Microfluidique Bioprinting génie vascularisé tissus et organoïdes

L’objectif global de cette méthodologie de bio-impression microfluidique est de générer une construction tissulaire vascularisée. Cette méthode peut résoudre des questions clés dans la biofabrication de tissus vascularisés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est polyvalente dans la génération d’une cuve vasculaire tridimensionnelle contrôlée pour l’ingénierie des tissus vascularisés par un processus d’ensemencement cellulaire secondaire.

Bien que ce protocole donne un aperçu de l’ingénierie des tissus cardiaques vascularisés, il peut également être appliqué à de nombreux autres types de tissus tels que le foie, la peau et même les cancers. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la configuration de la bio-imprimante peut ne pas être simple. Pour commencer cette procédure, construisez une tête d’impression microfluidique concentrique à double couche en insérant une aiguille émoussée plus petite, servant de noyau, au centre de la plus grande aiguille émoussée, servant de gaine.

Assurez-vous que l’aiguille du noyau dépasse de la coque extérieure d’environ un millimètre. Après cela, insérez une aiguille de calibre 23 dans le corps de l’aiguille centrale dans le sens inverse. Faites un trou sur le côté du corps de l’aiguille extérieure et insérez un connecteur métallique de taille adaptée.

Sceller avec de la colle époxy. Montez l’extrudeuse sur la tête d’une bio-imprimante, à l’aide d’un support en polyméthacrylate de méthyle ou en PMMA. Ensuite, pour l’injection de la bio-encre et de la solution de réticulation à travers deux tubes en PVC individuellement, connectez les entrées de la tête d’impression à une pompe à seringue à double canal.

Fabriquez la bio-encre à l’aide d’un mélange d’alginate, de gelMA et de photo-initiateur. Dissous dans un tampon HEPES de 25 millimolaires, contenant 10 % de sérum bovin fœtal ou FBS. Préparez ensuite une solution de chlorure de calcium à 0,3 molaire dans un tampon HEPES contenant 10 % de FBS pour servir de fluide porteur de réticulation.

Juste avant la bio-impression, trypsinisez les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ou HUVECs pendant cinq à 10 minutes. Centrifugez les cellules à 800 tr/min pendant cinq minutes dans un tube de 15 millilitres. Remettez les cellules en suspension dans la bio-encre à une concentration de cinq à 10 fois 10 à six cellules par millilitre en pipetant lentement cinq à 10 fois.

Ensuite, utilisez une pompe à seringue à deux canaux pour commencer l’injection de la bio-encre HUVECs à travers l’un et le fluide de réticulation à travers l’autre canal à un débit de cinq microlitres par minute. Laissez les écoulements couler en continu jusqu’à une minute jusqu’à ce qu’ils se stabilisent. Après cela, démarrez le mouvement de la tête d’impression en maintenant la vitesse de dépôt de la bio-imprimante d’environ quatre millimètres par seconde.

Cette bio-impression devrait entraîner une gélification ionique rapide du composant alginate et le dépôt d’un échafaudage en microfibre. Une fois l’échafaudage imprimé, photo-réticulez le composant gelMA avec cinq à 10 milliwatts par centimètre carré de lumière UV pendant 20 à 30 secondes pour accomplir la gélification chimique. Ensuite, retirez l’excès de chlorure de calcium de l’échafaudage en le rinçant doucement avec du PBS chaud à 37 degrés Celsius.

Cultivez cet échafaudage dans un milieu de croissance de cellules endothéliales à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent en volume de CO2, jusqu’à 16 jours. Changez de milieu au moins tous les deux jours. Pendant la période de culture, surveillez les HUVECs au microscope jusqu’à ce qu’ils migrent vers les périphéries des microfibres de l’échafaudage et forment des structures semblables à des lumières.

Ensuite, retirez soigneusement tout le milieu de l’espace intrastitiel de l’échafaudage par capillarité à l’aide d’un morceau de papier filtre stérile. Ajoutez instantanément une goutte de suspension d’un type de cellule secondaire tel que des cardiomyocytes sur le dessus de l’échafaudage, permettant aux cellules d’infiltrer tout l’espace intrastitiel. Après cela, incubez cet échafaudage dans un incubateur pendant 30 minutes à deux heures, permettant aux cellules d’adhérer aux microfibres individuelles.

Éliminez les cellules non adhérentes en lavant doucement l’échafaudage avec du PBS. Cultivez cet échafaudage dans un milieu approprié jusqu’à ce que le tissu vascularisé souhaité se forme. La bio-impression microfluidique décrite ici permet la bio-impression directe d’échafaudages microfibreux à l’aide de bio-encres à faible viscosité.

Un échafaudage de six millimètres carrés sur six < contenant plus de 30 microfibres, pourrait être bio-imprimé en 10 minutes. Les vues de dessus et de côté des micrographies d’échafaudage montrent l’excellente intégrité structurelle pendant le processus de bio-impression. Réalisé grâce à la réticulation ionique immédiate du composant alginate avec le chlorure de calcium.

Après l’extrusion microfluidique de la bio-encre, la réticulation ionique et la photo-réticulation, les HUVECs ont maintenu une viabilité relativement élevée. Les cellules ont proliféré et ont migré de la distribution initialement aléatoire au jour zéro, vers les périphéries des microfibres au jour 16. Les cardiomyocytes néonatals de rat qui ont été ensemencés sur l’échafaudage ont mûri et ont peuplé l’échafaudage.

Ils ont montré une forte expression de biomarqueurs cardiaques fonctionnels. Comme l’alpha actinine sarcomérique et la connexine 43. La microscopie confocale d’un échafaudage microfibreux bio-imprimé, peuplé de cardiomyocytes, a révélé la coexistence de HUVECs et de cardiomyocytes.

Les HUVECs sont principalement présents aux limites des microfibres, tandis que les cardiomyocytes entourent l’extérieur des microfibres. Les cellules ont été capables de maintenir leurs battements spontanés et synchronisés pendant neuf à 28 jours. En fonction de la source de la cellule et de la configuration des échafaudages.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des tissus vascularisés à l’aide de la technique de bio-impression microfluidique, ainsi que de la fabrication de la tête d’impression et des opérations de bio-imprimante. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la fabrication de la tête d’impression et le fonctionnement de la bio-imprimante peuvent être délicats pour les personnes qui n’en ont jamais utilisé auparavant. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de rendre les deux aiguilles concentriques dans la tête d’impression et de laisser le flux se stabiliser avant de commencer la bio-impression.

Avec le développement de cette technique, les chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et de la biofabrication disposent désormais d’un autre outil permettant de générer des constructions tissulaires vascularisées à des fins de régénération in vivo ou de modélisation des tissus in vitro.