Name: In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez la modélisation du microenvironnement neural cancéreux avec le modèle DRG/cellules cancéreuses. Cette technique permet d'étudier les interactions entre neurones et cellules tumorales pour le développement thérapeutique.

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Edith Suss-Toby est remerciée pour son aide dans la microscopie time-lapse et l’analyse d’images. Nofar Rada est remerciée pour le travail artistique.

Quatre à six semaines d&#39;âge C57BL femelle / souris CJ (Harlan, Jérusalem, Israël) ont été utilisés dans l&#39;expérience selon l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des spécifications Laboratory Animal Care. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité et le Département de la réglementation de l&#39;agriculture. 1. récolte la moelle épinière <ol><li> Euthanize la souris à l&#39; aide d&#39; une chambre de CO 2. Évitez la dislocation cervicale car elle pourrait causer des dommages aux racines ganglionnaires dues aux forces de cisaillement. A partir de là, effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles. </li><li> Faire tremper l&#39;animal vers le bas avec 70% d&#39;éthanol. Cette étape est importante pour la stérilisation et pour empêcher les cheveux de glisser à travers les organes internes. </li><li> Laissez la souris pour sécher l&#39;éthanol. Empêcher tout contact de l&#39;éthanol avec les organes internes dus à la neurotoxicité. </li><li> Après séchage de la souris, la position à l&#39;aide d&#39;épingles dans la position couchée(face cachée). Placez les broches sur chaque hindlimb et forelimb. </li><li> En utilisant des pinces, faire une incision médiane étendant craniocaudally du cou postérieur à la colonne lombaire. Ensuite, soulever des rabats dermiques bilatéralement en utilisant une pince et d&#39;exposer le tissu sous-cutané. </li><li> Palper le crâne de la souris jusqu&#39;à la jonction cranio. Avec des ciseaux perpendiculaires à l&#39;animal, couper à travers les muscles cervicaux et la colonne vertébrale à la jonction cranio (le 7 ème vertèbre cervicale), en utilisant des pinces lourdes. Disséquer la colonne vertébrale caudale et exciser la colonne vertébrale avec des pinces lourdes jusqu&#39;à atteindre le niveau lombaire (postérieur au niveau des membres). </li><li> Effectuer une transection caudale complète au niveau du rachis lombaire (5 e lombaire vertèbres) en utilisant des pinces lourdes. </li><li> Passez la souris sur (face). Il n&#39;y a pas besoin de couvrir l&#39;incision puisque la DRG est extraite des niveaux vertébraux inférieur et non pas du col. </li><li> Couper à la ligne médiane du cou à l&#39;abdomen, rétracter lepeau latéralement et ensuite coupé pour ouvrir le péritoine. </li><li> Retirez les organes internes à l&#39; intérieur du péritoine (foie, rate, du pancréas, de l&#39; estomac et l&#39; intestin grêle) en bloc. Ensuite, retirez les organes rétropéritonéaux (c. -à , les reins et le pancréas). Céphalique, ouvrez la paroi thoracique. </li><li> En utilisant des pinces et une lame chirurgicale, couper les côtes, en laissant 5 mm de côtes bilatéralement loin de la colonne vertébrale. A ce stade, la colonne vertébrale est séparée du reste du corps. </li><li> Laver la colonne vertébrale à partir du sang de froid (4 ° C) phosphate frais saline tamponnée (PBS) à deux reprises. </li></ol> 2. Isoler les ganglions rachidiens (DRG) <ol><li> Utilisez un stéréomicroscope avec grossissement 4X. </li><li> Positionner la colonne vertébrale sur une plate-forme non absorbante non adhérente (Telfa / nylon). Placez la face de la colonne vertébrale à la même orientation cranio-caudale. </li><li> Retirez tous les muscles de la colonne vertébrale et les tissus conjonctifs. Utilisez les nervures comme un point de repère pour les nerfs comme ilsquitter la colonne vertébrale. Ribs protègent également les nerfs des outils chirurgicaux. Le DRG est situé au, thoraciques et lombaires sites cervicales des vertèbres. </li><li> Ensuite, à l&#39;aide de ciseaux coupent le corps vertébral dans la ligne médiane et d&#39;exposer la moelle épinière et les racines DRG par la rétraction latérale douce du corps vertébral. </li><li> Dans l&#39;espace intercostal, suivre le nerf périphérique médiale le long de la nervure latérale du DRG. </li><li> Identifier le DRG. Il semble que le jaune d&#39; &#39;œuf frit&#39; couché sur le