Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l'embryon de souris Utilisation In Vivo Et In Vitro Essais

L’objectif général de cette procédure est d’analyser la cinétique phénotypique de génération et le nombre de lymphocytes T produits par les progéniteurs thymiques E 13 ou E 18. Pour ce faire, on isole d’abord les lobes thymiques d’embryons de souris E 13, E 14 et E 18. Dans un second temps, les lobes thymiques E 14 sont irradiés puis colonisés par un flux trié E 13 ou E 18 cellules pendant 48 heures dans une goutte suspendue.

Dans la dernière étape, les lobes colonisés sont greffés sous la capsule rénale de souris adultes CD 3 knock-out. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour évaluer la présence de la descendance progénitrice de sédimentation thymique E 13 et E 18 dans le sang des animaux chimériques. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme la culture in vitro de cellules T sur des cellules in-so, est que cette technique combine les méthodes qui permettent une maturation complète des cellules T à partir de progéniteurs définis dans un essai tridimensionnel avec la greffe de cultures d’organes thymiques chez des souris receveuses intactes, permettant l’évaluation de la différenciation et de la fonction des progéniteurs sliques thymiques et de la descendance.

En tant qu’ingénieur de recherche avec une expertise en chirurgie des rongeurs, je vais démontrer la procédure Deux jours avant l’expérience de greffe dans une hotte à flux laminaire, ce que l’abdomen d’une souris femelle enceinte avec 70 % d’éthanol et faire une incision longitudinale dans la peau à la ligne médiane, écarter la peau pour ouvrir l’incision, puis utiliser des pinces et des ciseaux pour ouvrir le péritoine sans toucher le tube digestif. Ensuite, retirez l’utérus bifide et utilisez des ciseaux pour le séparer du vagin. Placez ensuite l’utérus dans une boîte de Pétri de 90 x 15 millimètres contenant 40 à 50 millilitres de DPBS et coupez-la transversalement entre les décidua de chaque embryon.

À l’aide d’une paire de ciseaux à pointe fine et d’une pince fine, vous pouvez retirer la membrane musculaire de l’utérus, en coupant entre le placenta et le sac vitellin pour retirer chaque embryon. Retirez ensuite l’amnio en conservant les embryons et placez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant HBSS plus 1 % FCS. Pour isoler le thymus, placez les embryons un à la fois en position couchée sous une loupe binoculaire.

Insérez ensuite une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum et pincez et ouvrez la grille thoracique à l’aide d’une pince incurvée. Écartez la paroi thoracique pour visualiser les lobes thymiques de chaque côté de la trachée. Ensuite, pincez sous le thymus à l’aide d’une pince fine pour retirer soigneusement chaque lobe et placez-les dans une boîte de Pétri contenant un millilitre de HBSS plus 1 % de FCS.

Ensuite, à l’aide de deux pinces fines, vous pouvez retirer le tissu conjonctif environnant sans endommager les lobes. Ensuite, lavez les lobes dans trois millilitres de HBSS plus 1 % FCS pour éliminer les globules rouges afin de commencer l’irradiation de la culture d’organes thymiques fœtaux. E 14 lobes thymiques isolés d’embryons de CD 45.2 comme nous venons de le démontrer.

Laissez reposer les lobes pendant environ trois heures. Ensuite, faites tourner les progéniteurs thymiques E 13 ou E 18 fraîchement triés. Remettre la pastille en suspension dans le milieu de culture jusqu’à une concentration finale de 500 cellules par 35 microlitres de milieu.

Ensuite, placez une goutte de 35 microlitres de suspension cellulaire dans chaque autre puits d’une plaque terasaki de 60 puits et plaquez un lobe irradié à la surface de chaque goutte. Fermez la plaque et retournez-la pour permettre aux cellules d’atteindre le pôle apical de la goutte par gravité, en frappant doucement la face supérieure de la plaque inversée pour forcer les lobes à glisser vers le bord apical de la goutte. Ensuite, incubez la plaque inversée dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après la colonisation des lobes thymiques, vérifier le niveau d’anesthésie de l’animal receveur par absence de réponse réflexe. Placez ensuite une goutte de pommade pour les yeux sur chaque œil et placez la souris sur son côté droit sous une hotte à flux laminaire. Ensuite, rasez la zone chirurgicale juste au-dessus de l’articulation de la patte arrière.

Ensuite, faites une paire de gants stériles et stérilisez le champ opératoire avec de l’éthanol à 70 % et une solution de IOD DY DER à 10 %. À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 1,5 centimètre à travers le tissu cutané, suivie d’une incision à travers le tissu musculaire. Maintenant, appliquez une légère pression des deux côtés de l’incision pour forcer le rein à sortir de la cavité abdominale et gardez le rein humide avec une solution saline.

Maintenez le rein avec un coton-tige à l’extérieur de la cavité rétropéritonéale et utilisez deux pinces fines pour faire un trou de deux à trois millimètres dans la capsule. Ensuite, en maintenant la paroi de la capsule ouverte avec précaution, glissez jusqu’à six greffons de lobe thymique sous le bord du pôle rénal et replacez le rein dans la cavité rétropéritonéale. Suturer le muscle, une névrose suivie d’une suture cutanée avec des nœuds de chirurgien individuels.

Ensuite, mouillez la plaie avec une solution de povidone à 10 % d’iodure et placez la souris sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius, en surveillant l’animal et la plaie chirurgicale jusqu’à ce qu’ils soient tous deux complètement rétablis afin de déterminer la meilleure méthode pour appauvrir les thymocytes endogènes pour le développement des progéniteurs colonisateurs. Dans cette expérience, les niveaux de reconstitution des lymphocytes T dans un lobe thymique colonisé après une radiothérapie ou un traitement désoxyguiné de cinq jours ont été comparés. Bien qu’aucune différence dans le nombre de lymphocytes colonisants n’ait été observée au neuvième jour de la culture, les lobes irradiés contenaient plus de lymphocytes T que ceux traités avec de la déoxyguine le 12e jour, ce qui fait de l’irradiation le traitement privilégié pour faciliter le développement des lymphocytes T après la colonisation thymique afin d’étudier le potentiel de développement des progéniteurs thymiques E 13 et E 18 ici, Les lobes thymiques irradiés E 14 ont été colonisés par un nombre égal des deux types de progéniteurs observés, les progéniteurs à sédimentation thymique E 13 ont donné naissance à moins de thymocytes et de lymphocytes T double positifs que les progéniteurs à sédimentation thymique E 18.

Cependant, la fréquence des cellules coronariennes matures positives pour la maladie de Crohn a été augmentée et la production de cellules T épithéliales dendritiques n’a été détectée que dans la descendance des progéniteurs de sédimentation thymique E 13 afin d’analyser le potentiel in vivo des progéniteurs de sédimentation thymique E 13 et E 18. Comme nous venons de le démontrer, comme prévu. Les progéniteurs de sédimentation thymique E 13 ont donné naissance aux lymphocytes T plus rapidement que les progéniteurs E 18, bien que le nombre de cellules T circulantes ait été significativement plus faible chez les animaux colonisés par le progéniteur thymique E 13 Dans l’ensemble. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie du développement pour explorer les propriétés du sous-ensemble des lymphocytes T. dont certains sont strictement d’origine embryonnaire dans un modèle mammifère.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tracer les voies différentielles et fonctionnelles des progéniteurs d’installation Timex et de leur progéniture dans un environnement naturel même et dans des conditions compétitives.