Name: Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans lembryon de souris Utilisation In Vivo Et In Vitro Essais (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la caractérisation des progéniteurs thymiques dans l'embryon de souris par des essais in vivo et in vitro. Cette méthode permet d'analyser la cinétique et le phénotype des cellules T produites.

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Soutenu par l&#39;Institut Pasteur, l&#39;Inserm, l&#39;Agence Nationale de Recherche (ANR Grant &#39;Lymphopoïèse&#39;), le Programme d&#39;investissement REVIVE avenir et «La Ligue contre le cancer&quot;.

Déclaration éthique: toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Ethique Institut Pasteur, approuvé par le ministère français de l&#39;Agriculture, et les lignes directrices de l&#39;UE. Un manipulateur avec une formation sur la chirurgie petit rongeur, certifié par le ministère français de l&#39;Agriculture, effectue toutes les interventions chirurgicales. NOTE: Voir en annexe le tableau 1 montrant la procédure du plan en 5 étapes. 1. La sélection des embryons <ol><li> Utilisez 36 femelles C57BL / 6 CD45.2, 12 femelles CD45.1, 12 C57BL / 6 Les mâles CD45.1 et 12 C57BL / 6 mâles CD45.2. Traverser les femelles avec soit le génotype mâle va produire des embryons CD45.1 / 2 et CD45.1 utilisés comme une source de TSP ou CD45.2 utilisé comme une source de bénéficiaires lobes thymiques. Maison tous les mâles individuellement. </li><li> Pour obtenir des embryons pour E18 TSP isolement, placez 2 femelles dans une cage avec un mâle CD45.1 à 18 heures, 21 jours avant l&#39;expérience de greffage. Vérifier la présence d&#39;un bouchon vaginal le lendemain, avant midi. Sepaévaluer les femelles branchés. </li><li> Pour obtenir des embryons E14 à être colonisée par TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles CD45.2, 17 jours avant l&#39;expérience de greffage. </li><li> Pour obtenir des embryons pour isoler E13 TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles C57BL / 6 CD45.1, 16 jours avant l&#39;expérience de greffage. </li></ol> 2. Dissection du embryons Sous une Horizontal Hotte à flux laminaire REMARQUE: Deux jours avant l&#39;expérience de greffage. <ol><li> Sacrifice des femelles gravides par dislocation cervicale ou par administration progressive du CO 2 gazeux pendant au moins 5 min, dans une enceinte fermée saturation. Veiller à la mort par arrêt définitif des mouvements de cardio-respiratoires. Mouillez l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision longitudinale dans la peau à l&#39;abdomen de la ligne médiane et l&#39;ouvrir en tirant la peau de l&#39;autre. Ouvrir le péritoine avec des pinces et des ciseaux, sans toucher le tube digestif. Sortez le uter bifidenous et le séparer du vagin avec les ciseaux. </li><li> Placez l&#39;utérus dans un plat de 90 x 15 mm de Pétri contenant 40-50 ml DPBS et couper transversalement entre la caduque de chaque embryon. </li><li> Avec la paire de ciseaux fins de pointe et une pince fine retirer la membrane musculaire de l&#39;utérus, sortez les embryons en coupant entre le placenta et le sac jaune, et de supprimer l&#39;amnios, qui est retenue les embryons. </li><li> Placez les embryons dans une boîte de Pétri de 90 x 15 mm contenant HBSS + 1% de sérum de veau foetal (FCS). Pour les embryons âgés de plus de E15, retirez les têtes avec une paire de ciseaux avant toute nouvelle dissection. </li></ol> 3. Isolement du Thymus <ol><li> Sous la loupe binoculaire, placer l&#39;embryon, se trouvant en position couchée (vue ventrale), sur une literie de gaze humide. </li><li> Insérez une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum, pincer et ouvrir la grille thoracique. Avec pince courbe, tirez la paroi thoracique de côté pour visualiser le thymic lobes de chaque côté de la trachée. </li><li> Tenez soigneusement chaque lobe en pinçant dessous avec une pince fine et les placer dans une boîte de Pétri contenant 1 ml de HBSS + 1% de FCS. Isoler les lobes et enlevez tissu conjonctif environnant avec deux seringues de 1 ml + 26 G ⅜ &quot;aiguilles, sans endommager la capsule. </li><li> Laver les lobes dans 3 ml de HBSS + 1% de FCS pour éliminer les cellules sanguines. REMARQUE: Avant E15, lobes thymiques sont situés de chaque côté de la trachée et fusible plus tard dans le milieu pour constituer un organe bi-lobaire. </li></ol> 4. suspensions cellulaires <ol><li> Démêler les lobes sous la loupe binoculaire, avec deux aiguilles 26 G montés sur seringues de 1 ml, dans HBSS + 1% de FCS. On filtre la suspension de cellules à travers une maille de nylon. </li></ol> 5. coloration avec des anticorps et des cellules fluorescentes tri NOTE: Tous les anticorps sont préalablement titrés pour obtenir la définition optimale des populations (le titration peut varier avec le lot d&#39;anticorps). <ol><li> Incuber les