Quantification tridimensionnelle d'épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

L’objectif global de cette procédure est d’imager les épines dendritiques des neurones péraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et de les quantifier en trois dimensions. Ceci est accompli en traitant d’abord les lamelles de recouvrement dans des plaques à six puits avec du polyuréthane et de la laminine pour la culture de cellules souches neurales. Ensuite, des cellules souches neurales sont diluées en culture.

Les milieux sont plaqués à l’aide d’un léger mouvement de pipette rotative et peuvent se différencier jusqu’à 70 jours en culture. En renouvelant régulièrement le milieu, les cellules sont ensuite transduites avec du lentivirus GFP coloré avec des anticorps anti GFP et visualisés. Enfin, les cultures sont fixées et les épines dendritiques sont imagées à l’aide de la microscopie confocale.

En fin de compte, les données d’image des épines dendritiques humaines sont reconstruites en 3D pour leur classification et leur quantification. Ce protocole fournit une procédure par étapes pour obtenir les neurones glutamatergiques des couches deux à quatre du cortex cérébral humain. Il implique l’utilisation de cellules souches neurales dérivées de cellules souches prépotentes induites par l’homme qui proviennent de fibroblastes humains sur la base de la méthode précédemment publiée.

Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes est qu’elle permet la segmentation automatique du DON droit et du PY en 3D. Ceci avec un gain de temps appréciable par rapport aux logiciels existants, qui se préparent généralement à partir de l’analyse 2D uniquement. Le donr et l’espion dans les classifications sont très pratiques et faciles à utiliser.

Pour préparer des cultures neuronales, placez des lamelles en verre dans six boîtes de culture et ajoutez de la polyornithine incubée pendant la nuit sous une hotte à flux le lendemain. Utilisez DPBS pour laver les lamelles trois fois et ajoutez de la laminine incubée sous une hotte à flux pendant au moins 10 heures. Préparez un milieu de culture contenant les composants suivants.

Ensuite, utilisez le milieu pour plaquer et expédier des cellules souches neurales ou NSCS à une densité de 50 000 cellules par centimètre carré en pipetage avec des mouvements de rotation lents afin de réduire l’agrégation cellulaire pour transduire les neurones humains dérivés de l’IPSC. À n’importe quelle étape de la maturation, ajouter un microlitre d’une solution mère contenant 40 nanogrammes de vecteur lentiviral GFP par puits de culture contenant du milieu de culture frais, et incuber à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Pour préparer les cellules à l’immunofluorescence, retirez le milieu de culture et utilisez du formaldéhyde à 4 % pour fixer les cellules transduites à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, utilisez un XPBS pour laver les cellules trois fois pendant 10 minutes chacune. Ensuite, immergez les lamelles dans du PBS complété par 0,05 % de sérum de cheval Triton X 110 % et incubez à température ambiante pendant une heure. Utilisez ensuite PBS pour laver les lamelles trois fois.

Ajoutez un 1000e anticorps primaire GFP dans 100 microlitres de sérum de cheval PBS 4 % à chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Diluez maintenant l’anticorps conjugué Alexa Fluor 4 88 de un à 200 dans du PBS 0,5 % entre 20 et incubez les cellules avec la solution d’anticorps à température ambiante pendant une heure après avoir utilisé du PBS pour laver les lames trois fois.

Utilisez un support de montage pour monter les lames pour la microscopie à fluorescence. Au microscope confocal, sélectionner au moins 10 neurones sains par condition avec une morphologie paramétallique et une arborisation dendritique plissée pour quantifier 60 à 100 micromètres par dendrite. Acquérez des images avec un objectif à huile de 40 x na, 1,3 et un laser de 488 nanomètres avec une puissance de crête typique au niveau de l’échantillon d’environ 20 microwatts, réglez la taille des pixels autour de 80 nanomètres pour échantillonner correctement les épines dendritiques.

