Name: Quantification tridimensionnelle dépines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez une analyse quantitative 3D des épines dendritiques sur des neurones pyramidaux corticaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour étudier la morphologie synaptique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par l’Institut Pasteur, la fondation Bettencourt-Schueller, le Centre National de la Recherche Scientifique, l’Université Paris Diderot, l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006 ; SynDivAutism), la Fondation Conny-Maeva, la Fondation Cognacq Jay, la Fondation Orange et la Fondation Fondamental. L.G. est soutenu par une bourse de premier cycle du ministère de la Santé. Nous remercions BitPlane, en particulier Georgia Golfis, pour son aide, au début de ce travail.

1. neuronale Culture Remarque: la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes, l&#39;engagement à la lignée dorsale de télencéphale, dérivation, l&#39;amplification, et la banque de progéniteurs corticaux fin (LCP) ont été décrits dans Boissart et al 4. La différenciation neuronale des cellules de LCP-like a également été effectuée selon Boissart et al 4 avec de légères modifications. D&#39;autres procédés ont été développés pour la reprogrammation directe de fibroblastes dans des cellules souches pluripotentes induites suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a été retenue car elle permet la production sélective des neurones glutamatergiques pyramidaux. <ol><li> Traiter 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre avec de la poly-ornithine (dilué au 1/6 dans du DPBS, concentration stock 0,01%) O / N, suivie de trois lavages dans DPBS. Puis ajouter la laminine (concentration de stock 1 mg / ml, dilué 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte à flux<html> . </li><li> Plate et envoyé NSC à basse densité (50.000 cellules / cm 2) dans 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre dans 3 ml de milieu de culture constitué de DMEM / F12 (500 ml), 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 unités / ml et de la streptomycine = 10.000 unités / ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (Solution mère: 50 mM) et de la laminine (1 / 500), sans facteurs de croissance. Étape critique: Effectuer cette étape avec soin en ajoutant des cellules avec des mouvements rotatifs lents afin de réduire le regroupement de cellules. </li><li> Retirez le milieu de culture. Ajouter moyen de N2B27 frais contenant 2 pg / ml de solution de laminine frais pour garder le neurone fixé sur les lamelles de verre et d&#39;éviter l&#39;agglutination. Changer le milieu tous les 3 jours. Garder une partie du milieu restant (200 ul) avant d&#39;ajouter du milieu frais afin d&#39;éviter le séchage de la cellule. Sinon, procéder rapidement et de changer le volume total (3 ml). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Lentiviral transduction Remarque: vecteurs lentiviraux GFP ont été aimablement fournies par le Dr Uwe Maskos laboratoire à l&#39;Institut Pasteur (Paris) et préparés selon le protocole publié 5. Expression de la GFP est entraîné par le promoteur de phosphoglycérate kinase de souris (PGK). Pour cette étude, titre viral était de 400 ng / ul (solution mère dans du PBS 1x). <ol><li> Transduction de neurones humains iPSC dérivés, à quelque étape de maturation par des particules virales en ajoutant 1 pl de la solution de réserve contenant 40 ng de la GFP vecteur lentiviral par puits de culture (plaques de 6 puits) et incuber pendant 48 heures dans un milieu de culture frais. Remarque: Pour ce protocole, la durée d&#39;incubation permet un bon étiquetage des structures de la