thymocytes (E13 ou E18) pour 15-30 minutes à 4 ° C avec 100 ul d&#39;un cocktail d&#39;anticorps biotinylés pour colorer les cellules positives de la lignée (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Pour laver l&#39;excès d&#39;anticorps ralentissent les tubes avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS à 280 g pendant 7 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans HBSS frais + 1% de FCS. Répétez la centrifugation. </li><li> Incuber les cellules marquées à la biotine E18 avec les microbilles de streptavidine pendant 15 minutes à 4 ° C et laver les cellules deux fois dans du HBSS à 1% de FCS. Re-suspendre les cellules dans 2 ml de HBSS + 1% de FCS. La plupart des thymocytes E13 sont lignée négative et ne nécessitent donc pas MACS enrichissement avant le tri de cellules. </li><li> Faire passer les cellules sur la colonne de LS, selon les instructions du fabricant. Lorsque toute la suspension de cellules est entré dans la colonne d&#39;ajouter 2 ml de HBSS + 1% de FCS. Récupérer le4 ml de l&#39;écoulement à travers la colonne et centrifuger les cellules pendant 7 minutes à 280 x g. </li><li> Re-suspendre le culot E18 soit appauvri ou thymocytes totaux E13 dans 50 pi de l&#39;anticorps mélange TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 et streptavidine Pacific Blue ) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de HBSS + 1% de FCS avec de l&#39;iodure de propidium. </li><li> Trier la FST Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 bas CD127 + cellules dans un FACS (avec 4 lasers) sur une tubes de 1,5 ml contenant 200 pi de milieu complet + 20% FCS. Première porte les cellules en fonction de leur taille et de granularité sur le FSC et les canaux de la SSC. Éliminer les cellules mortes (coloration avec l&#39;iodure de propidium), porte sur doublets et marquer la fluorescence dans les échelles exponentielles. Environ 100 ou 600 FST peuvent être obtenus d&#39;un E13 ou E18 un thymus, respectivEly. </li></ol> 6. La colonisation de E14 thymique lobes avec progéniteurs: Hanging Technique Goutte <ol><li> Irradier (30 Grays = 30 Gy) E14 lobes thymiques à partir d&#39;embryons CD45.2, 3 h avant la culture. NOTE: E14 ou E15 lobes thymiques ont été utilisés avec succès en tant que destinataire de progéniteurs de lymphocytes T. Utilisation bénéficiaires lobes thymiques de résultats ultérieurs jours de gestation dans la nécrose prématurée en raison de la grande taille de l&#39;organe tout en lobes thymiques au antérieures jours de gestation développent mal, probablement en raison du développement incomplet des cellules épithéliales. </li><li> Centrifugeuse triés FST et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture (OPTI-MEM milieu complet avec 10% de FCS, de la pénicilline (50 unités / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de 2β-mercaptoéthanol (50 uM)) de telle sorte que 35 ul contient 500 TSP. </li><li> Déposer une goutte de 35 pi de suspension cellulaire tous les autres puits d&#39;une plaque bien Terasaki 60. REMARQUE: 35 ul gouttes peuvent fusionner si elles sont placées dans des puits adjacents. </li><li> Placer une lobe irradié sur la surface de chaque goutte. Fermez la plaque Terasaki et tourner la plaque à l&#39;envers pour laisser les cellules atteignent le pôle apical de la goutte par gravité. </li><li> Hit doucement le côté supérieur de la plaque inversée pour forcer les lobes de coulisser sur le bord apical de la goutte. Incuber la plaque Terasaki inversé dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 ° C + 5% CO 2. Après la colonisation, soit la culture E14 thymus dans FTOC 7, ou greffé sous la capsule du rein d&#39;une souris adulte bénéficiaire 8. </li></ol> 7. fœtale thymique Organ Culture <ol><li> Placer 3 ml de milieu complet dans un plat de Pétri de 35 mm. Placer un filtre à membrane de isopore flottant sur le support. Placez les lobes reconstituées sur le bord de la membrane avec une pince (pas plus de huit lobes sur une seule membrane). </li><li> Placez les boîtes de Pétri contenant les lobes thymiques dans un plat de 90 mm de Petri, avec une boîte de 35 mm, sans couvercle, contenant 2 ml de Water, à assurer une humidité optimale. Incuber 12 jours à 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Les greffes sous la capsule du rein dans des conditions stériles NOTE: Le parenchyme rénal est entouré par du tissu conjonctif formant une capsule. La région sous-capsulaire est particulièrement riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques, fournissant ainsi un environnement approprié pour le développement des greffes (par exemple, les lobes thymiques, des îlots pancréatiques ou des cœurs nouveau-nés). Les greffes sont habituellement effectuées sur le rein gauche, car il est plus accessible que le rein droit. CD3 - / - souris mâles ont été utilisés en tant que bénéficiaires évitant ainsi la réaction du greffon contre l&#39;hôte due à des antigènes mineurs d&#39;histocompatibilité liés au chromosome Y parce que la détermination du sexe avant E15 est pas fait facilement. <ol><li> Stériliser les instruments et porter des gants stériles long de la chirurgie. Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d&#39;une solution de kétamine à 10 mg / ml + 1 mg de xylazine /ml dilué dans du PBS (50 à 100 pl par 10 g de poids corporel), en utilisant une seringue de 1 ml. Vérifiez l&#39;anesthésie en vérifiant l&#39;absence de réflexes interdigitaux. Déposer une goutte de gel hydro-Optimune sur chaque œil pour prévenir la sécheresse pendant l&#39;anesthésie. NOTE: La solution doit être préparée de manière inopinée et réchauffé à température ambiante avant l&#39;injection. L&#39;anesthésie dure au moins 20 min. Le degré de l&#39;anesthésie doit être contrôlée tout au long de la chirurgie. L&#39;anesthésie peut être prolongée par injection intra-péritonéale de la moitié de la dose toutes les 20 min. </li><li> Placez la souris sur son côté droit, sous une hotte à flux lamina horizontale. Stériliser le champ opératoire avec 70% d&#39;éthanol et 10% d&#39;une solution dermique iodure. Avec une partie de la pince à cheveux de la souris sur une longueur de 2 cm au-dessus de l&#39;articulation de la patte postérieure. Rasez la zone chirurgicale. </li><li> Avec un scalpel, faire un cm de longueur de la première, le tissu cutané incision 1,5, puis avec des ciseaux coupent le tissu musculaire. Appliquer une légère pression sur les deux côtés de l&#39;incision, Ce qui forcera le rein hors de la cavité abdominale. </li><li> Appliquer une solution saline avec un coton tige pour garder le rein humide. Si vous avez des difficultés à exposer l&#39;orgue, utilisez une pince à plat pour retirer le tissu adipocytaire environnante à laquelle le rein est attaché. Maintenir le rein hors de la cavité rétropéritonéale par un coton-tige placée au-dessous de l&#39;organe. </li><li> Avec deux pinces fines, faire un trou de 2-3 mm dans la capsule (éviter de toucher le parenchyme pour prévenir les saignements). Pendant toute la procédure chirurgicale garder la capsule rénale exposée en permanence humide. </li><li> Insérez soigneusement les lobes sous la capsule du rein, par le maintien de la paroi de la capsule ouverte et faites glisser la greffe sous la capsule vers le pôle de bord. Placez jusqu&#39;à 6 lobes par les reins. </li><li> Remplacer le rein dans la cavité rétro-péritonéale. Suturer les aponévroses musculaires, puis la peau avec des nœuds de chirurgien individuels. Mouiller la plaie avec 10% de solution de povidone iodure. Placez la souris sur un an chaufféed à 37 ° C. </li><li> Enquête sur la souris transplanté jusqu&#39;au rétablissement complet de l&#39;anesthésie par le contrôle des cardiaques, respiratoires et moustaches mouvements, couleurs muqueuses jusqu&#39;à la récupération totale vu par autonome mouvements. NOTE: Nous vous recommandons injection d&#39;une solution analgésique (buprénorphine, 0,1 mg / kg) intra musculaire juste après la chirurgie et les deux jours suivant la chirurgie pour prévenir la douleur post-opératoire. </li><li> Gardez l&#39;animal opéré dans l&#39;isolement jusqu&#39;à guérison complète. Inspecter tous les deux jours les points de suture de la plaie pour vérifier et prévenir l&#39;infection. Jamais observé infection de la plaie suivant cette procédure. NOTE: Analyse hebdomadaire de cellules sanguines périphériques de la CD3 - / - souris greffées nous permettent de détecter l&#39;thymique populations issues provenaient soit progéniteurs E13 ou E18 en utilisant le marqueur CD45 allotypique et la lignée de cellules T anticorps spécifiques (Figure 3). </li></ol> 9. Analyse de la descendance TSP par cytométrie en flux <ol><li&gt; taquiner le FTOCs individuellement pour obtenir des suspensions de cellules uniques (voir la section de protocole 4). </li><li> Suspensions cellulaires tache de lobes individuels avec un mélange d&#39;anticorps contenant des anticorps reconnaissant CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE et incuber comme décrit dans la section 5. </li><li> Re-suspendre les cellules dans HBSS + 1% FCS + iodure de propidium et d&#39;analyser dans un cytomètre de flux (voir résultats de la figure 2). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Deux principaux essais peuvent être utilisés pour analyser la différenciation des cellules T ex vivo. Le plus récemment rapporté est la co-culture de progéniteurs hématopoïétiques avec des cellules stromales BM, OP9, exprimant les ligands de Noth1, delta comme 1 ou 4 12. Cette analyse 2-D est facile à réaliser, très efficace et sensible, permettant une analyse à le niveau de la cellule unique. Toutefois, il ne soutient le développement des cellules T au-delà de la phase de DP ni la génération de γδ D...