nerf. </li><li> Couper le nerf intercostal distale du DRG laissant 2-3 mm de nerf distal aux ganglions, pour être utilisé aux fins de rachat. Cette &quot;queue&quot; sera supprimé après la récolte. </li><li> Saisir le nerf en utilisant une pince. Pincer le corps DRG lui-même causer des dommages aux cellules neurales et doit être évitée. </li><li> L&#39;approche de la DRG proximalement le long de son attachement à la moelle épinière, par son antérieur et racines postérieures. </li><li> Appliquer la rétraction douce à la DRG en tirant l&#39;efférentes nerf (nerf intercostal souche) latéralement, et couper la partie antérieure et postérieure racines près de la DRG. </li><li> Gardez le DRG dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de fraîcheur, de la glace DMEM froid additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine, 1% d&#39;acides aminés non essentiels, et 1% pyruvate de sodium. </li></ol> 3. Implantation dans la boîte de Pétri <ol><li> Effectuez les étapes suivantes sur la glace à l&#39;aide des conseils pré-refroidi pipettes pour empêcher ECM solidification. </li><li> En vertu d&#39;un stéréomicroscope à 2-4x grossissement, placez un verre plat de Pétri en bas de 35 mm sur une grille de papier. IMPORTANT: Les travaux sur la glace afin de maintenir l&#39;ECM à l&#39;état liquide. Créer un spot de 1 mm de diamètre (environ 20 ul) de l&#39;ECM du facteur de croissance appauvri au centre de la grille. </li><li> Sous la visualisation directe, placez le DRG au centre de la tache d&#39;ECM à proximité du fond du plat. Note: Les cellules cancéreuses utilisées dans ce protocole sont les cellules cancéreuses pancréatiques murins (KPC) established à partir d&#39; échantillons de tumeurs fraîchement isolés de souris CPK comme décrit ailleurs 19. </li><li> cellules de récolte 40.000 cancéreuses provenant de cultures confluentes, les laver une fois avec PBS, et les remettre en suspension dans 40 ul ECM sur la glace. </li><li> Sous la visualisation directe de la grille en utilisant une mesure de um stéréomicroscope 500 à chaque direction du DRG. À ce stade ensemencer lentement 10.000 cellules / 10 ECM ul. Utiliser un embout prérefroidi 2-10 ul d&#39;injecter les cellules proches du fond plat, en évitant leur propagation dans la matrice ou le détachement de la matrice. (Figure 1). </li><li> Laissez le plat dans une hotte à flux laminaire pendant 10-15 min à se solidifier. Évitez le séchage de l&#39;ECM. </li><li> ajouter lentement du DMEM, préparé comme indiqué plus haut, contre la paroi latérale de la plaque. Ajouter assez moyen pour couvrir l&#39;ECM (environ 2 ml). </li><li> Mettre le plat de retour à l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Remplacer le milieu avec un milieu frais le lendemain. </li><li> Remplacez le support tous les 2 jours. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Acquisition de données, Time-lapse vidéomicroscopie <ol><li> Au jour 7 après l&#39;implantation, prendre le plat pour la microscopie de laps de temps. Notez que certaines cellules peuvent nécessiter l&#39;acquisition plus tôt en raison de la migration plus rapide. </li><li> Au cours de l&#39;imagerie en direct, placez le plat dans un environnement fermé à une température moyenne de 37 ± 0,1 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Enregistrer les cellules en utilisant une caméra à dispositif à couplage de charge placé sur le microscope. </li><li> Prendre des images numérisées toutes les 10 minutes jusqu&#39;à 72 heures pour suivre la locomotion cellulaire de trois à six cellules différentes. </li><li> Remplacer milieu après 24 h. </li><li> Effectuer l&#39;acquisition de données et d&#39;analyse simple à l&#39;aide du logiciel de microscope. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> Pour des applications plus avancées ( par exemple, le suivi des cellules en 2D ou 3D) utilisent des logiciels spécialisés (tels que Imaris 4D). Remarque: Ce logiciel détermine les coordonnées xy d&#39;une cellule àun moment donné, ainsi que la distance entre l&#39;origine et la vitesse du mouvement. </li><li> Calculer la vitesse moyenne, en mesurant la distance entre les positions suivantes Voyage dans des intervalles de 10 min. Calculer l&#39;indice de migration vers l&#39;avant (FMI) qui est la distance entre l&#39;avant de la cellule à partir de la neurite et décrit le mouvement unidirectionnel des cellules vers le DRG. </li></ol>

