Name: Génération de lintégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir de kératinocytes capillaires humains. Cette méthode épisomale évite l'intégration génomique pour des applications en médecine régénérative.

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Les auteurs tiennent à remercier Harene Ranjithakumaran et Stacey Jackson pour leur soutien technique. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (R.C.B. Wong, A. Pébay), de l’Université de Melbourne (R.C.B. Wong), de Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) et de l’Institut de recherche ophtalmique d’Australie (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) ; Bourse d’études du Conseil australien de la recherche (A. Pébay, FT140100047), bourse de la Fondation Cranbourne (R.C.B. Wong) ; un financement interne des National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) et un soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de Victoria.

La collection de l&#39;échantillon de cheveux humains de personnes nécessite l&#39;approbation éthique par le comité d&#39;éthique de la recherche humaine dans les établissements d&#39;accueil et doit être fait en conformité avec les directives institutionnelles. 1. Isolement de kératinocytes à partir de pileux épilé <ol><li> Thaw matrice extracellulaire (ECM) (c.-à-Matrigel) sur la glace O / N. </li><li> En utilisant des pointes de pipette pré-réfrigérés, ajouter 200 solution ECM ul à 12 ml de milieu DMEM réfrigérés / F12. Manteau une plaque de 12 puits avec 1 ml de solution d&#39;ECM dilué dans chaque puits. Incuber la plaque O / N couché à 37 ° C. Laver la plaque revêtue avec / milieu F12 DMEM préchauffé avant utilisation. </li><li> Recueillir cheveu humain primaire à partir de la tête de l&#39;individu en plaçant les doigts à proximité de la racine des cheveux et plumer les cheveux dans un mouvement rapide et lisse. Vérifiez pour confirmer que chaque cheveux collectés contient un follicule pileux intacts et déterminer la phase de l&#39;ONU de cheveux de croissanceder un microscope à dissection (figure 1). <ol><li> Recueillir 5-10 poils anagène de chaque individu pour extraire les kératinocytes. Processus arraché les poils dès que possible pour assurer la dérivation réussie de kératinocytes. Remarque: La figure 1 illustre la morphologie des poils dans les différentes phases du cycle de croissance. Cheveux anagène se trouve dans la phase de croissance, avec une couche extérieure visible de l&#39;épithélium entourant la longueur des cheveux, connu sous le nom de SRO. D&#39;autre part, les cheveux télogène représente cheveux en phase de repos et ne pas avoir un ORS visibles, mais il a une boule claire de cellules couvrant la racine des cheveux, connu sous le renflement télogène. </li></ol></li><li> Placez les échantillons de cheveux dans une boîte de Pétri contenant 10 ml de mélange antibiotique se laver pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Avec des ciseaux et des pinces stérilisées, couper l&#39;arbre de cheveux excessive, laissant un fragment de cheveux avec un follicule pileux intacts et autour de 0,5 à 1 cm de tige du cheveu. </li><li> Tra attentivementnsfer fragment 1 de cheveux dans chaque puits de la plaque revêtue de l&#39;ECM en utilisant une pince. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 1 ml, ajouter environ 3 gouttes de sérum Knockout remplacement (KSR) moyen (~ 100 - 200 pi) à des échantillons de cheveux. Remarque: Gardez les fragments de cheveux en contact étroit avec la surface de la plaque pour permettre l&#39;attachement et kératinocytes ultérieure excroissance. Ajout de médias excessive à cette étape peut provoque les fragments de cheveux flotter et diminue la chance de l&#39;attachement de cheveux réussie. </li><li> Incuber les échantillons de cheveux dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de permettre aux follicules pileux pour attacher O / N. Le jour suivant, ajouter doucement 3 gouttes d&#39;un autre moyen KSR (~ 100 - 200 pi) pour maintenir les échantillons de cheveux humide. </li><li> Respecter les échantillons de cheveux tous les jours pour confirmer que les follicules pileux ont attaché avec succès. Généralement attachement des follicules pileux est apparente dans les 1-3 jours. Poils épais sont généralement plus facile à fixer par rapport à poils fins, comme les poils fins ont élevétendance à flotter qui entravent le processus de fixation. <ol><li> Une fois que les cheveux ont fixé à la plaque revêtue, ajouter 500 ul de milieu KSR au puits. Redoublez de prudence lors de l&#39;ajout du milieu comme des échantillons de cheveux peuvent ne pas avoir attachée fermement. De ce point, changer de support tous les 2 jours. Remarque: excroissances kératinocytes