Lymphocytes T, portant le αβ ou le récepteur de lymphocytes T γδ de (TcR), se différencient dans un organe spécialisé, le thymus. Le thymus entièrement développé est divisé en deux régions distinctes: le cortex, où progéniteurs thymiques se développent et où thymocytes qui réarrangent productive les β TCR et gènes de la chaîne α sont sauvés de la mort programmée (un processus connu sous le nom sélection positive); et la moelle, où sélectionné thymocytes trop forte réactivité aux auto-ligands sont supprimés (sélection négative) 1,2. Le thymus est originaire de la couche endodermique de la troisième poche pharyngienne qui est ensuite entouré par trois cellules mésenchymateuses. Il est colonisée par les progéniteurs hématopoïétiques à partir de jour embryonnaire E12 et, par la suite, le recrutement continue T est requis pour le développement des cellules normales 4. Immigrés thymiques évoluent par étapes de développement successives, orchestrée par un programme strictement réglementé, initié et maintained par l&#39;activation de la voie de signalisation Notch dans les thymocytes lors de l&#39;interaction avec son ligand, comme delta 4, exprimé sur les cellules épithéliales thymiques (CET) 5. le développement de Thymocyte commence au CD4 dite - CD8 - Double Negative (DN) étapes. Thymocytes DN peuvent être subdivisés selon l&#39;expression de CD25 et CD44 dans DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) et DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) et CD117 (c-kit) subdivise le compartiment DN1 en 5 sous-ensembles où DN1A et b correspondent aux progéniteurs thymiques précoces (ETP). Thymocytes réorganiser les δ, β et α chaînes de TCR au stade DN et subissent pré-TcR sélection (stades DN3-DN4). Ils ont en outre en commun pour le CD4 + CD8 + double positif (DP) compartiment où la chaîne α TcR réorganise avant sele positif et négatifction. A ce stade, la plupart des thymocytes sont éliminés et seulement un faible pourcentage (3-5%) atteignent la CD4 + ou CD8 + T matures compartiment cellulaire. La voie de différenciation lymphoïde progresse à travers les étapes de la CSH qui génèrent des progéniteurs multipotentes (MPP) et les progéniteurs lymphoïdes multipotentes amorcée (PPSP) qui ont perdu des érythrocytes et le potentiel 6 mégacaryocytes. PPSP sont phénotypiquement définie par l&#39;absence de marqueurs de cellules sanguines différenciées (lignée négative, Lin -), l&#39;expression de c-Kit (CD117), Sca-1 et Flt3 / flk2 (CD135) et l&#39;absence de taux détectables de l&#39;interleukine ( IL) -7 récepteur α chaîne (IL-7rα ou CD127). LMPPs différencient en précurseurs communs lymphoïdes (CLP) 7 qui à ce stade ont perdu la capacité de générer des cellules myéloïdes. CLP conserver lymphocytes (cellules B et T), cellules NK, DC et la cellule lymphoïde innée (CIT) de potentiel, et diffèrent de PPSP par l&#39;expression de CD127 et l&#39;absence de niveaux élevés de Sca-1. Bien que la nature des thymiques régler progéniteurs (TSP) a été largement débattue 8, il est récemment devenu clair que TSP changement phénotype, le potentiel et la fonction de différenciation, tout au long du développement 9. Nous avons effectué in vitro et in vivo pour caractériser la TSP, isolé par la cellule de tri FACS soit E13 (première vague) ou E18 (deuxième vague). Cultures thymiques foetaux d&#39;organes (FTOC) avec lobes thymiques irradiés colonisés par un nombre égal de E13 et E18 progéniteurs, portant différents marqueurs de allotypiques, admis suivant leur progéniture dans un environnement de développement similaire et révélées propriétés intrinsèques cellulaires, différents entre les deux types de progéniteurs. Lobes thymiques colonisés par E13 ou E18 soit TSP permis le développement sans sélection en raison de la concurrence entre les deux progéniteurs. In vivo transplantation des lobes thymiques colonisés en outre montré que aussi til descendance mature de E13 et E18 TSP ont différentes propriétés biologiques in vivo. FST de la première vague de générer rapidement des cellules T, mais donnent lieu à un faible nombre de cellules T αβ et γδ. Parmi ces derniers, nous avons détecté des cellules dendritiques Vγ5Vδ1 épithéliales T (DETC), qui ont un TcR invariant, migrent vers l&#39;épiderme où ils exercent une fonction dans la cicatrisation des plaies et ne sont produites pendant le développement embryonnaire 10. En revanche, TSP de la deuxième vague de prendre plus de temps pour générer des nombres élevés de cellules TcR + T et sont incapables de générer DETC.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri pour la culture de tissus plastiques de 90 x 15 mm et 35 x 15 mm.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Échantillonnage</td></tr><tr><td>26 G & frac38 ; " Seringues de 0,45 x 10 mm avec aiguilles,</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Suspension cellulaire</td></tr><tr><td>, maille de nylon, toile de boulonnage stérilisée, pièces de 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration des cellules</td></tr><tr><td>Éthanol 70 %.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Actions de stérilité</td></tr><tr><td>Iodure Povidone 10 % (Bétadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Actions de stérilité</td></tr><tr><td>Kétamine 100 mg/ml (solution mère)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml dans du PBS (solution mère)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthésique et relaxant musculaire</td></tr><tr><td>Buprénorphine 0,3 mg/ml solution mère</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Analgésique morphinique</td></tr><tr><td>Gel ophtalmique (0,2 % de cyclosporine)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Protection oculaire</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>pour isoler les embryons</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>pour éliminer le sang et disséquer les embryons</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Milieu pour cultures</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additif pour cultures</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotiques pour cultures</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additif pour cultures</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscope de dissection</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occulaire W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Source de lampe froide</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Deux fibres de col de cygne adaptées</td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Tampon de dissection</td></tr><tr><td>Cuillère, ronde et perforée</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10370-18</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Fine Ciseaux à iris</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14090-09</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15018-10</td><td>Outils pour les</td>sciences</tr><tr><td>fines Pince : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>2 paires de pinces d’horloger droites fines Dumont #5 11 cm pointes fines.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Fil de polyamide avec aiguille 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>pour sutures</td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>pour sutures</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Pour maintenir la température de la souris pendant l’anesthésie</td></tr><tr><td>Membrane Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Pour FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 puits</td><td>plaques FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Pour la technique de la goutte suspendue</td></tr><tr><td>Écouvillons de gaze stériles 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Pour appliquer une solution désinfectante</td></tr><tr><td>Anticorps marqués à la fluorescence ou à la biotine</td><td>BD Biosciences, Biolegend ou e-Biocsiences&nbsp ;</td><td>Nombre de clones voir tableau ci-dessous</td><td>Cellules de coloration</td></tr><tr><td>MACS Colonnes/Streptavidine Microbilles</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Épuisement cellulaire</td></tr><tr><td>Souris</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) et Janvier Labs&nbsp ; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OU CD45.2</td><td>Source des cellules et des lobes thymiques</td></tr><tr><td>Souris</td><td>CDTA Orl&eacute ; ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Expérience de greffe</td></tr></tbody></table>

caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris utilisation<em&gt; in vivo</em&gt; et<em&gt; in vitro</em&gt; essais

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caractériser thymiques régler progéniteurs est important de comprendre les étapes de pré-thymiques du développement des cellules T, essentiels pour élaborer des stratégies pour le remplacement des cellules T chez les patients lymphopéniques. Nous avons étudié thymique régler progéniteurs de murin jour embryonnaire 13 et 18 thymus par deux complémentaires in vitro et in vivo techniques, tous deux basés sur la méthode &quot;goutte suspendue&quot;. Cette méthode a permis de coloniser irradiés lobes thymiques foetaux avec E13 et / ou E18 progéniteurs CD45 thymiques distingués par marqueurs allotypiques et suivants de leur progéniture ainsi. La colonisation par des populations mixtes permet d&#39;analyser les différences cellulaires autonomes dans les propriétés biologiques des progéniteurs tandis colonisation soit avec la population supprime possibles pressions sélectives compétitifs. Les lobes thymiques colonisés peuvent également être greffés chez des souris immunodéficientes bénéficiaires masculins permettant l&#39;analyse de la descendance maturité des cellules T in vivo, tels que la dynamique des populations de til périphérique système immunitaire et la colonisation de différents tissus et organes. Des cultures d&#39;organes thymiques foetaux révélé que progéniteurs E13 développées rapidement dans tous maturité cellules CD3 + et ont donné lieu à la sous-ensemble de cellules T γδ canonique, connu sous le nom de cellules T épithéliales dendritiques. En comparaison, les progéniteurs E18 ont un retard de différenciation et ont été incapables de générer des cellules dendritiques T épithéliale. La surveillance de sang périphérique de CD3 thymus greffé - / - souris en outre montré que les progéniteurs E18 thymique décantation génèrent, avec le temps, un plus grand nombre de cellules T matures que leurs homologues E13, une caractéristique qui n&#39;a pas pu être apprécié dans le thymus du fœtus à court terme des cultures d&#39;organes.