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<li>Weizman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+mediate+gemcitabine+resistance+of+pancreatic+adenocarcinoma+by+upregulating+cytidinedeaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase.</a> Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).</li>
</ol>

Cette recherche a été soutenue par la bourse de développement de carrière en recherche Barbara S. Goodman de l’ICRF (2011-601-BGPC) et une subvention de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël. Aucune autre divulgation financière de la part des auteurs ne doit être faite.

Cet article présente un modèle in vitro qui récapitule le microenvironnement cancéreuse dans la niche de neurones, le modèle de DRG. La vidéo montre toutes les étapes à partir de la reconnaissance des repères anatomiques tels que le DRG chez la souris, son extraction et, finalement, la mise en culture dans l&#39;ECM. Co-culture DRG aux côtés des cellules cancéreuses est également présenté. Il n&#39;y a pas d&#39; autres modèles pour la recherche en vitro d&#39;invasion périneural décrits dans la littér...

Les tumeurs solides diffusent de trois façons principales: invasion directe, la propagation lymphatique, et la propagation hématogène. Cependant, il y a un quatrième moyen de propagation du cancer qui est souvent négligées, la diffusion le long des nerfs. Cancerous invasion neural (CNI) est un itinéraire bien connu de la propagation du cancer, en particulier dans les cancers de la tête et du cou, 1 prostate 2, 3 et du pancréas. 4-8 CNI se produit dans plus de 80% des individus avec adénocarcinome pancréatique, conduisant à la tumeur rétropéritonéale se propager à travers les nerfs coeliaque ganglionnaires. Ces cellules cancéreuses neurotrope ont une capacité unique à migrer vers unidirectionnellement le long des nerfs du système nerveux central (SNC). 9 Cette constatation suggère que le microenvironnement périneural peut être exploitée par des cellules cancéreuses, en fournissant des facteurs qui favorisent la croissance maligne. L&#39; un des rares modèles in vitro pour la recherche CNI est le ganglion de la racine dorsale (DRG) / modèle de cellules cancéreuses. Ce model est fréquemment utilisé pour étudier l&#39;interaction paracrine entre les cellules stromales et les cancers de neurones. 10-18 Dans ce modèle, les souris ou les lignées de cellules cancéreuses humaines sont cultivées dans une matrice extracellulaire (ECM) adjacent à la préparation de DRG en culture fraîchement dissociées. Cet article vidéo montre l&#39;application de CNI vitro dans des adénocarcinomes canalaires pancréatiques.

<table><tbody><tr><td>Équipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope opératoire</td><td>Leica</td><td>M205</td><td></td></tr><tr><td>Time Lapse System</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z309036</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Boîtes de Pétri, fond en verre</td><td>de</td><td>groot 60-627860</td><td></td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise&nbsp ; </td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Matériaux :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % ethanol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold PBS</td><td>Industries biologiques</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Industries biologiques</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Rhénium</td><td>10108165</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Industries biologiques</td><td>01-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Industries biologiques</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Industries biologiques</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel appauvri en facteur de croissance</td><td>Trevigen</td><td>3433-005-01</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modélisation de cancerous neural invasion: le ganglion de racine dorsale modèle

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Les tumeurs solides se propagent par le biais de l’invasion neuronale. Cette voie est bien connue dans les cancers de la tête et du cou, de la prostate et du pancréas. Ces cellules cancéreuses neurotropes ont la capacité unique de migrer de manière unidirectionnelle le long des nerfs vers le système nerveux central (SNC). Le modèle de ganglions de la racine dorsale (DRG)/cellules cancéreuses est un modèle in vitro tridimensionnel (3D) fréquemment utilisé pour étudier l’interaction entre le stroma neural et les cellules cancéreuses. Dans ce modèle, des lignées cellulaires cancéreuses de souris ou d’humains sont cultivées en ECM à côté de préparations de DRG cultivées fraîchement dissociées. Dans cet article, le protocole d’isolement de DRG chez la souris et l’implantation dans des boîtes de Pétri pour la co-culture avec des cellules cancéreuses du pancréas sont démontrés. Cinq jours après l’implantation, les cellules cancéreuses sont entrées en contact avec les neurites DRG. Plus tard, ces cellules ont formé des têtes de pont pour faciliter une migration neurotrope polarisée plus étendue des cellules cancéreuses.

<html> En utilisant la microscopie vidéo d&#39;imagerie, DRG peut être vu bourgeonnement des neurites 5-7 jours après l&#39;implantation, tandis que les cellules cancéreuses de migrer hors de leurs colonies vers le DRG. Par la 7 ème jour après l&#39;implantation, les cellules cancéreuses viennent en contact avec les neurites (figure 2). L&#39;indice de migration vers l&#39; avant des cellules cancére...