colonne vertébrale. </li></ol> 3. immunofluorescence Remarque: Afin d&#39;améliorer l&#39;étiquetage de l&#39;ensemble morphologie du rachis, l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence a été effectuée en utilisant un anticorps anti-GFP dans des conditions perméabilisées. </p&gt; <ol><li> Retirer milieu de culture et de fixer les cellules transduites sur des lamelles dans du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3 fois dans du PBS 1X (10 minutes chacun). </li><li> Des lamelles de immerger dans PBS additionné de 0,05% de Triton (100x) et 10% de sérum de cheval pour 1 heure à température ambiante, puis laver 3 fois en PBS 1x. </li><li> Ajouter 100 ul de 1 x PBS additionné de 4% de sérum de cheval et l&#39;anticorps primaire (1/1000) dirigé contre la GFP et dilué par un facteur de 1000 sur chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre O / N à 4 ° C, puis laver 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Diluer Alexa Fluor 488 conjugué anticorps (1/200) dans du PBS supplémenté avec 0,5% de Tween 20 et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver 3 fois en PBS 1x et monter des lamelles sur des lames de verre avec un milieu de montage pour la microscopie de fluorescence. </li></ol> 4. épines dendritiques Imaging <ol><li> Effectuer imagerie confocale à travers un microscope confocal à balayage laser microscope. </li><li> Sélectionner neurones sains avec une morphologie pyramidaletrouver une arborisation dendritique complet, et de quantifier au moins 10 neurones par l&#39;état à partir d&#39;expériences distinctes. Quantifier 60 - 100 um par Dendrite. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;une huile 40X NA = 1,3 objective et une ligne laser de 488 nm pour la GFP excitation, avec une puissance de crête typique au niveau de l&#39;échantillon environ 20 uW. Définir la taille du pixel autour de 80 nm à échantillonner convenablement épines dendritiques. Remarque: L&#39;appel de l&#39;analyse subséquente pour une image dans laquelle le bruit ne compromet pas la bonne segmentation des dendrites et des épines. Avec les réglages d&#39;échantillonnage et de puissance spatiales mentionnés ci-dessus, nous avons observé que un pixel temps de séjour de 3,15 ms est suffisante pour collecter suffisamment de photons pour construire une telle image. Pour les échantillons sombres, la qualité d&#39;image peut être améliorée en moyenne de 2 à 4 scans. L&#39;acquisition de plusieurs tuiles XY peut être nécessaire pour couvrir la région d&#39;intérêt, qui doit ensuite être cousus ensemble avant le traitement. </li><li> Pour goûter à la totalité du volume de neurone, acquérir un Z-stack, avecZ un espacement allant de 150 nm à 300 nm, ce qui donne 20 à 30 Z tranches. Remarque: La résolution spatiale latérale atteint avec ces paramètres est de 234 nm et la résolution axiale est de 591 nm. L&#39;échantillonnage est ici choisie suffisante, mais que la résolution axiale est plus grande que la plus petite taille des épines à imager, l&#39;analyse favorise les épines qui se prolongent latéralement à partir des dendrites. </li></ol> 5. 3D Quantification des épines dendritiques Remarque: Les sections suivantes décrivent spécifiquement l&#39;utilisation du logiciel Imaris pour analyse. Implémentations alternatives existent, y compris NeuronStudio 15 ou Metamorph 8, qui peut fournir des résultats similaires. Utilisez les paramètres clés suivants: <ol><li> Comme une étape de pré-traitement, utiliser le filtrage gaussien à travers les installations de traitement d&#39;image offertes par le logiciel. Effectuer un filtrage gaussien par le traitement d&#39;image&gt; Smoochose&gt; filtre gaussien. Régler la