doivent être visibles de la région ORS du fragment de cheveux après 3-7 jours (Figure 2A-B). Autoriser les kératinocytes de croître jusqu&#39;à 14 jours avant repiquage des cellules comme décrit dans la section suivante. </li></ol></li></ol> 2. Maintenance et repiquage des kératinocytes <ol><li> Pré-enduire une plaque de 6 puits en utilisant le kit de revêtement Matrix. Ajouter 680 ul de milieu de dilution de la trousse à chaque puits, suivis par 6,8 ul de solution de revêtement Matrix. Agiter la plaque pour assurer une distribution uniforme de la solution de matrice de revêtement sur la plaque. </li><li> Laisser la plaque revêtue à incuber pendant 30 min à température ambiante. Supprimerla solution de revêtement matrice avant le placage des kératinocytes. </li><li> Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 500 pi de trypsine à 0,25% par puits pour 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 500 ul de milieu contenant du sérum (par exemple, sérum bovin fœtal (FBS) Moyen) et recueillir dans un tube de 15 ml stérile. Retirer le fragment de cheveux à l&#39;aide des pinces stérilisées. </li><li> Déterminer le nombre de cellules récoltées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 3 minutes à 200 x g. Laver les cellules avec du PBS et centrifugation répétition. Aspirer le PBS et remettre le culot de cellules dans un milieu de kératinocytes frais. </li><li> Plate baisse de 4 × 10 4 kératinocytes dans un puits de la plaque d&#39;ECM-revêtue de la présence d&#39;un milieu de kératinocytes. Garder les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 (figure 2C). Changer de support tous les cellules de jour et de passage lorsque la culture est ~ 80% de confluence, WHIch peut prendre environ 2-7 jours en fonction du nombre de passage et la prolifération des kératinocytes taux. Les kératinocytes dérivés devraient être élargis pour générer des stocks congelés suffisant en utilisant les méthodes de cryoconservation congélation lente standards 16. Remarque: Les conditions de culture décrites soutenir l&#39;expansion de la population homogène de kératinocytes avec la morphologie typique pavée (figure 2C). Parfois, quelques kératinocytes différenciés, avec une morphologie large et plat et ont perdu potentiel réplicatif, peuvent être observées dans la culture. Caractérisation des kératinocytes peut être effectuée par immunocoloration en utilisant des anticorps contre la cytokératine 14 17 comme décrit précédemment. Des lignées cellulaires de kératinocytes établis doivent également être testés pour mycoplasmes après 1-3 passages en utilisant le kit disponible dans le commerce. </li></ol> 3. Génération de hiPSCs de kératinocytes Utilisation épisomique Vecteurs <ol><li> Pré-enduire une plaque de 6 puits avec0,1% de gélatine (2 ml / puits). Autoriser la gélatine pour enrober pendant au moins 20 min à température ambiante. </li><li> Pour l&#39;expérience de reprogrammation, utilisation kératinocytes plus tard passage 6. Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 1 ml de trypsine à 0,25% par puits pendant 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 1 ml de milieu contenant du sérum (par exemple, les médias FBS) et recueillir dans un tube de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 3 min à 200 cellules XG et remettre en suspension dans un milieu de kératinocytes. Planche 1 × 10 × 10 5 -1.5 5 kératinocytes par puits dans une plaque O / N gélatinisé. </li><li> Le jour suivant (jour 0), vérifier la plaque pour assurer cellules sont 50-60% de confluence. Remarque: Si les kératinocytes sont moins de ~ 50% de confluence ils pourraient ne pas bien grandir après la transfection. </li><li> Le jour 0, effectuer la transfection des vecteurs épisomiques de reprogrammation sur les kératinocytes, en utilisant un rapport de 8 pi de réactif de transfection à 2 pg d&#39;ADN de plasmide totale.<ol><li> Prenez 0,5 pg pour chacun des 4 plasmides (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) et diluer dans 100 pi de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM). Remarque: Le plasmide pCXLE-eGFP est utilisé pour surveiller l&#39;efficacité de transfection dans les kératinocytes et est pas nécessaire pour la reprogrammation de succès. </li><li> Ajouter 8 ul de réactif de transfection de l&#39;ADN dilué. Mélanger en tapotant le tube. Laisser le mélange réactionnel reposer à l&#39;ADN intact à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Remplacez le support des kératinocytes avec du milieu frais. </li><li> Ajouter doucement le mélange de réaction de l&#39;ADN à la culture des kératinocytes et incuber dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4 heures. Remarque: Il est recommandé de ne pas effectuer la transfection