Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Les hépatocytes primaires de souris sont importants dans les études sur le foie. Surtout pour le métabolisme du glucose et les tests de drogues hépatiques. En termes de temps, le processus d’isolement peut prendre beaucoup de temps et coûter de l’énergie.

Ce protocole peut fournir un moyen efficace d’isoler les hépatocytes primaires de souris. C’est favorable au temps et au travail. Nécessitant très peu d’étapes avec toutes les régions disponibles dans le commerce.

Commencez par utiliser la pompe péristaltique pour commencer à pomper de l’eau double distillée réchauffée à une vitesse de 4 mL par minute, pendant cinq minutes. Ensuite, changez le tube de pompage de l’eau en milieu de perfusion réchauffé. Surveillance de la bulle d’air entre l’eau et le milieu de perfusion.

Aidera à suivre le flux du milieu de perfusion à travers le système. Ensuite, désinfectez l’abdomen d’une souris femelle C57 noire 6J anesthésiée de huit semaines avec de l’éthanol à 70%. Et à l’aide d’un ciseau, ouvrez l’abdomen pour exposer le foie, la veine porte et la veine cave inférieure.

Arrêtez ensuite la pompe péristaltique. Après s’être assuré que le tube de pompage contient du milieu de perfusion et non de l’eau. Insérez un cathéter de calibre 24 dans la veine cave inférieure.

Rallumez la pompe et ouvrez la veine porte. Pendant que le milieu de perfusion est pompé, appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Continuez à pomper pendant environ trois à cinq minutes ou jusqu’à ce que le liquide évacué soit clair.

Ensuite, changez le tube de pompage du milieu de perfusion au milieu de dispase de collagénase. Et appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Continuer le pompage jusqu’à ce que les 25 mL du milieu de la dispase de collagénase soient épuisés.

Ensuite, isolez tout le foie sans la vésicule biliaire. Et placez-le dans 30 mL de milieu de lavage dans une boîte de Petri sur de la glace. À l’aide de pinces, déchirez le foie en morceaux pour libérer les hépatocytes primaires dans la solution.

À ce stade, le milieu de lavage se transforme en une solution trouble contenant des hépatocytes primaires libérés et de petits morceaux de foie. Filtrer cette solution trouble à travers une passoire cellulaire de 70 microns, dans 20 mL de 1X par appel HBSS dans un tube de 50 mL sur glace. Et mélangez la solution en inversant le tube 20 fois.

Ensuite, centrifugez la solution. Ensuite, dans la cagoule de culture tissulaire, aspirez le surnageant. Et lavez la pastille avec 30 mL de milieu de lavage à froid.

Abattez à nouveau les cellules avec la centrifugation. Retirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille dans 25 mL de milieu de culture. Comptez les cellules et plaquez-les sur les plaques de culture souhaitées.

Selon la conception expérimentale. Après le placage, les hépatocytes primaires isolés ont été fermement attachés d’une heure et complètement dilatés après 12 heures. Dans les hépatocytes isolés, les niveaux d’ARNm de marqueurs hépatocytaires, tels que la transthyrétine, CD95, ASGR1 et ASGR2 ont été significativement augmentés par rapport à l’ensemble du foie.

En revanche, la présence de cellules immunitaires, de cellules stellaires et de cellules endothéliales était plus faible. Comme en témoigne une forte diminution des niveaux de CD45, de collagène de type 1 alpha 1 et de cellules endothéliales 2 kinase 2 aRNm. Suggérant que ce protocole peut réduire considérablement les interférences d’autres cellules hépatiques.

Après le placage, les niveaux d’ASGR1 et d’ASGR2 ont diminué avec le temps, mais restent comparables à ceux du foie entier jusqu’au point de temps de 12 heures. Surtout pour ASGR1. Le niveau d’expression du CD81 lié à la membrane était constant jusqu’à 48 heures.

En comparaison, l’expression du récepteur 4 de type toll a généralement augmenté et est devenue plus élevée que les niveaux in vivo après 48 heures. Les tests de sensibilité à l’insuline ont démontré que l’insuline favorisait significativement la phosphorylation des deux AKT à la sérine 473. Et boîte de tête de fourche 01 à la sérine 256, dans les hépatocytes.

Indiquant la sensibilité des hépatocytes primaires à l’insuline. Les niveaux de protéines de phosphoénolpyruvate carboxykinase ont considérablement augmenté après le traitement au glucagon. Suggérant que la voie de production de glucose a été activée.

Cette activation a été confirmée par une augmentation de la production de glucose. Et avec d’autres stimulateurs de production de glucose comme Forskolin + IBMX. Ce protocole peut économiser du temps et de l’énergie pour les études utilisant des hépatocytes primaires de souris.

En suivant ce protocole, des expériences connexes telles que le métabolisme hypothétique du glucose et des tests de biomarqueurs pharmaceutiques peuvent être effectuées.