en conditions de niveau de biosécurité 2 ou supérieur lorsque la présence de virus est possible.