prolongée O / N dans les kératinocytes comme ils présentent une faible survie post-transfection. </li><li> Après 4 heures post-transfection, remplacer le milieu des kératinocytes avec du milieu frais. </li></ol></li><li> Le Jour 1 (1 jour post-transfection), changer le milieu de kératinocytes et de vérifier l&#39;efficacité de transfection en estimant le pourcentage de cellules positives eGFP sous un microscope à fluorescence. Typiquement&gt; 60-70% d&#39;efficacité de transfection est observée pour les kératinocytes primaires en utilisant ce protocole. </li><li> Le jour 2, répéter transfection comme décrit dans l&#39;étape 3.5. Deux transfections consécutifs seraient typiquement atteindre&gt; 90% d&#39;efficacité de transfection. culture de kératinocytes atteint généralement confluence avant la fin de la seconde transfection. <ol><li> Préparer un plat de 10 cm de la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) chargeur pour chaque réaction de reprogrammation. Préparer mangeoires MEF mitotiquement inactivés comme décrit précédemment 18. </li><li> Pré-couche d&#39;un plat de 10 cm avec 5 ml de 0,1% de gélatine pendant au moins 20 min. Planche 4 × 10 6 MEF mitotiquement inactivé par boîte de 10 cm dans un milieu FBS. Laisser les cellules se déposer et se fixent O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Le Jour 3, haracquises les kératinocytes avec 0,25% de trypsine comme décrit dans l&#39;étape 3.2 et 3.3. Reprendre les kératinocytes dans un milieu KSR et de la plaque de 90% de kératinocytes à partir de 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits dans un plat d&#39;alimentation MEF 10 cm avec un milieu KSR. </li><li> Partir du jour 4., changer le milieu KSR chaque jour. <ol><li> Alternativement après Jour 18, remplacer le milieu de culture tous les deux jours. Remarque: les kératinocytes non reprogrammé cesseront de proliférer, alors que les colonies hiPSC avec limite définie qui ressemblent à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) apparaîtront à Jour 14 - 21 ans. </li></ol></li><li> Isoler colonies hiPSC par dissection manuelle de Jour 21 partir. Évitez les colonies hiPSC qui sont étroitement regroupés ensemble et ne ramassent colonies hiPSC qui sont clairement séparés des autres. Note: colonies de hiPSC peuvent être récupérés plus tôt, mais la colonie avec des frontières définies pourraient ne pas être évidente à des moments antérieurs étant donné la petite taille de la colonie. l&#39;efficacité de reprogrammation peuvent varier entre les différents kératinocytes du patient, et est aussi influencée par d&#39;autres facteurs tels que le nombre de passage ou le taux de kératinocytes de prolifération. <ol><li> Pour la dissection manuelle de colonies hiPSC, utiliser une aiguille de 26G à couper colonies hiPSC sous un microscope de dissection. Couper une colonie hiPSC en petits morceaux autour de 300 à 600 mm de longueur. Transférer les morceaux d&#39;une colonie hiPSC dans une nouvelle plaque d&#39;alimentation MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) pour établir une ligne clonale de hiPSCs. Initialement, la culture de chaque lignée clonale hiPSC dans un puits d&#39;une plaque de 12 plats ou de la culture d&#39;organes ainsi, puis développez à 6 format de plaque bien. </li><li> Maintenir lignées clonales de hiPSCs établies en milieu KSR sur mangeoires MEF. Une fois la culture atteindre 70 à 80% de confluence avec des colonies hiPSC ~ 1,5 mm de diamètre, hiPSCs de passage en utilisant des procédés enzymatiques standards de passages (Accutase, la dispase ou la collagénase IV) selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Caractériser ligne hiPSC établis pour confirmer la pluripotence et leur capacité à se différencier en cellules représentatives des trois feuillets embryonnaires in vitro et / ou in vivo 13,19. En outre, les lignes hiPSC analysent l&#39;régulièrement établis pour mycoplasmes en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour assurer qu&#39;ils sont exempts de pathogènes. Surveiller régulièrement la stabilité du génome de lignes hiPSC par caryotype ou basée sur la baie nombre de copies variation (CNV) analyse. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Génération de hiPSCs spécifiques au patient offre une approche unique pour l&#39;étude de la pathogenèse dans les types de cellules malades in vitro, et fournit également une plate-forme pour le criblage de médicaments pour identifier de nouvelles molécules qui peuvent sauver les phénotypes de la maladie. Cette approche de modélisation de la maladie en utilisant hiPSCs a donné des résultats prometteurs pour une variété de maladies, y compris le syndrome du QT long, la maladie de Huntington, la maladie de Parkin...