largeur de filtre pour être égale à la taille des pixels en XY. </li><li> Effectuer un tracé semi-automatique de dendrites, en utilisant le module filament Tracer du logiciel. <ol><li> Tout d&#39;abord, estimer le diamètre Dendrite, en utilisant l&#39;outil de la distance dans l&#39;onglet tranche du logiciel. </li><li> Dans l&#39;onglet Surpass, cliquez sur l&#39;outil de filaments. Pour une meilleure robustesse, ce protocole repose sur le suivi semi-automatique; cliquer sur la création automatique Ignorer. L&#39;interface du module montre maintenant l&#39;onglet Draw. Ici, sélectionnez AutoPath comme une méthode, Dendrite comme un type, et l&#39;entrée du diamètre de dendrites estimé. </li><li> Utilisez le mode de sélection du pointeur, tournant le curseur dans une boîte. Maj-clic-droit sur le point de départ de dendrites. Remarque: le logiciel effectue les calculs initiaux. </li><li> Déplacez le pointeur le long de la dendrites. Du point de départ (représentered comme une sphère bleue), une ligne jaune représentant le chemin de dendrites plus probable est indiquée. Maj-clic gauche sur le point de terminaison de dendrites. </li></ol></li><li> Effectuez la épines segmentation automatique. Remarque: Les épines sur la dendrite tracé se trouvent automatiquement par l&#39;interface du module. <ol><li> Dans l&#39;interface du module, cliquez sur l&#39;onglet Création. Dans la liste déroulante Reconstruire, choisissez Reconstruire Dendrite Diamètre et cochez la case de données Conserver. Puis cliquez sur Reconstruire. </li><li> Régler le seuil de sorte que le volume segmenté correspond au volume réel de dendrites. Comme un algorithme, sélectionnez Distance la plus courte de Carte Distance. Cliquez sur le bouton Suivant. </li><li> Déterminer le plus petit diamètre de la tête de la colonne vertébrale et la longueur maximale, à nouveau en utilisant l&#39;outil de la distance dans l&#39;onglet tranche du logiciel, puis de revenir à l&#39;onglet dépasser et entrer les paramètres. Fou ce protocole, les valeurs autour de 200 - 300 nm pour le diamètre minimal et 4 um pour la longueur maximale sont de bons points de départ. Ne cochez pas la case Autoriser Direction épines. Cliquez sur le bouton Suivant. </li><li> Réglez le Seuil Points de semences afin que les points bleus représentant épines localisent aux chefs de la colonne vertébrale réels. Cliquez sur le bouton Suivant. Note: Le calcul de base est fait maintenant et peut être long. </li></ol></li><li> Classer les épines en allant à l&#39;onglet Outils de l&#39;interface du module. Cliquez sur Classer épines. Dans l&#39;interface utilisateur invité, assurez-vous qu&#39;il ya quatre catégories définies par leur morphologie comme suit: Stubby: longueur &lt;1 pm; Champignon: Longueur (colonne vertébrale)&gt; 3 et la largeur maximum (de la tête)&gt; largeur moyenne (cou) x 2; Long et mince: Largeur moyenne (tête) ≥ Largeur moyenne (cou); Filopodia comme: Longueur ≤ 4 pm (sans tête). Remarque: La moInterface Dule génère quatre nouveaux objets à incandescence contenant les résultats de la classification. </li><li> Exporter des données statistiques: sur l&#39;un de ces quatre interfaces d&#39;objets, cliquez sur l&#39;onglet Statistiques. Cliquez sur l&#39;exportation toutes les statistiques to File. Remarque: D&#39;autres valeurs statistiques peuvent être exportés pour dendrites (. Par exemple, longueur, surface, diamètre moyen, la profondeur de la branche, la ramification angle, volume, etc.), Et pour les épines (par exemple, la rectitude, zone de fixation, la longueur et le volume des distincte parties de la colonne vertébrale, diamètre de la colonne vertébrale, les densités, etc.) </li></ol>

