Name: Protocole pour lisolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez une technique d'isolement des hépatocytes humains primaires et des cellules hépatiques non parenchymateuses à partir d'un même donneur. Cette méthode améliore le rendement et la viabilité cellulaire pour les modèles hépatiques in vitro.

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Nous tenons à remercier Jia Li Liu pour leur soutien dans la création de la figure 1. Cette étude a été soutenue par le ministère fédéral allemand de l&#39;éducation et de projets de recherche (BMBF) Foie virtuel: 0315741.

Remarque: Toutes les cellules ont été isolées à partir de tissu de foie réséqué non tumorales humaines, qui est restée après résection partielle du foie des tumeurs hépatiques primaires ou secondaires. Le consentement éclairé des patients a été obtenu selon les directives éthiques de la Charité - Universitätsmedizin Berlin. 1. Préparation des matériaux et solutions <ol><li> Stériliser tous les instruments et les matériaux à l&#39;avance pour éviter la contamination bactérienne au cours du processus d&#39;isolement. </li><li> Préparer les solutions nécessaires pour la perfusion de l&#39;échantillon de tissu hépatique, le processus d&#39;isolement des hépatocytes et des cellules hépatiques non parenchymateuses et la culture des cellules primaires du foie humain selon les tableaux 1 et 2, à l&#39; exception de la digestion, la solution qui est préparée fraîchement avant usage. Toutes les solutions peuvent être stockées à 4 ° C et il est recommandé de les utiliser dans les 4 semaines après la préparation. </li><li> Stérilisertoutes les solutions en utilisant un filtre supérieur de 0,22 um bouteille. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;équipement Perfusion <ol><li> Installer l&#39;équipement pour la perfusion et la digestion de l&#39;échantillon de tissu hépatique comme représenté sur la figure 1A. </li><li> Ajuster la température du bain d&#39;eau à 39 ° C pour assurer une activité de collagénase P optimale au cours de la perfusion et de la digestion. </li></ol> 3. Perfusion et Digestion de l&#39;échantillon de foie de tissus (1,5 h) <ol><li> Choisir un échantillon de tissu avec la capsule de Glisson intact à partir d&#39;un tissu du foie réséqué. Lors de la coupe l&#39;échantillon de tissu, essayez d&#39;obtenir une surface de coupe petite avec de bons vaisseaux visibles. Éviter les temps d&#39;ischémie chaude par le transport et la manipulation de l&#39;échantillon de tissu de foie sur la glace jusqu&#39;à la perfusion. </li><li> Supporter le poids des tissus dans des conditions stériles et placer l&#39;échantillon de tissu de foie dans une boîte de Petri dans l&#39;écoulement d&#39;air laminaire. Nettoyer la surface de l&#39;échantillon de tissu avec une compresse stérile resang résiduel et rincer l&#39;ensemble de la canule en utilisant 1x Perfusion-Solution I pour garantir que toutes canule étaient perméables. </li><li> Utilisez de la colle de tissu pour fixer les olives des canules dans certains vaisseaux sanguins plus grands. Selon la taille de l&#39;échantillon de tissu hépatique et le nombre de vaisseaux à la surface, utiliser une canule sertie de 3 à 8 canules. Test de la perfusion et vérifier les fuites. Fermer tous les vaisseaux sanguins qui fuient 1x Perfusion-Solution claire I, avec de la colle tissulaire. </li><li> Placer l&#39;échantillon de tissu de foie canulée dans l&#39;entonnoir de Büchner sur son disque perforé du filtre (figure 1A). </li><li> Régler le débit de la pompe péristaltique entre 7,5 ml / min et 14,6 ml / min en fonction du nombre de canules utilisées et de la résistance du tissu hépatique écoulement. Régler le débit à chaque fois afin d&#39;assurer qu&#39;il y ait une perfusion en cours, mais lent. Perfuser le tissu jusqu&#39;à ce que le sang entier est rincé, mais au moins 20 min. Observer le tissu devient plus lumineux dans les zones avec de bonnes perfusisur. Remarque: Dans certains cas, il peut être nécessaire de bloquer l&#39;un des canules avec des pinces en plastique ou pour augmenter la pression interne d&#39;un espace en poussant doucement avec une spatule contre la capsule du foie, afin d&#39;optimiser la perfusion. Un changement complet de la couleur à un jaune clair à la couleur brun clair indique une bonne perfusion. </li><li> Changer le liquide de perfusion à la digestion, la solution contenant de la collagénase P (Tableau 1). </li><li> Réorganiser la configuration (figure 1A) pour l&#39;étape de digestion. Par conséquent réaliser un écoulement circulaire de la digestion, la solution selon la figure 1B pour un maximum de 15 min. Remarque: Il est essentiel d&#39;arrêter la perfusion immédiatement lorsque l&#39;échantillon de tissu du foie est suffisamment digéré. Une bonne digestion peut être observée, lorsque le tissu ne montre aucun signe d&#39;élasticité tel qu&#39;évalué par l&#39;entretien des déformations de la capsule, lorsqu&#39;elle est poussée avec une spatule. </li></ol> 4. Isolement des hépatocytes (1 h) <ol><li> Turn la pompe péristaltique hors tension et placer l&#39;échantillon de tissu hépatique dans un plat en verre. Rincer à