La découverte de cellules souches pluripotentes humaines induites (de hiPSCs) a révolutionné le domaine de la médecine régénérative, fournissant une méthode possible pour la production de cellules souches spécifiques à des patients 1-3. hiPSCs ont été générés avec succès à partir de divers types de cellules somatiques, y compris des fibroblastes, des cellules hématopoïétiques de 4,5 à 6,7, les cellules epitheliales rénales à partir de l&#39;urine et des kératinocytes 8 9,10. À ce jour, les fibroblastes de la peau et des cellules hématopoïétiques représentent les sources de cellules les plus couramment utilisés pour générer des CSPi spécifiques au patient. Sans doute, cela est dû au fait que les biopsies de la peau et de la collecte de sang sont des procédures médicales de routine et de grandes biobanques d&#39;échantillons de sang ou de la peau des patients ont été établis dans de nombreux pays. Contrairement aux cellules sanguines et les fibroblastes de la peau qui exigent des méthodes d&#39;extraction envahissantes, les kératinocytes représentent un type cellulaire facilement accessible pour la génération hiPSC. Keratinocytes sont des cellules épithéliales de kératine riche qui forment la barrière épidermique extérieure de la peau et l&#39;on retrouve également dans les ongles et les cheveux 11. En particulier, les kératinocytes peuvent être trouvés sur la gaine externe de la racine (SRO) des follicules pileux, une couche externe cellulaire qui couvrait la tige du cheveu avec la gaine intérieure de racine (IRS) des cellules (12, figure 1). Comme la collecte de cheveux est une procédure simple qui ne nécessite pas l&#39;assistance du personnel médical, il fournit une occasion pour les patients de recueillir et d&#39;envoyer leurs propres échantillons de cheveux pour les laboratoires, ce qui faciliterait grandement la collecte des échantillons de patients pour la génération hiPSC. kératinocytes épidermiques ont également une efficacité de reprogrammation ultérieure et cinétique rapide de reprogrammation par rapport à des fibroblastes, en ajoutant aux avantages de l&#39;utilisation des kératinocytes comme cellules de départ pour la production hiPSC 9,13. En outre, hiPSCs peut également être générée à l&#39;aide d&#39;autres populations de cellules au sein du follicule pileux,y compris les cellules de papilles dermiques situés à la base de la 14,15 du follicule pileux. Les rapports précédents de génération iPSC utilisant des cellules de cheveux dérivé utilisent souvent des méthodes de reprogrammation rétroviraux ou à base de lentivirus 9,14,15. Cependant, ces procédés introduisent intégration génomique virale de transgènes étrangers indésirables lors de la reprogrammation. En comparaison, l&#39;utilisation de vecteurs épisomiques représente un procédé de reprogrammation est possible, non viral pour générer iPSCs libre rapprochement 4. Nous avons déjà mis au point une méthode simple, rentable et non virale pour reprogrammer efficacement kératinocytes en hiPSCs utilisant des vecteurs épisomiques 13. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de hiPSCs de kératinocytes dérivés, y compris la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux pincées, l&#39;expansion et le maintien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure de générer hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>Mélange d’antibiotiques :&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml Amphotéricine antimycosique B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>Le mélange d’antibiotiques est composé de PBS.</td></tr><tr><td>1X Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR) moyen :&nbsp ;</td><td></td><td></td> Le <td>milieu KSR est filtré à l’aide de Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) avant utilisation. Le bFGF est ajouté frais au milieu avant utilisation.</td></tr><tr><td>20 % de remplacement sérique knock-out (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 avec glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1& fois ; Acide aminé non essentiel MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; 0,5&fois ; Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; 0,1 mM de &bêta-mercaptoéthanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; bFGF (10 ng/ml, ajouté frais)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Milieu kératinocytaire :&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; EpiLife avec 60 et micro ; M Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1& fois ; Supplément de croissance de kératinocytes humains (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS) milieu :&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Le milieu FBS est filtré à l’aide de Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) avant utilisation.</td></tr><tr><td>10 % de sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0,5x Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrice extracellulaire (ECM) :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel stock et stocke à -80&deg ; C suivant le fabricant » . La concentration de la matrice de Matrigel varie légèrement d’un lot à l’autre (~9 mg/ml). Nous recommandons d’utiliser 200&micro ; l matrigel pour le revêtement d’une plaque à 12 puits (~150&micro ; g/puits).&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de matrice de revêtement&nbsp ;</td><td>Plasmides Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>:&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Notez que pCXLE-eGFP n’est utilisé que pour surveiller l’efficacité de la transfection et n’est pas nécessaire pour la reprogrammation.</td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td>Réactif</tr> de <tr><td>transfection Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine (à partir de peau de porc)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Compléter 0,1 % de gélatine dans de l’eau distillée. Autoclave avant utilisation.</td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit : OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Le fibroblaste embryonnaire de souris (MEF)</td><td></td><td></td> peut <td>être inactivé par un traitement à la mitomycine C ou une irradiation comme décrit précédemment 16.</td></tr><tr><td>Aiguille 26G</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 6 puits (culture tissulaire traitée)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>plaque 12 puits (culture tissulaire traitée)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm (culture tissulaire traitée)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Utilisation à 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Utilisation à 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Anticorps TRA-160</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>Utilisation à 5 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>OCT4</td> anticorps <td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Utilisation à 5 &micro ; g/ml</td></tr><tr><td>d’anticorps NANOG</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>Utilisation à 10 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert Kit de détection</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Les progrès récents en matière de reprogrammation nous permettent de transformer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). La modélisation de la maladie à l’aide d’hiPSC spécifiques au patient permet d’étudier le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse, fournissant également une plate-forme pour le développement du dépistage de médicaments in vitro et de la thérapie génique afin d’améliorer les options de traitement. Le potentiel prometteur des hiPSCs pour la médecine régénérative est également évident à partir du nombre croissant de publications (>7000) sur les iPSC ces dernières années. Divers types de cellules de lignées distinctes ont été utilisés avec succès pour la génération d’hiPSC, notamment les fibroblastes cutanés, les cellules hématopoïétiques et les kératinocytes épidermiques. Alors que les biopsies cutanées et les prélèvements sanguins sont couramment effectués dans de nombreux laboratoires comme source de cellules somatiques pour la génération de hiPSC, la collecte et la dérivation ultérieure des kératinocytes capillaires sont moins couramment utilisées. Les kératinocytes dérivés de cheveux représentent une approche non invasive pour obtenir des échantillons de cellules de patients. Nous décrivons ici une méthode simple et non invasive pour la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux épilés. Nous fournissons également des instructions pour l’entretien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure afin de générer des hiPSC sans intégration à l’aide de vecteurs épisomaux.