<ol><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li>
<li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li>
<li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li>
<li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li>
<li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+beta+2%2A+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li>
<li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).</li>
<li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li>
<li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li>
<li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La quantification des caractéristiques morphologiques de neurones pyramidaux appuyé sur le logiciel. L&#39;interface filament traceur a été utilisé pour la segmentation des neurones et des épines, et le module de XT a été utilisé pour leur analyse. Pour analyser l&#39;exactitude de notre technique, nous avons d&#39;abord comparé les paramètres mesurés morphologiques (longueur, surface et volume total de la colonne vertébrale le cas échéant), avec ceux publiés en utilisant rat neurones pyrami...

Épines dendritiques des neurones corticaux pyramidales sont de petites protubérances minces et qui sont distribués le long des dendrites basales et apicales de ces sous-types de neurones dans des rongeurs, des primates, et de cerveau humain. Ils sont les sites de la plupart des synapses excitateurs et afficher les fonctions clés de l&#39;apprentissage et les processus cognitifs. Les structures détaillées des épines dendritiques humaines ont été techniquement étudié par microscopie électronique 2. Cependant, une telle approche est de temps et représente lourde charge de travail. Plus récemment, un à trois dimensions (3D) de reconstruction de la morphologie des épines dendritiques a été rapporté dans le cortex du cerveau humain en utilisant un logiciel spécifique combiné à large analyse de la colonne vertébrale manuel 3. La protéine de fluorescence verte (GFP) couplé à la technologie immunofluorescence représente un outil précis pour l&#39;identification de la colonne vertébrale et la mesure de la forme de microscopie de fluorescence. Cette approche peut être facilement appliquée à des neurones en culture. However, aucune donnée n&#39;a été signalé sur l&#39;analyse de la colonne vertébrale la maturation et la morphologie sur les neurones humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). L&#39;objectif de cette étude était de décrire un protocole, qui permet l&#39;imagerie de la colonne vertébrale dendritique de neurones humains cultivés in vitro. L&#39;étiquetage de la GFP, microscopie confocale et analyse 3D avec le module filament Tracer de logiciels Imaris ont été utilisés dans le présent protocole. Étapes de culture qui sont nécessaires pour obtenir des neurones glutamatergiques corticaux de couches II à IV à partir de cellules souches neurales (NSC) sont également brièvement décrit ici. L&#39;ensemble du protocole pour la production NSC humaine a déjà été publié ailleurs 4.

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), sans Calcium, Magnésium et Rouge de Phénol</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Poly-L-Ornithine Bioréactif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine de souris</td><td>Dutscher Dominique</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplément</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément sans vitamine A (50 fois)</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Med SFM</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Steptomycine</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP Sérum de lapin Anticorps polyclonal</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin&nbsp ;</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-betaIII tubuline</td><td>Anticorps Millipore</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass 13 mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Réactif avec DAPI</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes humains</td><td>Coriell Cell Line Biorepository</td><td>GM 4603 et GM 1869</td><td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss (Allemagne)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zurich</td><td>version 6.4.0</td><td>Les modules Filament Tracer et Imaris XT sont nécessaires</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>Huygens Logiciel Huygens, SVI, Pays-Bas</td><td>Version Pro</td><td>En option (pour les tests de déconvolution)</td></tr></tbody></table>

quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de pyramidal neurones humains induits dérivé de cellules souches pluripotentes

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Épines dendritiques sont des petites saillies qui correspondent aux compartiments post-synaptiques excitateurs de synapses du système nerveux central. Ils sont répartis le long des dendrites. Leur morphologie est largement tributaire de l&#39;activité neuronale, et ils sont dynamiques. Épines dendritiques expriment des récepteurs glutamatergiques (NMDA et AMPA récepteurs) sur leur surface et au niveau de la densité post-synaptique. Chaque colonne permet le neurone de contrôler son activité étatique et local indépendamment. Morphologies de la colonne vertébrale ont été largement étudiées dans les cellules pyramidales du cortex glutamatergiques du cerveau, en utilisant deux approches in vivo et des cultures de neurones obtenus à partir de tissus de rongeurs. Neuropathologiques conditions peuvent être associées à l&#39;induction de l&#39;altération de la colonne vertébrale et maturation, comme représenté sur les rongeurs neurones en culture et l&#39;analyse quantitative unidimensionnelle 1. La présente étude décrit un protocole pour l&#39;analyse quantitative des morphologies 3D de la colonne vertébrale en utilisant cortic humaineal neurones dérivés de cellules souches neuronales corticales (progéniteurs tardifs). Ces cellules ont été initialement obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole permet l&#39;analyse des morphologies de la colonne vertébrale pendant les périodes de culture différents, et avec possibilité de comparaison entre des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir d&#39;individus témoins avec ceux obtenus à partir de patients atteints de maladies psychiatriques.

