Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l'embryon de souris Utilisation

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la cinétique phénotypique de la génération et du nombre de lymphocytes T produits par les progéniteurs colonisant le thymus à E 13 ou à E 18. Ceci est réalisé en isolant d'abord les lobes thymiques d'embryons de souris E 13, E 14 et E 18. Dans une deuxième étape, les lobes thymiques E 14 sont irradiés, puis colonisés par des cellules triées en flux provenant de E 13 ou E 18, et cultivés pendant 48 heures en goutte pendante.

Dans l'étape finale, les lobes colonisés sont greffés sous la capsule rénale de souris adultes CD trois knockouts. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour évaluer la présence des progéniteurs colonisateurs du thymus E 13 et E 18 et de leurs progénies dans le sang des animaux chimériques. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme la culture in vitro de lymphocytes T sur des cellules ine so, est qu'elle combine les méthodes permettant une maturation complète des lymphocytes T à partir de progéniteurs définis dans un test tridimensionnel avec le greffage de cultures d'organes thymiques chez des souris receveuses intactes, permettant ainsi d'évaluer la différenciation et la fonction des progéniteurs thymiques issus de tranches et de leurs progénies.

En tant qu'ingénieur de recherche spécialisé dans la chirurgie sur rongeurs, je vais démontrer la procédure. Deux jours avant l'expérience de greffe, dans une hotte à flux laminaire, désinfecter l'abdomen d'une souris femelle gravide avec de l'éthanol à 70 %, puis pratiquer une incision longitudinale dans la peau au niveau de la ligne médiane. Écarter la peau pour ouvrir l'incision, puis utiliser une pince et des ciseaux pour ouvrir le péritoine sans toucher au tube digestif. Ensuite, extraire l'utérus bifide et utiliser les ciseaux pour le séparer du vagin. Puis placer l'utérus dans une boîte de Pétri de 90 par 15 millimètres contenant 40 à 50 millilitres de DPBS et effectuer une coupe transversale entre les décidualisations de chaque embryon.

Utilisez une paire de ciseaux à pointe fine et une pince fine pour retirer la membrane musculaire de l'utérus en coupant entre le placenta et le sac vitellin afin d'extraire chaque embryon. Ensuite, retirez l'amnios en conservant les embryons, et placez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du HBSS additionné de 1 % de FCS. Pour isoler le thymus, placez les embryons un par un en position dorsale sous une lentille binoculaire grossissante.

Insérez ensuite une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum et pincez, puis ouvrez la cage thoracique à l’aide de pinces courbes. Écartez la paroi thoracique pour visualiser les lobes thymiques de chaque côté de la trachée. Pincez ensuite délicatement sous le thymus à l’aide d’une fine pince afin de retirer soigneusement chaque lobe et placez-les dans une boîte de Pétri contenant un millilitre de HBSS additionné de 1 % de FCS.

Ensuite, utilisez deux pincettes fines pour retirer le tissu conjonctif environnant sans endommager les lobes. Puis lavez les lobes dans trois millilitres de HBSS additionné de 1 % de FCS afin d'éliminer les globules rouges, pour commencer la culture d'organe thymique fœtale irradiée. Lobes thymiques E14 isolés d'embryons CD45.2, comme vient d'être démontré.

Laisser reposer les lobes pendant environ trois heures. Ensuite, centrifuger les progéniteurs thymiques récemment triés E 13 ou E 18. Résuspendre le culot dans le milieu de culture à une concentration finale de 500 cellules par 35 microlitres de milieu.