l&#39;extérieur de l&#39;échantillon de tissu avec de la glace froide Stop solution (Tableau 1). Retirer les canules de l&#39;échantillon de tissu hépatique. Utilisation d&#39;un scalpel pour ouvrir l&#39;échantillon de tissu du foie, en incisant au milieu de la zone où les canules ont été attachés. Gardez les soins que la capsule Glisson&#39;s reste intacte. </li><li> Rincer l&#39;intérieur de l&#39;échantillon de tissu, puis couvrir l&#39;ensemble de l&#39;échantillon de tissu avec de la glace froide Stop-Solution. Secouer doucement le tissu afin de libérer les cellules hors du tissu. </li><li> Recueillir la suspension cellulaire et le filtrer à travers un regard entonnoir (entonnoir en plastique doublée avec de la gaze compresse) dans 50 ml tubes en plastique. Ajouter plus de solution Stop à l&#39;échantillon de tissus du foie jusqu&#39;à un volume final de 500 ml est consommé. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recueillir le surnageant pour l&#39;isolement des cellules non-parenchymateuse plus tard. Laver le culot cellulaire avec du PBS (Figure 2A). </li><li> Centrifuger à nouveau la suspension de cellules à 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recueillir le surnageant et remettre en suspension le culot dans du milieu d&#39; incubation des hépatocytes (tableau 2, figure 2B). </li><li> Déterminer le nombre de cellules et la viabilité de la suspension cellulaire obtenue en utilisant une coloration au bleu trypan. Comptez les vivants et les cellules mortes dans une chambre de comptage de Neubauer. Calculer le nombre de cellules, la viabilité et le rendement de PHH en utilisant les formules ci-dessous. Rendement (cellules comptées) = cellules comptées x facteur de dilution x volume de suspension de cellules (ml) x 10 000 Rendement (hépatocytes / (g de foie, un échantillon de tissu)) = (rendement (hépatocytes / (ml support)) x volume de suspension de cellules (ml)) / (poids de l&#39;échantillon de tissu du foie (g)) Viabilité (%) = 100% x (nombre de cellules vivantes) / (nombre total de cellules) </li></ol> 5. Purification des hépatocytes (1 h) Remarque: Cette étape de purification, il est recommandé, si la viabilitéest inférieur à 70%. <ol><li> Effectuez toutes les étapes de la glace. Préparer un gradient de densité de 25% par mélange d&#39;une solution de gradient de densité de 5 ml et 15 ml de PBS pendant la centrifugation en gradient de densité. </li><li> Mettez un maximum de 50 cellules Mio au total de la riche suspension de cellules hépatocytes soigneusement et lentement au - dessus de la couche de gradient de densité de 25% pour qu&#39;une séparation claire des deux couches est atteint (figure 2C). Mettre les tubes avec précaution dans la centrifugeuse et centrifuger à 1.250 xg, 20 min, 4 ° C sans frein (figure 2D). </li><li> Aspirer la suspension cellulaire restante, et les cellules mortes dans l&#39;interphase. En fonction de la teneur en matière grasse peut également une Aspirer la solution à gradient de densité. Remarque: PHH avec une faible teneur en lipides forment une pastille dense et le gradient de densité peut être aspiré complètement. PHH avec forte teneur en lipides forment une pastille plus diffuse et beaucoup de cellules viables peuvent rester dans la solution de gradient de densité au-dessus du culot. </li><li>Remettre en suspension les pastilles d&#39;hépatocytes avec du PBS et on centrifuge à nouveau à 50 x g, 5 min, 4 ° C. Réunir les pellets, lavez à nouveau avec du PBS et remettre en suspension purifiée PHH en milieu hépatocytes Incubation. Effectuer le comptage des cellules comme décrit dans l&#39;étape 4.6. </li></ol> 6. La culture des hépatocytes <ol><li> Préparer les boîtes de culture cellulaire pour l&#39;ensemencement de PHH en les enrobant avec une matrice extracellulaire, par exemple du collagène de queue de rat (collagène de type I). Préparer du collagène de queue de rat selon le protocole établi par Rajan et al. 17 </li><li> Diluer la solution mère collagène de queue de rat 1: 200 dans du PBS. Transfert / cm solution 100 pi 2 de queue de rat de collagène dans les boîtes de culture, en prenant soin que toute la surface est couverte. Incuber la matière plastique de culture cellulaire pendant 20 min à température ambiante. Aspirer la solution restante de collagène de queue de rat. </li><li> Seed 15 x 10 4 hépatocytes / cm 2 dans un milieu d&#39; incubation des hépatocytes sur la culture dishes enduit de queue de rat collagène. Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant au moins 4 heures. Après 4 h les hépatocytes ont adhéré et le milieu peut être changé. </li><li> Effectuer des enquêtes en fonction de la configuration expérimentale. Un temps de culture de 48 heures est recommandée pour permettre aux cellules de récupérer du processus d&#39;isolement. </li></ol> 7. Isolement des cellules hépatiques non parenchymateuses (1,5-2 h) <ol><li> Centrifuger le surnageant ont été recueillies (étape 4.5 et 4.6) à 72 x g, 5 min, 4 ° C pour éliminer les globules rouges restants et les hépatocytes. Mutualiser les surnageants et centrifuger les deux pour obtenir deux culots cellulaires: 300 xg, 5 min, 4 ° C pendant la sédimentation des HSC, CEL et partiellement KC et 650 x g, 7 min, 4 ° C pendant la sédimentation du KC restant. </li><li> Piscine des pastilles et re-suspendre dans HBSS. Préparer un 25% et une densité de 50% des gradients en mélangeant une solution à gradient de densité et du PBS pour un gradient de densité centrifugation (solution à 25% de gradient de densité: 5 solution à gradient ml de densité et de 15 ml de PBS, une solution de gradient de densité de 50%: la solution de gradient de 10 ml de la densité et de 10 ml de PBS, voir la figure 2). Placer la solution à gradient de densité de 25% avec précaution au-dessus de la couche à 50% de la solution de gradient de densité. </li><li> Mettez la suspension NPC soigneusement et lentement au-dessus de la couche de 25% de la solution de gradient de densité de manière à une séparation claire des deux couches est atteint. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire sur le gradient de densité à 1800 x g, 20 min, 4 ° C sans freinage (figure 2.2). </li><li> Aspirer Les cellules mortes et les débris cellulaires à partir de la couche supérieure. L&#39;APN sont situés dans l&#39;interphase entre la couche de gradient de densité de 25% et 50% (figure 2). Collecter NPC, les laver avec HBSS et centrifuger la suspension cellulaire appliquant l&#39;étape décrite ci-dessus à double centrifugation (étape 7.2.). </li></ol> 8. Séparation des cellules Kupffer (AdhésionÉtape de séparation) (1 h) <ol><li> Effectuer une numération cellulaire pour le KC dans la fraction NPC comme décrit dans l&#39;étape 4.6. (Pour apparition de KC en suspension voir la figure 3B). Centrifugeuse la fraction NPC avec l&#39;étape de centrifugation double décrite ci - dessus (étape 7.2) et remettre en suspension le moyen NPC dans Kupffer cellulaire ensemencement (tableau 2). </li><li> Graine de la fraction contenant KC sur les navires de culture cellulaire en plastique à une densité de 5 x 10 5 KC / cm 2. Incuber les cultures KC pendant 20 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. KC primaire adhérer sur les matières plastiques de culture cellulaire dans un court laps de temps (Figure 2.3). </li><li> Recueillir le surnageant contenant pas adhéré NPC, composé principalement de LEC et HSC. Mutualiser les surnageants pour la séparation ultérieure du LEC (voir section 9) et HSC (voir section 10). Laver le KC adhérente avec HBSS et les cultiver dans Kupffer milieu de culture cellulaire (tableau 2) à 37 ° C, 5% CO2 dans un incubateur humidifié. </li></ol> 9. Séparation des cellules endothéliales (1,5 h) <ol><li> Centrifuger le surnageant recueilli (étape 8.5.) À 300 xg, 5 min, 4 ° C. Laver le culot avec du PBS. Après centrifugation à 300 xg, 5 min, 4 ° C re-suspendre les cellules dans Stellate cellules / Endothelial milieu de séparation cellulaire et effectuer un nombre de cellules pour toutes les cellules restantes comme décrit à l&#39;étape 4.6. </li><li> Re-suspendre 1 x 10 7 cellules Mio dans 1 ml de cellules Stellate / Endothelial milieu de séparation cellulaire, ajouter 20 ul de solution de blocage du MACS-KIT et 20 pi des perles CD31 Micro pour immunomarquage et incuber la suspension résultante pendant 15 min à 4 ° C la température (Figure 2.4). </li><li> LEC séparée de HSC comme décrit dans le protocole pour le système Référence rechange de tri cellulaire activé magnétiquement MACS (Figure 2.5). Eluer retenu magnétiquement LEC CD31-positif et suspendre dans Stellate Cell / Endothelial milieu de culture cellulaire (tableau 2). </li><li> Effectuer le comptage des cellules LEC comme décrit à l&#39;étape 4.6. Seed LEC dans une densité de 1,25 x 10 5 cellules / cm 2 dans des récipients de culture cellulaire revêtus de collagène de queue de rat (voir étape 6.1). Cultiver les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. </li></ol> 10. Séparation des cellules étoilées (0,5 h) <ol><li> HSC non marqué passe la colonne de séparation MACS pendant la procédure. Recueillir la fraction HSC (voir l&#39; étape 9.5, Figure 2.5). Effectuer le comptage des cellules comme décrit dans l&#39;étape 4.6. </li><li> Seed HSC avec une densité de 5 x 10 4 cellules / cm 2 dans des récipients de culture cellulaire revêtus de queue de rat collagène (voir l&#39; étape 6.1) dans Stellate cellulaire / milieu de culture des cellules endothéliales (tableau 2) et les cultiver à 37 ° C, 5% CO 2 dans un incubateur humidifié. </li></ol><img alt= &quot;Tableau 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tableau 1: Perfusion et d&#39;une solution d&#39;isolation. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tableau 2: Culture et isolement des médias.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Le protocole publié décrit une technique pour isoler pur PHH et NPC, à savoir KC, HSC et LEC, simultanément en haute qualité et la pureté du même échantillon de tissu de foie humain. La majorité des publications traitant des isolements de cellules hépatiques ne couvrent que l&#39; un de ces populations de cellules 18-20 et les procédures d&#39;isolement réalisées avec des tissus humains sont rares (examinés par Damm et al.) 21. Adaptation des méthodes établies avec les tissus des animaux <...