<html> La présente étude décrit un protocole normalisé pour la colonne vertébrale quantification des dendrites culture de neurones pyramidaux dérivés de iPSC. Ce protocole permet l&#39;analyse de la colonne vertébrale maturation sur les neurones humains et sa possible par rapport à la maturation des épines dans des cultures neuronales de rongeurs standard ainsi que in vivo dans des modèles animaux. La figure 1A représente un schéma des différentes étapes de culture q...

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

L'objectif général de cette procédure est d'imaginer les épines dendritiques issues de neurones péraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines et de les quantifier en trois dimensions. Cela est réalisé en traitant d'abord des lamelles placées dans des plaques à six puits avec du polyuréthane et de la laminine pour la culture de cellules souches neuronales. Ensuite, les cellules souches neuronales diluées en culture.Les milieux sont ensemencés en utilisant un mouvement doux de pipetage rotatif et sont laissés se différencier jusqu'à 70 jours en culture. En renouvelant régulièrement le milieu, les cellules sont ensuite transduites avec un lentivirus exprimant la GFP, marquées par des anticorps anti-GFP et visualisées. Enfin, les cultures sont fixées et les épines dendritiques sont observées par microscopie confocale.En fin de compte, les données d'image des épines dendritiques humaines sont reconstruites en 3D afin d'en permettre la classification et la quantification. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour obtenir des neurones glutamatergiques des couches deux à quatre du cortex cérébral humain. Il implique l'utilisation de cellules souches neural

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l'examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Cette vidéo décrit une méthode de préparation de lamelles en verre recouvertes de polyornithine et de laminine pour améliorer l’adhésion et la croissance des cellules souches neurales. La technique implique des incubations et des lavages séquentiels, facilitant la formation d’une matrice de soutien qui favorise la croissance et la différenciation des cellules neuronales, imitant les structures présentes dans les neurones.

Génération de neurones pyramidaux corticaux à partir de cellules souches neurales humaines

Source : Gouder, et. al. Quantification tridimensionnelle des épines dendritiques des neurones pyramidaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. J. Vis. Exp. (2015).Cette vidéo démontre l’imagerie et l’analyse des épines dendritiques dans des neurones pyramidaux transduits et immunomarqués à l’aide de la microscopie confocale. Le bruit de fond est réduit et les dendrites sont tracées en estimant leur diamètre et leur longueur. La segmentation automatisée de la colonne...

Quantification des épines dendritiques à l’aide de l’imagerie par microscopie confocale

Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Nous décrivons deux méthodes de visualisation et de quantification de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe de modèles murins : l’imagerie en temps réel et l’imagerie en profondeur de champ étendue. Alors que la première méthode permet un traçage topographique sophistiqué et une quantification de l’étendue de la ramification, la seconde permet une visualisation rapide de l’arbre dendritique.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Le protocole développe un modèle tridimensionnel (3D) d’un segment dendritique avec des épines dendritiques pour la modélisation de la plasticité synaptique. Le maillage construit peut être utilisé pour la modélisation computationnelle du trafic des récepteurs AMPA dans la plasticité synaptique à long terme à l’aide du logiciel Blender avec CellBlender et MCell.

Modélisation 3D des épines dendritiques avec plasticité synaptique

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.

Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Les épines dendritiques sont des compartiments post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices. Des altérations de la morphologie de la colonne dendritique se produisent au cours du neurodéveloppement, du vieillissement, de l’apprentissage et de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, soulignant l’importance d’une analyse fiable de la colonne dendritique. Ce protocole décrit la quantification de la morphologie de la colonne dendritique avec précision et reproductibilité à...

Quantification de la colonne dendritique à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Découvrez une analyse quantitative 3D des épines dendritiques sur des neurones pyramidaux corticaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour étudier la morphologie synaptique.

Quantification tridimensionnelle dépines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification tridimensionnelle d'épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Explorer plus de vidéos