Les cheveux passe par trois phases différentes de cycle de croissance: anagène (phase de croissance), catagène (phase de régression) et télogène (phase de repos) 20,21. Le follicule pileux anagène contient de multiples couches de l&#39;épithélium; ces couches comprennent les SRO, IRS et l&#39;arbre des cheveux (Figure 1). Cheveux anagène finalement subit une transition à la phase catagène, qui est marquée par l&#39;apoptose des SRO et la cessation de la différenciation de l&#39;arbre de cheve...

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines à partir de kératinocytes dérivés de cheveux. Cela est réalisé en isolant d'abord des cheveux à partir d'un donneur. La deuxième étape consiste à planter les cheveux afin de favoriser l'expansion des kératinocytes.Ensuite, les kératinocytes sont maintenus et amplifiés in vitro. L'étape finale consiste à reprogrammer les kératinocytes en cellules souches pluripotentes induites humaines à l'aide d'une méthode de reprogrammation épisomale. En définitive, les cellules IPS humaines peuvent être isolées et caractérisées par immunohistochimie afin de révéler l'expression de marqueurs pluripotents.L'avantage global de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que la méthode rétrovirale ou lentivirale, est qu'en utilisant un facteur épisomal, nous évitons l'intégration indésirable de transgènes dans le génome des cellules souches générées. Commencez par décongeler un flacon de solution de matrice extracellulaire sur de la glace toute la nuit. Le lendemain matin, utilisez des embouts de pipette prérefroidis pour ajouter 200 microlitres de la solution à 12 millilitres de m