Pour échantillonner l’ensemble du volume neuronal, il faut acquérir une pile Z avec un espacement Z de 150 à 300 nanomètres, produisant 20 à 30 tranches Z pour effectuer une quantification 3D des épines dendritiques. Utilisez les paramètres suivants pour le logiciel d’analyse pour le prétraitement. Utilisez le filtrage gaussien en choisissant le lissage du traitement d’image, le filtre gaussien.

Définissez la largeur du filtre égale à la taille du pixel dans le plan XY pour effectuer un traçage semi-automatique des dendrites à partir du module de traçage de filament. Dans l’onglet tranche, utilisez l’outil de distance pour estimer le diamètre de la dendrite. Ensuite, dans l’onglet dépassé, cliquez sur l’outil filaments et choisissez sauter la création automatique pour une meilleure robustesse dans l’onglet dessin.

Maintenant, sélectionnez le chemin automatique comme méthode, dendrite comme type, et entrez le diamètre estimé de la dendrite. En utilisant le mode de sélection du pointeur, tournez le curseur dans une boîte et choisissez Maj et faites un clic droit sur le point de départ de la dendrite. Le logiciel effectuera les premiers calculs.

Déplacez maintenant le pointeur le long de la dendrite à partir du point de départ. Une ligne jaune représentant le chemin de dendrite le plus probable est affichée. Appuyez sur Maj et sur la gauche.

Cliquez sur le point de terminaison dendrite pour effectuer une segmentation automatisée du dos dans l’interface du module. Cliquez sur l’onglet de création dans la liste déroulante de reconstruction. Choisissez reconstruire le diamètre de la dendrite et cochez la case Conserver les données.

Cliquez ensuite sur reconstruire. Définissez le seuil de sorte que le volume segmenté corresponde au volume réel de dendrites. En tant qu’algorithme, sélectionnez la distance la plus courte de la carte de distance.

Cliquez ensuite sur le bouton suivant sous l’onglet de la tranche, déterminez la plus petite colonne vertébrale, le diamètre de la tête et la longueur maximale. Ensuite, sous l’onglet dépasser, entrez les valeurs des paramètres autour de 200 à 300 nanomètres pour un diamètre minimal et quatre micromètres pour une longueur maximale sont de bons points de départ sans cocher la case autoriser les épines, cliquez sur le bouton suivant. Ensuite, ajustez le seuil des points de départ de sorte que les points bleus représentant les épines soient localisés sur les têtes de colonne vertébrale réelles.

Cliquez ensuite sur suivant. Le calcul de base sera maintenant effectué et peut prendre du temps pour classer les épines sous l’onglet outils de l’interface du module, cliquez sur classifier la colonne vertébrale. Après avoir vérifié qu’il y a quatre classes comme indiqué dans le protocole texte, l’interface du module générera quatre nouveaux objets filament avec les résultats de la classification.

Enfin, exportez les données statistiques sous l’onglet statistiques en cliquant sur exporter toutes les statistiques vers un fichier. Cette figure illustre la culture de neurones humains marqués d’un anticorps anti-bêta-trois tubuline. La tendance à l’agrégation cellulaire est également évidente ici.

On voit ici un neurone paramétallique marqué à la GFP 40 jours après la différenciation d’un progéniteur cortical tardif. Des couches corticales superficielles. L’encart montre un grossissement plus faible avec le corps cellulaire apparent.

Ces panneaux représentent la reconstruction 3D de segments d’épines dendritiques à différents stades de maturation. L’analyse quantitative de la densité de la colonne vertébrale et du volume de la tête de la colonne vertébrale est présentée ici. Comme prévu, ces deux paramètres augmentent au cours de la période de culture.

Lors de la procédure de culture, il est important de plaquer et d’expédier très soigneusement les cellules souches neurologiques en ajoutant lentement des cellules avec un léger mouvement de rotation afin de réduire la choline cellulaire. En effet, cette méthode nécessite l’identification de neurones individuels.