un tissu de foie humain est très complexe et se compose de deux entités différentes de cellules, les cellules parenchymateuses et les cellules non parenchymateuses (CNP). les cellules hépatiques parenchymateuses comprennent hépatocytes et cholangiocytes. Hepatocytes représentent 60 à 70% des cellules hépatiques totales et représentent la majeure partie des fonctions métaboliques du foie, par exemple l&#39; acide biliaire et de compléter la synthèse du facteur, la biotransformation et le métabolisme énergétique de 2,3. La fraction NPC inférieure constitue 30 à 40% des cellules hépatiques totales. NPC comprennent les populations de cellules différentes, à savoir les cellules de Kupffer (KC), les cellules hépatiques endothéliales (LEC) et les cellules hépatiques étoilées (HSC). Cette fraction cellulaire hétérogène joue un rôle central dans les processus physiologiques du foie. En outre, NPC participer à la médiation des lésions hépatiques aiguës, par exemple, une lésion induite par le médicament foie (DILI), ainsi que des blessures chroniques du foie, comme la cirrhose 4. Au cours des dernières années, hles cellules du foie Uman sont devenus de plus en plus essentiel dans la recherche et le développement du dépistage des drogues, le développement de médicaments et l&#39;identification de nouvelles voies biochimiques dans les maladies du foie. Pour les tests in vitro monocultures PHH sont encore considérés comme le «gold standard» 5. La principale limite des modèles actuels de foie homotypique est dédifférenciation et la perte de fonction des hépatocytes en quelques jours 4. La mise en place de 3 dimensions techniques (3D) de culture a montré que ces limitations peuvent être compensées 4,6. Cependant, même les techniques de culture 3D modernes ne sont pas en mesure d&#39;afficher tous les modes hépatotoxiques des actions 7. Disparues populations NPC dans les modèles in vitro existants sont discutés comme une raison possible de cet écart à la situation in vivo. Il a été démontré que la communication cellulaire entre les différentes populations de cellules du foie joue un rôle central dans l&#39;homéostasie physiologique, mais aussi dans pathophysiologic traite 8. Par conséquent, l&#39;attention scientifique se concentre de plus en plus sur les PNJ et leurs interactions cellule-cellule. Leur utilisation délibérée en co-culture et les systèmes de l&#39; ingénierie tissulaire pourrait être une solution pour la forte demande des modèles in vitro du foie 8,9 qui sont aussi proches de la situation in vivo que possible. Actuellement, le principal défi est le développement d&#39;un modèle de co-culture de foie humain standardisé, qui contient des parties clairement définies de PHH et NPC. En conséquence, les techniques d&#39;isolement des cellules hépatiques très hétérogènes sont nécessaires et celles-ci doivent être optimisés pour obtenir des populations cellulaires pures. Bien que des protocoles normalisés pour PHH isolement existent 10, l&#39;isolement normalisé de NPC humaine est encore en développement. Protocoles d&#39;isolement NPC plupart des publications sont basées sur des expériences avec des cellules non humaines 11,12. Seules quelques publications décrivent le processus d&#39;isolement des PNJ humain et plus ne couvrent quedes procédés pour l&#39;isolement d&#39;une cellule de type 16/11. Les caractéristiques les plus importantes de cellules qui ont été mises à profit pour la séparation des cellules sont la taille, la densité, le comportement de fixation, et l&#39;expression des protéines de surface. Sur la base de ces caractéristiques , nous avons développé un protocole simplifié pour isoler PHH, KC, LEC et HSC, qui a été publié précédemment dans la biologie expérimentale et de médecine 1. Étant donné le grand intérêt de cette technique, le but de cet article est de fournir un protocole plus détaillé du procédé d&#39;isolement des cellules du foie, y compris la vidéo, ce qui permettra de reproduire la technique plus aisément. Le protocole comprend également des méthodes de contrôle de qualité pour l&#39;évaluation du rendement et de la viabilité, ainsi que pour l&#39;évaluation de l&#39;identification et de la pureté en utilisant immunomarquages ​​spécifiques.

