Viabilité de Bioprinted cellulaires constructions Utilisation d'une imprimante cartésienne Distributeur Trois

L’objectif global de cette procédure est de générer des constructions viables chargées de cellules avec une géométrie complexe à l’aide d’une bio-impression 3D. Ceci est accompli en isolant d’abord les cellules stromales du tissu adipeux humain à partir de la culture. Ensuite, les cellules sont mélangées avec de l’encre biologique d’alginate conjugué RGD oxydé fraîchement préparé.

Dans la dernière étape, la cellule LA dans le biomatériau est extrudée par bio-impression. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour analyser la viabilité, la prolifération et la migration des cellules bio-imprimées. Le principal avantage de cette procédure par rapport aux procédures existantes, telles que le formage d’échafaudages et l’ensemencement cellulaire, est qu’avec notre procédure, vous pouvez placer directement les cellules et les agrégats cellulaires exactement là où ils doivent être pour former le tissu.

Aujourd’hui, Sarah Grace Dennis, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par ensemencer 350 000 cellules stromales de tissu adipeux humain dans un flacon T 75 traité dans 15 millilitres de TMEM à faible teneur en glucose pour les étendre dans un incubateur de culture cellulaire. Lorsque la culture atteint une fluidité de 80 %, retirez le milieu et rincez les cellules dans cinq millilitres de DPBS sans calcium ni magnésium.

Ensuite, incubez les cellules dans cinq millilitres de trypsine et de DPBS pendant deux minutes à 37 degrés Celsius lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction enzymatique avec trois millilitres de milieu de culture cellulaire et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de culture cellulaire. Ensuite, comptez les cellules, transférez une aliquote de 1,3 fois 10 des six cellules dans un tube conique de 15 millilitres et faites tourner à nouveau les cellules.

Mettez la pastille en suspension dans un millilitre d’encre bio fraîchement préparée, en prenant soin de répartir uniformément les cellules dans toute la solution aqueuse d’alginate. Ensuite, chargez les cellules dans une seringue stérile de trois millilitres compatible avec une imprimante et vissez un embout en plastique stérile de calibre 22. Allumez maintenant la bio-impression, chacun des ordinateurs distributeurs et le bain-marie à recirculation.

Réglez manuellement la température du bain à quatre degrés Celsius pour le mécanisme d’impression et les paramètres d’impression de chaque distributeur sur l’ordinateur du distributeur correspondant. Réglez le volume de distribution à 230 nanolitres, le nombre de pas arrière à zéro et le débit de distribution à 10 microlitres par seconde. Ouvrez ensuite le logiciel de conception et le programme de visualisation de l’affichage de la caméra USB sur l’ordinateur.

Ensuite, entrez manuellement les coordonnées d’un réseau de points cinq par cinq avec un espace de 2,4 millimètres entre les gouttes. Enregistrez le programme et envoyez-le au robot. Placez ensuite une boîte de Pétri contenant du dioxyde de titane gélatine sur la platine de l’imprimante à quatre degrés Celsius et fermez et verrouillez la porte de la chambre.

À l’aide de l’automate programmable, initialisez les sources de lumière ultraviolette pour stériliser la chambre. Après 90 secondes, ouvrez la chambre et chargez la seringue contenant la suspension des cellules stromales du tissu adipeux humain dans le pistolet un seul fermez, verrouillez la porte de la chambre et utilisez le contrôleur logique programmable pour allumer le système de ventilation. Attendez 30 secondes que la pression interne s’équilibre, puis exécutez le programme contenant le chemin géométrique et les paramètres d’impression tout au long du processus d’impression.

Regardez l’affichage de la caméra USB sur l’ordinateur pour confirmer une impression précise et uniforme. Pour quantifier la viabilité des constructions bio-imprimées, immergez-les dans une solution de coloration fraîchement préparée. Placez ensuite les constructions au réfrigérateur pendant 15 minutes dans l’obscurité pour permettre à la tache de se fixer.

Ensuite, à l’aide d’une image au microscope confocal, les constructions colorées si les cellules apparaissent jaunes ou vertes, les classent comme vivantes si rouges, les cellules sont mortes. Comme le démontrent ces résultats, la bio-impression facilite le dépôt d’aide cellulaire et d’hydrogels dans des endroits tridimensionnels spécifiques avec précision et cohérence à l’aide d’un logiciel informatique. Le logiciel informatique détermine l’emplacement de chaque gouttelette et contrôle de nombreux paramètres de distribution.

L’une des exigences d’une technique de bio-impression réussie est que les cellules restent viables ici. Les cellules imprimées avec de l’encre biologique alginique, comme nous venons de le démontrer, ont été analysées une heure et huit jours après l’impression, 98 % des cellules apparaissant vertes et viables au jour zéro et à 95 % le huitième jour. Comme l’indique la coloration rouge, peu de cellules mortes ont été observées à chaque moment, confirmant l’adéquation de l’encre alternative pour la bio-impression.

De plus, l’encre d’algine conjuguée RGD améliore la fixation des cellules aux constructions imprimées, ce qui permet d’améliorer l’étalement et la prolifération des cellules, comme le quantifie dans trois zones distinctes de l’hydrogel sur un zéro et un huit. Ici, une comparaison de la qualité de la conjugaison peptidique RGD sur l’encre ginnet bio a été comparée à l’utilisation de l’encre Ginnet bio seule le huitième jour. L’étalement cellulaire observé dans l’échantillon coloré à la gignotte conjuguée RGD a indiqué l’incorporation réussie du peptide sur la gignotte, un phénomène qui était remarquablement absent dans les échantillons de bio-empreintes non conjugués après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour explorer la fabrication additive comme moyen d’assembler des constructions vivantes.