Génération de l'intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Ce manuscrit fournit une procédure étape par étape pour la dérivation et la maintenance des kératinocytes humains à partir de cheveux épilés et la génération ultérieure de cellules souches pluripotentes humaines induites par intégration (hiPSC) sans intégration par des vecteurs épisomiques.

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines à l’aide de kératinocytes dérivés de cheveux. Ceci est accompli en isolant d’abord les cheveux d’un donneur. La deuxième étape consiste à plaquer les cheveux afin de faciliter la croissance des kératinocytes.

Ensuite, les kératinocytes sont maintenus et développés in vitro. La dernière étape consiste à reprogrammer les kératinocytes en cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’une méthode de reprogrammation épisomique. En fin de compte, les cellules IPS humaines peuvent être isolées et caractérisées à l’aide de l’immunohistochimie pour montrer l’expression de marqueurs pluripotents.

L’avantage global de cette méthode par rapport aux méthodes existantes telles que la méthode rétrovirale ou lentivirale, est qu’en utilisant le facteur épisomal, nous évitons les transgènes indésirables. Ils s’intègrent dans le génome dans les cellules souches qui sont générées Commencez par décongeler un flacon de solution de matrice extracellulaire sur de la glace pendant la nuit. Le lendemain matin, à l’aide d’embouts de pipette pré-réfrigérés, ajoutez 200 microlitres de la solution à 12 millilitres de milieu DM F 12 réfrigéré.

Ajouter un millilitre de la solution de matrice extracellulaire diluée dans chaque puits d’un 12. Plaquez bien et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour enrober les puits de matrice. Ensuite, prélevez les cheveux humains primaires de la tête du donneur en plaçant les doigts près de la racine des cheveux et en épilant les cheveux en un mouvement rapide et fluide.

Vérifiez que chaque cheveu collecté contient un follicule pileux intact. Placez le follicule sous un microscope à dissection et déterminez la phase de croissance de chaque cheveu. Prélevez cinq à 10 cheveux antigènes de chaque individu pour extraire la glace kératineuse.

La phase antigène, contrairement à la phase T, contient plusieurs couches d’épithélium. Placez les échantillons de cheveux dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres d’un mélange d’antibiotiques pendant cinq minutes, puis lavez-les dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, saisissez les cheveux avec une pince stérile et utilisez une paire de ciseaux stériles pour couper l’excès de tige pilaire, laissant un fragment de cheveux avec un follicule pileux intact et environ 0,5 à un centimètre de tige pilaire.

Transférez soigneusement un fragment de cheveux dans chaque puits de la plaque recouverte de matrice extracellulaire. À l’aide de la pince stérile, j’ai tapoté environ 100 à 200 microlitres de sérum de remplacement. Goutte à goutte moyenne à chaque puits contenant des échantillons de cheveux.

Placez ensuite la plaque dans l’incubateur et laissez les follicules se fixer pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le lendemain. Ajoutez doucement 100 à 200 microlitres supplémentaires de sérum de remplacement, goutte à goutte pour garder les échantillons de cheveux humides. Vérifiez quotidiennement les échantillons de cheveux pour confirmer que les follicules pileux se sont bien fixés à la plaque.

Une fois attaché, ajoutez doucement 500 microlitres supplémentaires de milieu dans le puits. Changez de support tous les deux jours. Preco une assiette à six murs avec du collagène.

Tapez un à l’aide d’un prétraitement tel qu’un kit de matrice de revêtement à 680 microlitres du milieu de dilution du kit à chaque puits, suivi de 6,8 microlitres de la solution de matrice de revêtement. Secouez doucement la plaque pour assurer un revêtement uniforme. Laisser incuber la plaque revêtue pendant 30 minutes à température ambiante avant de plaquer les kératinocytes.

Retirez la solution d’enrobage, dissociez les kératinocytes en culture en une suspension unicellulaire en ajoutant 500 microlitres de 0,25 % de tripsine par puits et incubez les plaques pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se libèrent de la plaque, inactivez la trypsine avec 500 microlitres de sérum contenant du milieu et collectez les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres. Retirez le fragment de cheveux à l’aide d’une pince stérilisée, granulez les cellules puis réusez-les.