<table><tbody><tr><td>Equipement général <strong<>/strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Pipettes Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscope Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> Microscope <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubateur</td><td>Liant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bécher à urine</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>seringue à perfuseur 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à bouchon de bouteille</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tube conique en polypropylène</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Tube conique en polypropylène</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>Pipettes</td></tr><tr><td>sérologiques</td> 24 puits <td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>pointes de pipette</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro ; l, 200 et micro ; l, 1 000 et micro ; l</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolation Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>water shower</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr> pompe <tr><td>péristaltique</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr> circulation <tr><td> thermostat</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balances fines</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml ; Entonnoir en</td> plastique <td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entonnoir</td><td></td><td></td><td></td>en silicone</tr><tr><td>canules en</td> tube avec pointes <td></td><td></td><td></td>d’olive</tr><tr><td>Couteau à plat</td><td></td><td></td><td></td>en verre</tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plume</td><td>12068760</td><td></td></tr> Chambre de <tr><td></td> comptage Neubauer <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Optique Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Champ Chirurgical</td><td>Charit&eacute ; Universit&auml ; tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>compresse</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>gants chirurgicaux stériles</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>Colle tissulaire</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>bouteille en verre</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Solution</td> <td>de séparationBiochrom</td><td>L6145</td><td>Densité 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank' s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>sans Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp ;</td><td>13CKP151&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1 064 041 000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49 361 000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Media Equipment&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Faible teneur en glucose (1 g/L) (sans L-glutamine)</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution 1&nbsp ; M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>sans L-Glutamine</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>William' s E&nbsp ; &nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>avec GlutaMAX&trade ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Human-Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acétyl cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment for Immunostainings</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R& D Systems, USA</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 4 %</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A côté hépatocytes parenchymateux, le foie est constitué de cellules non parenchymateuses (NPC), à savoir les cellules de Kupffer (KC), le foie des cellules endothéliales (LEC) et des cellules étoilées hépatiques (HSC). Deux dimensions (2D) culture de primaire hépatocytes humains (PHH) est toujours considéré comme le «gold standard» pour les tests in vitro du métabolisme des médicaments et l&#39; hépatotoxicité. Il est bien connu que la monoculture 2D de PHH souffre de dédifférenciation et la perte de fonction. Récemment, il a été montré que hépatique NPC jouent un rôle central dans le foie (patho) physiologie et le maintien des fonctions PHH. La recherche actuelle se concentre sur la reconstruction de l&#39; architecture in vivo dans des tissus en 3D- et co-culture des modèles pour surmonter les limites des monocultures 2D. Auparavant , nous avons publié une méthode pour isoler les cellules du foie humain et étudié l&#39;aptitude de ces cellules pour leur utilisation dans des cultures cellulaires en biologie expérimentale et de médecine 1. Sur la base de l&#39;intérêt général dans ce technique le but de cet article était de fournir un protocole plus détaillé pour le processus d&#39;isolement des cellules du foie, y compris une vidéo, ce qui permettra une reproduction facile de cette technique. des cellules hépatiques humaines ont été isolées à partir d&#39;échantillons de tissu hépatique humain des interventions chirurgicales par une EGTA / P collagénase technique de perfusion en deux étapes. PHH ont été séparés de l&#39;APN par une centrifugation initiale à 50 x g. Densité étapes de centrifugation à gradient ont été utilisés pour l&#39;élimination des cellules mortes. populations de cellules hépatiques individuels ont été isolés à partir de la fraction enrichie NPC en utilisant les propriétés de cellules spécifiques et des procédures de tri des cellules. A côté de l&#39;isolement PHH nous avons pu séparer KC, LEC et HSC pour plus de culture. Pris ensemble, le protocole présenté permet l&#39;isolement de PHH et NPC en haute qualité et la quantité d&#39;échantillon de tissu d&#39;un donneur. L&#39;accès aux populations de cellules du foie purifiées pourrait permettre la création d&#39;in vivo comme li humainemodèles de ver.

