In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

L’objectif global de ce modèle est de récapituler le microenvironnement neuronal cancéreux. Cela permet d’explorer les interactions neuronales des cellules cancéreuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que l’interaction entre les cellules tumorales et les neurones et l’influence mutuelle de chaque ensemble.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est fiable, facile à réaliser et qu’elle s’adresse à la fois aux facteurs cellulaires et cérébraux de la niche neurale. Les implications de cette technique s’étendent au développement thérapeutique et au ciblage pharmacologique des facteurs clés dans le processus de remodelage et d’invasion neuronale tout au long du développement du cancer. Après avoir euthanasié l’animal dans une chambre à CO2, trempez la fourrure avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher.

Épinglez la souris en position couchée, puis faites une incision médiane s’étendant craniocaudalement du cou postérieur à la colonne vertébrale. Ensuite, utilisez une pince pour soulever les lambeaux dermiques de manière bilatérale et exposer le tissu sous-cutané. Palper le crâne de la souris jusqu’à ce que la jonction craniocervicale soit identifiée.

Utilisez des ciseaux inclinés perpendiculairement à l’animal pour couper les muscles cervicaux et la colonne vertébrale à la jonction craniocervicale. Ensuite, disséquez la colonne vertébrale par voie caudale et utilisez des ciseaux pour effectuer une transsection caudale complète au niveau de la cinquième vertèbre lombaire. Ensuite, positionnez la souris en position couchée et, après avoir fait une incision le long de la ligne médiane du cou à l’abdomen, rétractez la peau latéralement, puis ouvrez le péritoine.

Cranialement, ouvrez la paroi thoracique avec des ciseaux. Après avoir enlevé les organes péritonéaux et rétropéritonéaux, utilisez une pince et une lame chirurgicale pour couper les côtes, laissant environ cinq millimètres de côtes saillantes de la colonne vertébrale. Retirez la colonne vertébrale du reste du corps.

et laver deux fois avec du PBS froid. Positionnez la colonne vertébrale vers le haut dans la même orientation craniocaudale sur une plate-forme absorbante non adhérente sous un stéréomicroscope équipé d’un grossissement 4X. Tout en regardant à travers ce stéréomicroscope, retirez tous les muscles de la colonne vertébrale et le tissu conjonctif.

Utilisez les côtes comme points de repère pour les nerfs, car elles quittent la colonne vertébrale. Les DRG sont situés au niveau des vertèbres cervicales, thoraciques et lombaires. Utilisez des ciseaux pour couper le corps vertébral sur la ligne médiane, créant une fenêtre sur la moelle épinière, puis rétractez doucement le corps vertébral pour exposer la moelle épinière et les racines DRG.

Ensuite, à l’aide de ciseaux à ressort, retirez la nervure supérieure pour exposer le DRG. Suivez le nerf périphérique médialement le long de la côte latérale au DRG. Identifiez le DRG, qui peut être décrit comme ressemblant au jaune d’un œuf au plat posé sur le nerf.

Coupez le nerf intercostal distal au DRG en laissant deux à trois millimètres de nerf distal aux ganglions à utiliser pour la rétraction. Saisissez soigneusement le nerf efférent à l’aide d’une pince sans pincer ni endommager le DRG. Appliquez maintenant une légère rétraction au DRG en tirant le nerf latéralement.

Coupez ensuite les racines antérieure et postérieure près du DRG. Transférez le DRG isolé dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de DMEM supplémenté par glacial. En travaillant dans une hotte à flux laminaire, placez une boîte de Pétri à fond de verre de 35 millimètres sur une grille en papier sur de la glace.

À l’aide d’une pointe de pipette prérefroidie, distribuez environ 10 microlitres d’ECM appauvri en facteur de croissance au centre de la grille. Tout en regardant la parabole à travers un stéréomicroscope sous un grossissement de 2 à 4X, placez le DRG au centre de l’ECM, près du bas de la parabole. Après la récolte et le lavage, 40 000 cellules cancéreuses d’intérêt provenant de cultures confluentes remettent en suspension la pastille et 40 microlitres d’ECM sur de la glace.

Une fois de plus, visualisez la grille à travers le stéréomicroscope, mesurez 500 microns du DRG et distribuez 10 microlitres de suspension de cellule à ce stade. Répétez dans toutes les directions à partir du DRG. Laissez le plat dans la hotte à flux laminaire pendant 10 à 15 minutes pour qu’il se solidifie mais ne se dessèche pas.

Une fois que l’ECM s’est solidifié, ajoutez lentement du DMEM complété en le pipetant contre la paroi latérale de la plaque. Ajoutez environ deux millilitres de support, suffisamment pour couvrir l’ECM. L’ajout de DMEM doit se faire très lentement en pipetant contre la paroi latérale de la plaque pour éviter le détachement du DRG du fond de la plaque.

Placez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et suivez les instructions de la partie écrite du protocole pour maintenir la culture. Cette micrographie montre le DRG en haut du champ de vision et les cellules cancéreuses au bas du champ de vision le jour zéro après l’ensemencement. Ici, la même culture est présentée sept jours après l’ensemencement.

Comme l’indiquent les flèches, les cellules cancéreuses migrent le long du neurone DRG. Cet histogramme montre l’indice d’invasion nerveuse DRG de différents types de cellules cancéreuses. On peut voir que les cellules Kpc 989 et MiaPaCa ont un indice d’invasion nerveuse plus élevé que les cellules QLL2 ou NIH3T3.

Ce graphique de coordonnées représente la voie de migration d’une cellule cancéreuse Kpc en contact avec le nerf (en rouge) et d’une cellule QLL2 (en violet). Les coordonnées X et Y sont affichées. Cette figure montre une analyse à partir de la distance d’origine des cellules cancéreuses QLL2 migrantes avec contact axonal.

Ici, la distance d’origine est indiquée pour les cellules cancéreuses Kpc. Dans chaque cas, la direction de la migration était vers le ganglion nerveux. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer plus de ganglions que nécessaire, car le taux de contrôle n’est pas de 100 %Après son développement, le motif DRG a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la niche neurale dans le microenvironnement tumoral.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reconnaître les repères anatomiques tels que le DRG dans la souris, d’extraire le DRG et, enfin, de la cultiver dans DCM. La coculture du DRG avec des cellules cancéreuses est également présentée.