Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris
25 octobre 2021
Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.
Les hépatocytes primaires de souris sont importants dans les études sur le foie. Surtout pour le métabolisme du glucose et les tests de drogues hépatiques. En termes de temps, le processus d’isolement peut prendre beaucoup de temps et coûter de l’énergie.
Ce protocole peut fournir un moyen efficace d’isoler les hépatocytes primaires de souris. C’est favorable au temps et au travail. Nécessitant très peu d’étapes avec toutes les régions disponibles dans le commerce.
Commencez par utiliser la pompe péristaltique pour commencer à pomper de l’eau double distillée réchauffée à une vitesse de 4 mL par minute, pendant cinq minutes. Ensuite, changez le tube de pompage de l’eau en milieu de perfusion réchauffé. Surveillance de la bulle d’air entre l’eau et le milieu de perfusion.
Aidera à suivre le flux du milieu de perfusion à travers le système. Ensuite, désinfectez l’abdomen d’une souris femelle C57 noire 6J anesthésiée de huit semaines avec de l’éthanol à 70%. Et à l’aide d’un ciseau, ouvrez l’abdomen pour exposer le foie, la veine porte et la veine cave inférieure.
Arrêtez ensuite la pompe péristaltique. Après s’être assuré que le tube de pompage contient du milieu de perfusion et non de l’eau. Insérez un cathéter de calibre 24 dans la veine cave inférieure.
Rallumez la pompe et ouvrez la veine porte. Pendant que le milieu de perfusion est pompé, appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Continuez à pomper pendant environ trois à cinq minutes ou jusqu’à ce que le liquide évacué soit clair.
Ensuite, changez le tube de pompage du milieu de perfusion au milieu de dispase de collagénase. Et appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Continuer le pompage jusqu’à ce que les 25 mL du milieu de la dispase de collagénase soient épuisés.
Ensuite, isolez tout le foie sans la vésicule biliaire. Et placez-le dans 30 mL de milieu de lavage dans une boîte de Petri sur de la glace. À l’aide de pinces, déchirez le foie en morceaux pour libérer les hépatocytes primaires dans la solution.
À ce stade, le milieu de lavage se transforme en une solution trouble contenant des hépatocytes primaires libérés et de petits morceaux de foie. Filtrer cette solution trouble à travers une passoire cellulaire de 70 microns, dans 20 mL de 1X par appel HBSS dans un tube de 50 mL sur glace. Et mélangez la solution en inversant le tube 20 fois.
Ensuite, centrifugez la solution. Ensuite, dans la cagoule de culture tissulaire, aspirez le surnageant. Et lavez la pastille avec 30 mL de milieu de lavage à froid.
Abattez à nouveau les cellules avec la centrifugation. Retirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille dans 25 mL de milieu de culture. Comptez les cellules et plaquez-les sur les plaques de culture souhaitées.
Selon la conception expérimentale. Après le placage, les hépatocytes primaires isolés ont été fermement attachés d’une heure et complètement dilatés après 12 heures. Dans les hépatocytes isolés, les niveaux d’ARNm de marqueurs hépatocytaires, tels que la transthyrétine, CD95, ASGR1 et ASGR2 ont été significativement augmentés par rapport à l’ensemble du foie.
En revanche, la présence de cellules immunitaires, de cellules stellaires et de cellules endothéliales était plus faible. Comme en témoigne une forte diminution des niveaux de CD45, de collagène de type 1 alpha 1 et de cellules endothéliales 2 kinase 2 aRNm. Suggérant que ce protocole peut réduire considérablement les interférences d’autres cellules hépatiques.
Après le placage, les niveaux d’ASGR1 et d’ASGR2 ont diminué avec le temps, mais restent comparables à ceux du foie entier jusqu’au point de temps de 12 heures. Surtout pour ASGR1. Le niveau d’expression du CD81 lié à la membrane était constant jusqu’à 48 heures.
En comparaison, l’expression du récepteur 4 de type toll a généralement augmenté et est devenue plus élevée que les niveaux in vivo après 48 heures. Les tests de sensibilité à l’insuline ont démontré que l’insuline favorisait significativement la phosphorylation des deux AKT à la sérine 473. Et boîte de tête de fourche 01 à la sérine 256, dans les hépatocytes.
Indiquant la sensibilité des hépatocytes primaires à l’insuline. Les niveaux de protéines de phosphoénolpyruvate carboxykinase ont considérablement augmenté après le traitement au glucagon. Suggérant que la voie de production de glucose a été activée.
Cette activation a été confirmée par une augmentation de la production de glucose. Et avec d’autres stimulateurs de production de glucose comme Forskolin + IBMX. Ce protocole peut économiser du temps et de l’énergie pour les études utilisant des hépatocytes primaires de souris.
En suivant ce protocole, des expériences connexes telles que le métabolisme hypothétique du glucose et des tests de biomarqueurs pharmaceutiques peuvent être effectuées.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole efficace en termes de temps et de main-d'œuvre pour l'isolement des hépatocytes primaires de souris, essentiels à la recherche sur la fonction hépatique et le métabolisme. La méthode utilise des réactifs disponibles dans le commerce afin d'augmenter le rendement et de minimiser les interférences provenant des cellules non parenchymateuses.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Métabolisme hépatique
- Métabolisme du glucose
- Tests de médicaments
Contexte
- Les hépatocytes primaires de souris sont essentiels à l'étude de la biologie du foie.