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous démontrons le protocole pour la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir des cellules somatiques humaines en utilisant des lentivirus médiée par la livraison des facteurs humains Oct4, Sox2, Nanog, et Lin28. Pluripotence a été confirmée par la morphologie et la présence de cellules souches embryonnaires (ES) de cellules de marqueurs spécifiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Le protocole suivant fournit des instructions pour l'adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l'entretien continu sont également fournis.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la cryoconservation de cellules iPS humaines dans un milieu de cryoconservation KnockOut SR et la récupération de ces cellules en complète KnockOut Feeder SR gratuit (KSR-FF) moyen ou le chargeur milieu à base de SR huitièmes de finale.

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

Cet article présente un protocole robuste pour l'isolement et la culture des cellules souches neurales de crête des follicules pileux humains.

Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

La dérivation robuste des cellules de la tige pluripotente induite par l'homme (hiPS) a été réalisée en utilisant une reprogrammation médiée par vecteur de virus Sendai non-intégrant (SeV) des fibroblastes dermiques. La maintenance cellulaire de hiPS et l'expansion clonale ont été réalisées en utilisant des conditions de culture sans xénon et chimiquement définies avec une matrice recombinante de la laminine humaine 521 (LN-521) et un milieu E8 (E8) essentiel.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Ce protocole décrit une méthode de production d’organoïdes cutanés contenant des follicules pileux à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites à l’aide d’un système de culture planaire et physiologiquement pertinent à l’interface air-liquide pour reproduire l’architecture et la fonction de la peau.

Génération d’organoïdes cutanés planaires poilus dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’un système de culture à interface air-liquide

Découvrez la génération de cellules souches pluripotentes induites sans intégration à partir de kératinocytes capillaires humains. Cette méthode épisomale évite l'intégration génomique pour des applications en médecine régénérative.

Génération de l'intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

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