Suspendez-les dans une plaque de milieu de croissance de kératinocytes frais de 40 000 kératinocytes dans un puits de la plaque recouverte de collagène en présence d’un milieu de kératinocytes. Changez le milieu tous les jours et passez les cellules lorsque la culture est à environ 80 % confluent V codez une plaque à six parois avec de la gélatine en ajoutant deux millilitres d’une solution de gélatine à 0,1 % dans chacune, laissez bien la gélatine s’enrober pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, dissociez les kératinocytes qui sont au passage six ou moins dans une suspension unicellulaire en ajoutant un millilitre d’essai à 0,25 % par puits et en incubant les cellules pendant deux à cinq minutes.

À 37 degrés Celsius, inactivez la trypsine avec un millilitre de milieu contenant du sérum et collectez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Granulez les cellules et mettez-les en suspension dans un milieu kératinocytaire. Ensuite, mettez en plaques 100 000 à 150 000 kératinocytes par puits dans une plaque gélatinisée à six puits et incubez-les pendant la nuit le lendemain, jour zéro, vérifiez la plaque pour vous assurer que les cellules sont confluentes à 50 à 60 %.

Effectuez une transfection des vecteurs de reprogrammation épisomale sur les kératinocytes en utilisant un rapport de huit microlitres de réactif de transfection pour deux microgrammes d’ADN plasmatique total, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Le lendemain, le premier jour, changez le milieu kératinocytaire et vérifiez l’efficacité de la transfection en estimant le pourcentage de cellules positives pour les protéines fluorescentes vertes au microscope fluorescent. Une efficacité de transfection de 60 à 70 % est attendue le deuxième jour.

Répétez la transfection pour augmenter l’efficacité de la transfection à plus de 90 %Ensuite, pré-codez une parabole de 10 centimètres avec cinq millilitres de gélatine à 0,1 % pendant au moins 20 minutes. Plaquez 4 millions de cellules nourricières inactivées par mitotique par parabole de 10 centimètres dans un milieu FBS comme décrit dans Conrad Al all et laissez les cellules se déposer et se fixer pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone le troisième jour. Récoltez les kératinocytes transfectés comme indiqué précédemment, et mettez-les en suspension dans une plaque moyenne KSR.

90 % des kératinocytes de l’un des puits dans une boîte de 10 centimètres préparée avec des cellules nourricières et les recouvrir de KSR. Isolat des colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines par dissection manuelle à partir du 21e jour. Évitez les colonies qui sont étroitement regroupées et ne choisissez que les colonies qui sont clairement séparées des autres.

Pour la dissection manuelle, utilisez une aiguille de calibre 26 pour couper les colonies en petits morceaux d’environ 300 à 600 micromètres de longueur sous un microscope à dissection. Transférez les morceaux d’une colonie dans une nouvelle plaque d’alimentation MEF pour établir une lignée clonale de cellules souches pluripotentes induites humaines. Une fois que la culture atteint 70 à 80 % de con fluence avec des colonies de cellules souches pluripotentes induites par l’homme d’environ 1,5 millimètre de diamètre, les cellules utilisant des méthodes d’emballage enzymatique standard telles que l’Accutane, le sase ou la collagénase.

Quatre, selon les instructions du fabricant. En suivant ce protocole, des excroissances recy peuvent être observées dès trois jours après la fixation des cheveux et continueront à proliférer. Les kératinocytes montrés ici ont été passés sur une nouvelle plaque et ces cellules peuvent être maintenues pour plusieurs passages.

Cette image montre une colonie typique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dérivée de kératinocytes. Après 32 jours de reprogrammation, une certaine différenciation peut se produire au centre de la colonie de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Une fois sélectionnées manuellement, les cellules dérivées présentent généralement un rapport noyau/cytoplasme élevé et une limite de colonie définie.

Ils expriment également un certain nombre de marqueurs pluripotents tels que OCT quatre nag et TRA un 60. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les kératinocytes des cheveux et de les reprogrammer en cellules souches induites par l’homme.