- Les méthodes traditionnelles d'isolement sont souvent longues et laborieuses.
- La réduction du temps d'isolement peut faciliter des expériences biologiques plus efficaces.
Méthodes utilisées
- Protocole d'isolement utilisant une pompe péristaltique et un milieu de collagénase-dispase.
- Modèle murin : souris femelles C57BL/6J.
- Techniques de culture cellulaire et de mesure de l'expression génique.
Résultats principaux
- Niveaux accrus d'ARNm des marqueurs des hépatocytes par rapport au foie entier.
- Présence réduite des cellules immunitaires et endothéliales après l'isolement.
- Sensibilité à l'insuline démontrée et activation des voies de production de glucose.
Conclusions
- Ce protocole améliore considérablement l'efficacité de l'isolement des hépatocytes primaires.
- Compréhension approfondie du métabolisme du glucose et de la réponse aux médicaments dans les études hépatiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement efficace des hépatocytes primaires est essentiel pour les études sur le métabolisme hépatique et les tests de médicaments, domaines dans lesquels les contraintes de temps et de main-d'œuvre influencent le débit dans les flux de travail de découverte. Ce protocole réduit le temps d'isolement à environ 35 minutes tout en préservant le rendement et la pureté des hépatocytes, permettant ainsi des tests d'hypothèses rapides dans les modèles précliniques. La méthode permet une préparation évolutive de systèmes pertinents pour les maladies, destinés à l'analyse mécanistique et à la réduction des risques dans les voies de validation des cibles et d'identification des candidats médicaments.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Fournit des hépatocytes purifiés permettant d'interroger des hypothèses thérapeutiques dans les voies du métabolisme du glucose et de la réponse hépatique aux médicaments.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps et la charge de travail, permettant un débit plus élevé dans les tests de validation de cibles.
- Valeur prédictive : Produit des hépatocytes présentant une sensibilité à l'insuline et une activation de la gluconéogenèse démontrées, soutenant une dé-risquisation mécanistique des cibles hépatiques.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Fournit des hépatocytes avec une faible interférence des cellules non parenchymateuses, améliorant ainsi la spécificité des tests pour le criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Utilise des réactifs disponibles dans le commerce et des étapes standardisées, ce qui renforce la reproductibilité entre les campagnes de criblage.
- Extensibilité : Permet la préparation de systèmes biologiques validés adaptés aux plates-formes de criblage à contenu élevé ou phénotypique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Prend en charge des systèmes pertinents pour les maladies afin de valider précliniquement des composés ciblant le foie.
- Avancement ajusté au risque : Génère des hépatocytes présentant une production de glucose et une réponse à l'insuline validées, fournissant des éléments d'évaluation pour les décisions de poursuite ou d'arrêt.
- Alignement des biomarqueurs : Conserve l'expression des marqueurs des hépatocytes (ASGR1, ASGR2, CD81) jusqu'à 12 heures, permettant la compatibilité entre les biomarqueurs et les tests analytiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles à l'identification de composés d'intérêt, en fournissant une source fiable d'hépatocytes primaires pour les tests de métabolisme hépatique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les voies hépatiques en fournissant des hépatocytes dont l'expression des marqueurs et les réponses fonctionnelles sont confirmées.
- Évaluation préliminaire : Produit des hépatocytes adaptés à l'évaluation de composés grâce à une contamination réduite par les cellules stromales et une sensibilité à l'insuline constante.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives telles que la production de glucose, les dosages de phosphorylation et l'expression des ARNm des marqueurs des hépatocytes.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la recherche préclinique en fournissant des hépatocytes capables de maintenir des fonctions métaboliques clés jusqu'à 48 heures.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité d'isolement réutilisable qui standardise la préparation des hépatocytes à travers les projets et les équipes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études du métabolisme hépatique grâce à une interférence cellulaire réduite et à une validation fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Simplifie le flux de travail avec un nombre minimal d'étapes et des réactifs disponibles dans le commerce, améliorant ainsi l'efficacité du laboratoire.
- Valeur stratégique : Accélère les délais de découverte en réduisant le temps d'isolement de plusieurs heures à environ 35 minutes, augmentant ainsi la fréquence des tests.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles hépatiques en fournissant des modèles précliniques fiables pour la validation des mécanismes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie murine et en techniques de perfusion.
- Dépend de l'accès à une pompe péristaltique et à un environnement stérile pour la culture tissulaire.
- Exige une préparation standardisée des réactifs (milieu de perfusion, dispase collagénase, milieux de lavage et de culture).
- Implique des ajustements selon les souches ou âges des souris, au-delà du modèle femelle C57BL/6J utilisé.
- Est limitée par la nécessité d'utiliser immédiatement les hépatocytes isolés afin de préserver leur intégrité fonctionnelle, car l'expression des marqueurs diminue après 12 heures.