Afin de choisir une méthode d&#39;épuiser lobes thymiques de thymocytes endogènes permettant le meilleur développement des progéniteurs colonisateurs, nous avons comparé les niveaux de T reconstitution cellulaire dans lobes thymiques colonisés après irradiation ou un désoxy-guanosine 5 jours (d-Gua) traitement. Les résultats montrent que bien qu&#39;il n&#39;y ait pas de différence au jour 9 de la culture, lobes irradiés contiennent plus de cellules T que ceux traités avec d-Gua, au jour 12. Ainsi, l&#39;irradiation est...

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la cinétique phénotypique de la génération et du nombre de lymphocytes T produits par les progéniteurs colonisant le thymus à E 13 ou à E 18. Ceci est réalisé en isolant d'abord les lobes thymiques d'embryons de souris E 13, E 14 et E 18. Dans une deuxième étape, les lobes thymiques E 14 sont irradiés, puis colonisés par des cellules triées en flux provenant de E 13 ou E 18, et cultivés pendant 48 heures en goutte pendante.Dans l'étape finale, les lobes colonisés sont greffés sous la capsule rénale de souris adultes CD trois knockouts. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour évaluer la présence des progéniteurs colonisateurs du thymus E 13 et E 18 et de leurs progénies dans le sang des animaux chimériques. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme la culture in vitro de lymphocytes T sur des cellules ine so, est qu'elle combine les méthodes permettant une maturation complète des lymphocytes T à partir de progéniteurs définis dans un test tridimensionnel avec le greffage de cultures d'organes thymiques chez des souris receveuses intactes, permettant ainsi d'évaluer la différenciation et la fonction des progéniteurs thymiques issus de tranches et de leurs progénies.En tant qu'ingénieur de recherche spécialisé dans la chirurgie sur rongeurs, je vais démontrer la procédure. Deux jours avant l'expérience de greffe, dans une hotte à flux laminaire, désinfecter l'abdomen d'une souris femelle gravide avec de l'éthanol à 70 %, puis pratiquer une incision longitudinale dans la peau au niveau de la ligne médiane. Écarter la peau pour ouvrir l'incision, puis utiliser une pince et des ciseaux pour ouvrir le péritoine sans toucher au tube digestif. Ensuite, extraire l'utérus bifide et utiliser les ciseaux pour le séparer du vagin. Puis placer l'utérus dans une boîte de Pétri de 90 par 15 millimètres contenant 40 à 50 millilitres de DPBS et effectuer une coupe transversale entre les décidualisations de chaque embryon.Utilisez une paire de ciseaux à pointe fine et une pince fine pour retirer la membrane musculaire de l'utérus en coupant entre le placenta et le sac vitellin afin d'extraire chaque embryon. Ensuite, retirez l'amnios en conservant les embryons, et placez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du HBSS additionné de 1 % de FCS. Pour isoler le thymus, placez les embryons un par un en position dorsale sous une lentille binoculaire grossissante.Insérez ensuite une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum et pincez, puis ouvrez la cage thoracique à l’aide de pinces courbes. Écartez la paroi thoracique pour visualiser les lobes thymiques de chaque côté de la trachée. Pincez ensuite délicatement sous le thymus à l’aide d’une fine pince afin de retirer soigneusement chaque lobe et placez-les dans une boîte de Pétri contenant un millilitre de HBSS additionné de 1 % de FCS.Ensuite, utilisez deux pincettes fines pour retirer le tissu conjonctif environnant sans endommager les lobes. Puis lavez les lobes dans trois millilitres de HBSS additionné de 1 % de FCS afin d'éliminer les globules rouges, pour commencer la culture d'organe thymique fœtale irradiée. Lobes thymiques E14 isolés d'embryons CD45.2, comme vient d'être démontré.Laisser reposer les lobes pendant environ trois heures. Ensuite, centrifuger les progéniteurs thymiques récemment triés E 13 ou E 18. Résuspendre le culot dans le milieu de culture à une concentration finale de 500 cellules par 35 microlitres de milieu.Ensuite, déposez une goutte de 35 microlitres de suspension cellulaire dans chaque autre puits d'une plaque Terasaki à 60 puits et placez un lobe irradié à la surface de chaque goutte. Fermez la plaque et retournez-la afin de laisser les cellules atteindre le pôle apical de la goutte par gravité, en tapotant doucement le côté supérieur de la plaque retournée pour forcer les lobes à glisser vers le bord apical de la goutte. Incubez ensuite la plaque retournée dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Une fois que les lobes thymiques