La séparation en une fraction du parenchyme et non parenchymateuse, en utilisant la centrifugation en gradient de densité comme une procédure de nettoyage combinée à l&#39;utilisation des propriétés d&#39;adhérence et MACS conduit à succès PHH et NPC isolement. PHH et NPC peuvent être isolés en haute qualité et la quantité. La figure 1 montre la configuration représentative de l&#39;équipement pour la perfusion du foie et la digestion. 10% de FCS a été ajouté à la collag...

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hépatologie et de la toxicologie, et nous offrir l'opportunité de développer de nouveaux modèles in vitro de co-cultures et de foie ingénierisé par génie tissulaire. L'avantage de cette nouvelle technique réside dans l'isolement de toutes les populations cellulaires hépatiques à partir d'un même donneur et d'un même petit fragment de tissu hépatique. Pour commencer cette procédure, peser le tissu hépatique fraîchement disséqué dans des conditions stériles et placer l'échantillon de tissu hépatique dans la hotte à flux laminaire.Ensuite, éliminez le sang de la surface de l'échantillon tissulaire. Puis, rincez les canules à l'aide de la solution de perfusion 1X un. Utilisez la colle tissulaire pour fixer les olives des canules dans les vaisseaux sanguins plus larges.Ensuite, tester la perfusion et vérifier les fuites des canules. Par la suite, fermer tous les vaisseaux sanguins présentant des fuites de solution de perfusion claire 1X à l’aide de colle tissulaire. Puis, placer l’échantillon de tissu hépatique canulé dans l’entonnoir de Buchner.Ensuite, régler le débit de la pompe péristaltique entre 7,5 et 14,6 millilitres par minute, selon le nombre de canules utilisées et la résistance du tissu hépatique. Perfusionner le tissu jusqu'à ce que tout le sang soit éliminé, pendant au moins 20 minutes et au maximum 30 minutes. Dans certains cas, il peut être nécessaire de pincer l'une des canules à l'aide de pinces en plastique ou d'augmenter la pression interne d'une zone en appuyant doucement contre la capsule hépatique avec une spatule afin d'optimiser la perfusion.Un changement de couleur complet, passant du rouge brunâtre au brun clair ou au jaune pâle, indique une bonne perfusion. Ensuite, remplacer le liquide de perfusion par la solution de digestion contenant la collagénase P. Puis, réorganiser le montage pour l'étape de digestion. Ensuite, effectuer une circulation circulaire de la solution de digestion pendant un maximum de 15 minutes.Arrêtez périodiquement la perfusion et vérifiez le degré de digestion. Il est essentiel d'interrompre immédiatement la perfusion avec la solution de digestion lorsque l'échantillon de tissu hépatique est suffisamment digéré. Retirez le foie de l'appareil dès qu'il est prêt et placez-le dans un plat en verre.Rincez l'extérieur de l'échantillon de tissu avec la Solution d'arrêt glacée. Retirez les canules de l'échantillon de tissu hépatique. Ensuite, utilisez un scalpel pour ouvrir l'échantillon de tissu hépatique en pratiquant une incision au milieu de la zone où les canules étaient fixées, en veillant à ce que la capsule de Glisson reste intacte.Rincez l'intérieur de l'échantillon de tissu, puis recouvrez entièrement l'échantillon de tissu avec la Solution d'arrêt. Ensuite, agitez doucement le tissu afin de libérer les cellules. Puis, récupérez la suspension cellulaire et filtrez-la à travers un entonnoir à gaze dans 10 tubes en plastique de 50 millilitres.Ajouter davantage de solution d'arrêt à l'échantillon de tissu hépatique jusqu'à ce qu'un volume final de 500 millilitres soit atteint. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire, recueillir le surnageant pour une isolation ultérieure des NPC, et regrouper les culots cellulaires dans des tubes en plastique de 250 millilitres. Par la suite, laver les culots cellulaires avec du PBS.Pour cela, centrifuger la suspension cellulaire. Récupérer le surnageant, regrouper les culots et resuspendre le culot dans un milieu d'incubation pour hépatocytes. Ensuite, déterminer le nombre de cellules et leur viabilité dans la suspension cellulaire obtenue à l'aide de la coloration au bleu de trypan. Pour isoler les cellules hépatiques non parenchymateuses, centrifuger le surnageant