Cet article vidéo montre l’utilisation du modèle de cellules cancéreuses et ganglions de la racine dorsale (DRG)/cancer dans l’adénocarcinome canalaire pancréatique.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

L'objectif général de ce modèle est de recréer le microenvironnement neural cancéreux. Cela permet d'explorer les interactions entre les cellules cancéreuses et les neurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que les interactions entre les cellules tumorales et les neurones, ainsi que l'influence mutuelle de chacun de ces éléments.Le principal avantage de cette technique est qu'elle est fiable, facile à réaliser et qu'elle prend en compte à la fois les facteurs cellulaires et cérébraux du compartiment neural. Les implications de cette technique s'étendent à la mise au point de thérapeutiques et au ciblage pharmacologique de facteurs clés impliqués dans le remodelage neural et le processus d'invasion au cours du développement du cancer. Après avoir euthanasié l'animal dans une chambre à CO2, imbiber le pelage avec de l'éthanol à 70 % et laisser sécher.Épingler la souris en position pronaire, puis pratiquer une incision médiane s'étendant de façon craniocaudale depuis la nuque jusqu'au rachis lombaire. Ensuite, utiliser une pince pour soulever bilatéralement les lambeaux dermiques et exposer le tissu sous-cu

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Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode de co-culture des ganglions de la racine dorsale et des cellules cancéreuses sur la membrane chorioallantoïde du poulet ou CAM pour étudier l’invasion périneurale.

Modèle de tumeur à membrane chorioallantoïde de poulet ou CAM : une méthode in ovo pour simuler l’invasion périneurale des cellules tumorales

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de développement d’un modèle d’invasion de cellules cancéreuses périneurales in vitro en co-cultivant des cellules cancéreuses de la racine dorsale de souris et des cellules cancéreuses neurotropes. Le modèle peut être utilisé pour effectuer des tests de cancer, produisant des résultats rapides et reproductibles.

Établissement d’un modèle de co-culture tridimensionnelle de ganglions de la racine dorsale murine et de cellules cancéreuses : un modèle in vitro pour étudier l’invasion des cellules cancéreuses périneurales

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode in vitro de co-culture de cellules DRG et cancéreuses pour étudier le neurotropisme et l’invasion neuronale.

Modélisation de l’invasion neuronale cancéreuse in vitro : une méthode de co-culture de ganglions de la racine dorsale et de cellules cancéreuses

Dans cette vidéo, nous développons un modèle murin in vivo d’invasion périneurale en injectant des cellules cancéreuses du pancréas dans le nerf sciatique. Ce modèle permet de quantifier l’étendue de l’invasion et d’étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les nerfs.

Modèle d’invasion périneurale murine : génération d’un modèle in vivo pour simuler l’invasion périneurale dans le nerf sciatique de souris

Cette vidéo présente une méthode pour développer des ganglions de la racine dorsale ou une culture d’explants DRG et des modèles cellulaires dissociés de DRG à l’aide de tissus DRG de souris isolés. Ces modèles aident à étudier divers mécanismes d’interactions neurones-gliales dans un environnement contrôlé.

Génération d’un explant ganglionnaire racinaire dorsal et d’une culture cellulaire dissociée

L’invasion périneurale (PNI) est une caractéristique courante du carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC), conférant des taux de survie plus faibles. Ses mécanismes sont mal compris. En utilisant des neurites générés à partir de ganglions de la racine dorsale murins confinés dans une matrice semi-solide, les voies impliquées dans la PNI des lignées cellulaires HNSCC peuvent être étudiées.

Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

Nous décrivons un modèle murin in vivo de perineural invasion en injectant des cellules de cancer du pancréas syngénique dans le nerf sciatique. Le modèle permet de quantifier l’ampleur de l’invasion du nerf et prend en charge l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de perineural invasion.

Un modèle murin de nerf sciatique In Vivo Perineural invasion

L'invasion perineural est un phénotype agressif pour les carcinomes squamous de tête et de cou de cellules et d'autres tumeurs. Le modèle de membrane chorioallantoic de poussin a été employé pour étudier l'angiogenèse, l'invasion de cancer, et la métastasie. Ici nous démontrons comment ce modèle peut être utilisé pour évaluer l'invasion perineural in vivo.

Le modèle Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo pour évaluer l'invasion périnéale dans le cancer de la tête et du cou

Ce protocole fournit une technique pour récolter et cultiver le ganglion de la racine dorsale (DRG) explanté de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC).

Récolte, intégration et culture de ganglions de la racine dorsale dans des dispositifs à compartiments multiples pour étudier les caractéristiques neuronales périphériques

Ce protocole décrit les méthodes d’établissement de cultures entières et dissociées de ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris et leur utilisation pour évaluer les interactions tumeur-nerf.

Établissement de modèles in vitro de culture de ganglions de la racine dorsale : approches complémentaires pour l’étude de la diaphonie cancéreux-nerf

Découvrez la modélisation du microenvironnement neural cancéreux avec le modèle DRG/cellules cancéreuses. Cette technique permet d'étudier les interactions entre neurones et cellules tumorales pour le développement thérapeutique.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

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