ont été colonisés, vérifiez le niveau d'anesthésie de l'animal receveur par l'absence de réponse réflexe. Appliquez ensuite une goutte de pommade ophtalmique sur chaque œil et placez la souris sur son côté droit sous une hotte à flux laminaire. Rassemblez ensuite la zone chirurgicale juste au-dessus de l'articulation de la patte arrière.Ensuite, mettez une paire de gants stériles et stérilisez le champ opératoire avec de l'éthanol à 70 % et une solution de 10 % IOD DY DER. Utilisez un scalpel pour pratiquer une incision de 1,5 centimètre à travers le tissu cutané, suivie d'une incision dans le tissu musculaire. Appliquez maintenant une légère pression sur les deux côtés de l'incision pour faire sortir le rein de la cavité abdominale et maintenez le rein humide avec une solution saline.Conserver le rein avec un coton-tige à l'extérieur de la cavité rétropéritonéale, et utiliser deux pincettes fines pour pratiquer un orifice de deux à trois millimètres dans la capsule. Ensuite, en maintenant délicatement la paroi de la capsule ouverte, glisser soigneusement jusqu'à six greffons de lobes thymiques sous celle-ci vers le bord du pôle rénal, puis remettre le rein dans la cavité rétropéritonéale. Suturer le muscle avec une névrose, suivie d'un point de suture cutané réalisé avec des nœuds chirurgicaux individuels.Ensuite, humidifiez la plaie avec une solution de povidone iodée à 10 %, puis placez la souris sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius, en surveillant l'animal et la plaie chirurgicale jusqu'à leur récupération complète afin de déterminer la meilleure méthode pour éliminer les thymocytes endogènes en vue du développement de progéniteurs colonisants. Dans cette expérience, les niveaux de réconstitution des lymphocytes T dans un lobe thymique colonisé après un traitement par irradiation ou par désoxyguanosine pendant cinq jours ont été comparés. Bien qu'aucune différence dans le nombre de lymphocytes colonisants ne soit apparente au neuvième jour de culture, les lobes irradiés contenaient davantage de lymphocytes T que ceux traités à la désoxyguanosine au douzième jour, ce qui rend l'irradiation le traitement privilégié pour favoriser le développement des lymphocytes T après la colonisation thymique afin d'étudier le potentiel développemental des progéniteurs thymiques sédentarisant à E 13 et à E 18. Ici, des lobes thymiques irradiés à E 14 ont été colonisés par un nombre égal des deux types de progéniteurs. Comme observé, les progéniteurs thymiques sédentarisant à E 13 ont donné naissance à moins de thymocytes et de lymphocytes T double positifs que les progéniteurs thymiques sédentarisant à E 18.La fréquence des cellules matures CD3 positives était toutefois augmentée, et la production de cellules T épithéliales dendritiques n’a été détectée que chez la descendance des progéniteurs colonisant le thymus au stade E13. Afin d’analyser le potentiel in vivo des progéniteurs colonisant le thymus aux stades E13 et E18, des lobes thymiques colonisés par chacun de ces types de progéniteurs ont été greffés sous la capsule rénale de receveurs déficients pour le CD3. Comme vient de l’être démontré, conformément aux attentes, les progéniteurs colonisant le thymus au stade E13 ont donné naissance à des cellules T plus rapidement que les progéniteurs E18, bien que le nombre de cellules T circulantes soit globalement significativement plus faible chez les animaux colonisés par les progéniteurs colonisant le thymus au stade E13. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de l’immunologie du développement pour explorer les propriétés des sous-populations de cellules T, dont certaines sont strictement d’origine embryonnaire, dans un modèle de mammifère.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment tracer les voies différentielles et fonctionnelles des progéniteurs en voie de sédimentation de Timex et de leur descendance dans un environnement naturel, même en conditions compétitives.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l'imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Cette vidéo présente un protocole permettant de générer des lymphocytes T fonctionnels spécifiques de l’antigène à partir de lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC à l’aide d’un système de culture thymique tridimensionnelle. La co-culture des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC avec des lobes thymiques fœtaux fœtaux de souris endogènes appauvris en lymphocytes a permis de maturation réussie des lymphocytes T pour former des émigrants thymiques (iTE) dérivés de CD8αβ+ du CMH de classe I+.