recueilli afin d'éliminer les érythrocytes et les hépatocytes résiduels. Récolter les surnageants et les centrifuger deux fois pour obtenir les culots cellulaires destinés à la sédimentation des HCS, des LEC, d'une partie des KC et des KC restants. Ensuite, resuspendre les culots dans du HBSS. Préparer ensuite un gradient de densité à 25 % et un gradient de densité à 50 % en mélangeant la solution de gradient de densité et du PBS pour une centrifugation sur gradient de densité.Placez soigneusement la solution de gradient de densité à 25 % au-dessus de la couche de solution de gradient de densité à 50 %. Ensuite, déposez délicatement et lentement la suspension de CPC au-dessus de la couche de solution de gradient de densité à 25 % afin d'obtenir une séparation nette des deux couches. Effectuez l'ultracentrifugation de la suspension cellulaire sur le gradient de densité sans freinage.Les CPC se trouvent à l'interface entre les couches de gradient de densité à 25 % et à 50 %. Aspirez les cellules mortes et les débris cellulaires de la couche supérieure et récupérez soigneusement l'interface. Après une double centrifugation, effectuez un décompte cellulaire pour la fraction de CK et celle de CPM.Ensuite, centrifuger la fraction des PCN avec l'étape de double centrifugation décrite précédemment et resuspendre les PCN dans le milieu de semis des cellules de Kupffer. Semer la fraction contenant les cellules de Kupffer sur les récipients plastiques de culture cellulaire à une densité de cinq fois 10 à la puissance 5 cellules de Kupffer par centimètre carré. Incuber les cultures de cellules de Kupffer pendant 20 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Les cellules KC primaires doivent adhérer rapidement aux plastiques de culture cellulaire. Ensuite, recueillir le surnageant contenant les cellules NPC non adhérentes, principalement constitué de LEC et de HSC. Pour séparer les LEC des HSC, commencer par une centrifugation du surnageant.Ensuite, lavez le culot avec du PBS. Après la deuxième centrifugation, resuspendez les cellules dans du milieu de séparation des cellules étoilées et des cellules endothéliales et effectuez un dénombrement cellulaire pour toutes les cellules restantes. Ensuite, resuspendez 10 millions de cellules dans un millilitre de milieu de séparation des cellules étoilées et des cellules endothéliales.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution de blocage provenant du kit MAX et 20 microlitres des microbilles CD31 pour le marquage immunologique, puis incubez la suspension obtenue pendant 15 minutes à une température de quatre degrés Celsius. Par la suite, séparez les LEC des HSC selon les instructions du protocole du fabricant pour le système de tri cellulaire activé magnétiquement max, et collectez la fraction de HSC. Éluisez les LEC positives pour CD31 retenues magnétiquement et mettez-les en suspension dans un milieu de culture de cellules endothéliales de cellules stellaires.Ici, ces images montrent les différentes populations cellulaires hépatiques isolées directement après le processus d'isolement, en vue en microscopie à contraste de phase. Ce jeu d'images présente les cellules isolées et cultivées après 24 heures de culture. La caractérisation par immunofluorescence de différentes fractions cellulaires est illustrée ici.Les HPH présentaient des signaux positifs pour le marqueur des hépatocytes CK18 à 24 heures après l'isolement, les CK étaient positives pour le marqueur CD68 à 24 heures après l'isolement, les LEC montraient des signaux positifs pour la vimentine à 72 heures après l'isolement, et les CSH étaient positives pour la GFAP à 72 heures après l'isolement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une isolation réussie dépend d'une digestion optimale de l'échantillon de tissu hépatique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment contrôler la digestion et comment effectuer la séparation par gradient de densité, qui sont les étapes critiques de cette procédure.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la recherche médicale pour explorer les fonctions hépatiques et les maladies dans des cultures cellulaires in vitro nouvellement créées et dans des modèles de foie conçus par ingénierie tissulaire.