Ensuite, déposez une goutte de 35 microlitres de suspension cellulaire dans chaque autre puits d'une plaque Terasaki à 60 puits et placez un lobe irradié à la surface de chaque goutte. Fermez la plaque et retournez-la afin de laisser les cellules atteindre le pôle apical de la goutte par gravité, en tapotant doucement le côté supérieur de la plaque retournée pour forcer les lobes à glisser vers le bord apical de la goutte. Incubez ensuite la plaque retournée dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois que les lobes thymiques ont été colonisés, vérifiez le niveau d'anesthésie de l'animal receveur par l'absence de réponse réflexe. Appliquez ensuite une goutte de pommade ophtalmique sur chaque œil et placez la souris sur son côté droit sous une hotte à flux laminaire. Rassemblez ensuite la zone chirurgicale juste au-dessus de l'articulation de la patte arrière.

Ensuite, mettez une paire de gants stériles et stérilisez le champ opératoire avec de l'éthanol à 70 % et une solution de 10 % IOD DY DER. Utilisez un scalpel pour pratiquer une incision de 1,5 centimètre à travers le tissu cutané, suivie d'une incision dans le tissu musculaire. Appliquez maintenant une légère pression sur les deux côtés de l'incision pour faire sortir le rein de la cavité abdominale et maintenez le rein humide avec une solution saline.

Conserver le rein avec un coton-tige à l'extérieur de la cavité rétropéritonéale, et utiliser deux pincettes fines pour pratiquer un orifice de deux à trois millimètres dans la capsule. Ensuite, en maintenant délicatement la paroi de la capsule ouverte, glisser soigneusement jusqu'à six greffons de lobes thymiques sous celle-ci vers le bord du pôle rénal, puis remettre le rein dans la cavité rétropéritonéale. Suturer le muscle avec une névrose, suivie d'un point de suture cutané réalisé avec des nœuds chirurgicaux individuels.

Ensuite, humidifiez la plaie avec une solution de povidone iodée à 10 %, puis placez la souris sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius, en surveillant l'animal et la plaie chirurgicale jusqu'à leur récupération complète afin de déterminer la meilleure méthode pour éliminer les thymocytes endogènes en vue du développement de progéniteurs colonisants. Dans cette expérience, les niveaux de réconstitution des lymphocytes T dans un lobe thymique colonisé après un traitement par irradiation ou par désoxyguanosine pendant cinq jours ont été comparés. Bien qu'aucune différence dans le nombre de lymphocytes colonisants ne soit apparente au neuvième jour de culture, les lobes irradiés contenaient davantage de lymphocytes T que ceux traités à la désoxyguanosine au douzième jour, ce qui rend l'irradiation le traitement privilégié pour favoriser le développement des lymphocytes T après la colonisation thymique afin d'étudier le potentiel développemental des progéniteurs thymiques sédentarisant à E 13 et à E 18. Ici, des lobes thymiques irradiés à E 14 ont été colonisés par un nombre égal des deux types de progéniteurs. Comme observé, les progéniteurs thymiques sédentarisant à E 13 ont donné naissance à moins de thymocytes et de lymphocytes T double positifs que les progéniteurs thymiques sédentarisant à E 18.

La fréquence des cellules matures CD3 positives était toutefois augmentée, et la production de cellules T épithéliales dendritiques n’a été détectée que chez la descendance des progéniteurs colonisant le thymus au stade E13. Afin d’analyser le potentiel in vivo des progéniteurs colonisant le thymus aux stades E13 et E18, des lobes thymiques colonisés par chacun de ces types de progéniteurs ont été greffés sous la capsule rénale de receveurs déficients pour le CD3. Comme vient de l’être démontré, conformément aux attentes, les progéniteurs colonisant le thymus au stade E13 ont donné naissance à des cellules T plus rapidement que les progéniteurs E18, bien que le nombre de cellules T circulantes soit globalement significativement plus faible chez les animaux colonisés par les progéniteurs colonisant le thymus au stade E13. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l’immunologie du développement pour explorer les propriétés des sous-populations de cellules T, dont certaines sont strictement d’origine embryonnaire, dans un modèle de mammifère.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tracer les voies différentielles et fonctionnelles des progéniteurs en voie de sédimentation de Timex et de leur descendance dans un environnement naturel, même en conditions compétitives.