Protocole pour l'isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hépatologie et de la toxicologie et nous offrir la possibilité de développer de nouveaux modèles hépatiques de co-culture in vitro et d’ingénierie tissulaire. L’avantage de cette nouvelle technique est d’isoler toutes les populations de cellules hépatiques d’un même donneur et d’un même petit morceau de tissu hépatique. Pour commencer cette procédure, pesez le tissu hépatique fraîchement disséqué dans des conditions de seuil et placez l’échantillon de tissu hépatique dans le capot à flux d’air laminaire.

Nettoyez ensuite le sang de la surface de l’échantillon de tissu. Ensuite, rincez les canules à l’aide de la solution de perfusion 1X un. Utilisez la colle à tissu pour fixer les olives des canules dans les plus gros vaisseaux sanguins.

Ensuite, testez la perfusion et vérifiez s’il y a des fuites dans les canules. Par la suite, fermez tous les vaisseaux sanguins qui fuient avec de la colle tissulaire. Après cela, placez l’échantillon de tissu hépatique canulé dans l’entonnoir de Buchner.

Ensuite, réglez le débit de la pompe péristaltique entre 7,5 et 14,6 millimètres par minute, en fonction du nombre de canules utilisées et de la résistance du tissu hépatique. Perfuser le tissu jusqu’à ce que tout le sang soit évacué pendant au moins 20 minutes et pendant un maximum de 30 minutes. Dans certains cas, il peut être nécessaire de clamper l’une des canules avec des pinces en plastique ou d’augmenter la pression interne d’une zone en appuyant doucement contre la capsule hépatique avec une spatule afin d’optimiser la perfusion.

Un changement complet de couleur du rouge brunâtre au brun clair ou au jaune clair indique une bonne perfusion. Ensuite, changez le liquide de perfusion en solution de digestion contenant de la collagénase P.Ensuite, réorganisez la configuration pour l’étape de digestion. Par la suite, effectuez un écoulement circulaire de la solution de digestion pendant 15 minutes maximum.

Arrêtez périodiquement la perfusion et vérifiez le degré de digestion. Il est essentiel que la perfusion avec la solution de digestion soit arrêtée immédiatement lorsque l’échantillon de tissu hépatique est suffisamment digéré. Sortez le foie de l’appareil lorsque vous êtes prêt et mettez-le dans un plat en verre.

Rincez l’extérieur de l’échantillon de tissu avec la solution Stop glacée. Retirez les canules de l’échantillon de tissu hépatique. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, ouvrez l’échantillon de tissu hépatique en incisant le milieu de la zone où les canules étaient attachées et assurez-vous que la capsule de Glisson reste intacte.

Rincez l’intérieur de l’échantillon de tissu, puis recouvrez l’ensemble de l’échantillon de tissu avec Stop Solution. Ensuite, secouez doucement le tissu afin de libérer les cellules de celui-ci. Ensuite, récupérez la suspension cellulaire et filtrez-la à travers un entonnoir de gaze dans 10 tubes en plastique de 50 millilitres.

Ajoutez plus de solution Stop à l’échantillon de tissu hépatique jusqu’à ce qu’un volume final de 500 millilitres soit consommé. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire, collectez le surnageant pour l’isolement des NPC plus tard, et regroupez les granulés de cellules dans des tubes en plastique de 250 millilitres. Par la suite, lavez les granulés cellulaires avec du PBS.

Pour cela, centrifugez la suspension cellulaire. Récupérez le surnageant, mettez les granules en commun et remettez les pastilles en suspension dans un milieu d’incubation d’hépatocytes. Ensuite, déterminez le nombre de cellules et la viabilité dans la suspension cellulaire résultante à l’aide de la coloration au bleu de trypan.

Pour isoler les cellules hépatiques non parenchymateuses, centrifuger le surnageant collecté afin d’éliminer les érythrocytes et les hépatocytes restants. Collectez les surnageants et centrifugez-les deux fois pour obtenir les pastilles cellulaires pour la sédimentation des HCS, des LEC, des KC en partie et des KC restants. Ensuite, remettez les granulés en suspension dans HBSS. Ensuite, préparez un gradient de densité de 25 % et de 50 % en mélangeant la solution de gradient de densité et le PBS pour la centrifugation par gradient de densité.

Placez soigneusement la solution de gradient de densité de 25 % sur la couche de solution de gradient de densité de 50 %. Par la suite, placez la suspension NPC soigneusement et lentement sur la couche de solution de gradient de densité de 25 % pour obtenir une séparation claire des deux couches. Centrifuger la suspension cellulaire sur le gradient de densité sans interruption.

Les NPC sont situés dans l’interphase entre les couches de gradient de densité de 25 % et 50 %. Aspirez les cellules mortes et les débris cellulaires de la couche supérieure et collectez soigneusement l’interphase. Après la double centrifugation, effectuez un comptage cellulaire pour la fraction KC et la fraction MPC.

Ensuite, centrifugez la fraction NPC avec l’étape de centrifugation double décrite précédemment et remettez en suspension le NPC dans le milieu d’ensemencement Kupffer Cell. Ensemencez la fraction contenant du KC sur les récipients de culture cellulaire en plastique à une densité de cinq fois 10 à la 5e KC par centimètre carré. Incuber les cultures KC pendant 20 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone.

Le KC primaire doit adhérer sur les plastiques de culture cellulaire dans un court laps de temps. Ensuite, prélever le surnageant contenant le CNP non adhérent, composé principalement de LEC et de HSC. Pour séparer le LEC du HSC, commencez par une centrifugation du surnageant.

Ensuite, lavez le granulé avec du PBS. Après la deuxième centrifugation, remettre les cellules en suspension dans le milieu de séparation des cellules endothéliales stellaires et effectuer un comptage cellulaire pour toutes les cellules restantes. Ensuite, mettez à nouveau en suspension 10 millions de cellules dans un millilitre de milieu de séparation des cellules endothéliales à cellules étoilées.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution bloquante du kit MAX et 20 microlitres de microbilles CD31 pour l’immuno-marquage et incubez la suspension résultante pendant 15 minutes à une température de quatre degrés Celsius. Par la suite, séparez le LEC du HSC comme décrit dans le protocole du fabricant pour le système de tri cellulaire activé magnétiquement max et collectez la fraction HSC. Éluer les LEC CD31 positifs retenus magnétiquement et les suspendre dans un milieu de culture cellulaire endothéliale à cellules étoilées.

Ici, ces images montrent les différentes populations de cellules hépatiques isolées directement après le processus d’isolement en vue de microscopie à contraste de phase. Cet ensemble d’images présente les cellules isolées et cultivées après 24 heures de culture. La caractérisation basée sur l’immunofluorescence de différentes fractions cellulaires est présentée ici.

PHH a montré des signaux positifs pour le marqueur hépatocytaire CK18 24 heures après l’isolement, KC était positif pour le marqueur CD68 24 heures après l’isolement, LEC a montré des signaux positifs pour la vimentine 72 heures après l’isolement et HSC était positif pour GFAP 72 heures après l’isolement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’une isolation réussie dépend d’une digestion optimale de l’échantillon de tissu hépatique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de contrôler la digestion et d’effectuer la séparation du gradient de densité, qui sont les étapes critiques de cette procédure.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche médicale pour explorer les fonctions hépatiques et les maladies dans des cultures cellulaires in vitro nouvellement créées et des modèles hépatiques issus de l’ingénierie tissulaire.