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Hépatocytes primaires constituent un outil précieux pour évaluer biochimiques, moléculaires fonctions, et métabolique dans un système physiologiquement pertinente expérimentale. Nous décrivons un protocole fiable pour le rat en perfusion du foie in situ, ce qui génère constamment hépatocytes viables jusqu'à à 1,0 ×...

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Une procédure en deux étapes de la collagénase de perfusion modifié pour l'isolement d'hépatocytes humains est décrit. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres foies de mammifères. Les hépatocytes isolés sont disponibles en haute rendement et la viabilité, les un modèle approprié pour la recherche scientifique dans des domaines tels que la régénération du foie, la pharmacocinétique et la toxicologie faire.

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

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Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine

Le but du présent protocole est de fournir un guide étape par étape pour réaliser des expériences 3D « foie-on-a-chip » infection par le virus de l’hépatite B.

« Foie-on-a-Chip » Cultures d’hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer pour Infection de Virus de l’hépatite B

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Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Ce protocole détaille l’utilisation d’un cathéter intraveineux spécial, d’un tube jetable stérile standardisé, d’un contrôle de la température complété par une surveillance en temps réel et d’un système d’alarme pour la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes afin d’améliorer la cohérence de la viabilité, du rendement et de la fonctionnalité des hépatocytes primaires isolés chez le rat.

Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Les hépatocytes chargés de lipides sont inhérents à la régénération du foie, mais sont généralement perdus lors de la centrifugation par gradient de densité. Ici, nous présentons un protocole d’isolement cellulaire optimisé qui conserve les hépatocytes stéatotiques, produisant des populations représentatives d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris.

Isolement des hépatocytes régénérants après hépatectomie partielle chez la souris

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Protocole pour lisolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses (Vidéo) | JoVE Journal

Protocole pour l'isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

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