Système de culture thymique tridimensionnelle pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC

Les cellules souches embryonnaires de souris peuvent être différenciées en cellules T in vitro à l’aide du système de co-culture OP9-DL1. Le succès de cette procédure nécessite une attention particulière à l’entretien des réactifs/cellules et des étapes clés sensibles à la technique. Nous discutons ici de ces paramètres critiques et fournissons un protocole détaillé pour encourager l’adoption de cette technologie.

Dérivation des cellules T In Vitro De la souris les cellules souches embryonnaires

L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l'analyse quantitative in situ de l'expression des protéines à l'étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l'imagerie d'échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l'analyse d'images sont décrites.

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Dans cet article, nous décrivons un protocole afin de caractériser les T-dépendants et indépendants de T les réponses isotype immunoglobuline (Ig) chez la souris à l’aide d’ELISA. Cette méthode utilisée seule ou en combinaison avec écoulement cytometry permettra aux chercheurs d’identifier les différences dans les réponses d’isotype Ig médiée par les lymphocytes B chez les souris après vaccination antigène T-dépendants et indépendants de T.

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.

Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

Découvrez la caractérisation des progéniteurs thymiques dans l'embryon de souris par des essais in vivo et in vitro. Cette méthode permet d'analyser la cinétique et le phénotype des cellules T produites.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l'embryon de souris Utilisation

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