Name: Etudier communautés microbiennes In Vivo: Un modèle dinteraction hôte intermédiaire Entre Candida albicans Et Pseudomonas aeruginosa Dans les Airways (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Découvrez un modèle murin pour étudier les interactions entre Candida albicans et Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires. Cette méthode permet d'analyser les réponses immunitaires et la communication inter-espèces.

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Les auteurs tiennent à remercier l’Université de Lille et l’Institut Pasteur de Lille, en particulier Thierry Chassat et Jean-Pierre Decavel, responsables de l’élevage, de la sécurité et de l’élevage des animaux. Ces travaux ont été soutenus par la Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française (SPILF).

Le comité régional d&#39;éthique régional pour l&#39;expérimentation animale a approuvé cette méthode, en conformité avec soin et l&#39;utilisation des animaux national et international dans les lignes directrices de recherche expérimentaux. Collection 1. Echantillon <ol><li> Stockage des échantillons <ol><li> Recueillir tous les échantillons et immédiatement stocker à - 20 ° C ou sur de la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;entreposage au congélateur pour éviter la détérioration. Placez phosphate stérile saline tamponnée (PBS) sur la glace pour améliorer lavages broncho-alvéolaire (LBA) performance. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Stériliser tous les équipements chirurgicale en utilisant un autoclave. NOTE: Si possible, il est recommandé d&#39;utiliser deux ensembles différents d&#39;instruments pour les étapes abdominale et thoracique pour éviter la contamination croisée. Équipement de dissection requise est détaillée dans la figure 4A </li></ol></li></ol> 2. Les souris, bactéries et de levures Souches <ol><li> Les souris domestiques en conformité avec l&#39;utilisation locale des animaux dans reGuide du comité de recherche dans un rack ventilé sans dépasser 5 souris par cage, avec de la nourriture et de l&#39;eau ad lib, dans un centre d&#39;hébergement de biosécurité de niveau 2 en raison de l&#39;utilisation de niveau de biosécurité 2 micro-organismes: P. aeruginosa et C. albicans. </li><li> Conserver les souches bactériennes à -80 ° C dans du milieu de glycérol à 40%. <ol><li> Ajouter bactéries directement à partir de stock congelé dans le tube de culture contenant 3 ml de bouillon Luria-Bertani stérile en utilisant une boucle d&#39;inoculation de 10 pi. Laissez O / N à 37 ° C avec agitation orbitale (400 rpm) le jour avant l&#39;instillation. </li><li> Récolte bactéries par centrifugation à 2000 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant dans une élimination des déchets biologiques dangereux fermé approprié. Observer blanc adhérent culot au fond du tube de culture. </li><li> Laver le culot et suspendre l&#39;aide de 5 ml de PBS. </li><li> Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.3 un deuxième temps d&#39;effectuer un second lavage. </li><li> Remettre en suspension les bactéries en culot à l&#39;aide de 1 ml de PBSet une brève vortex. </li><li> Déterminer la densité de l&#39;inoculum en utilisant un densitomètre optique à 600 nm en utilisant un compteur de densité optique. Une densité de 0,9 correspond à 10 9 CFU / ml pour PAO1, diluer en conséquence. Remarque: Ce résultat doit être obtenu pour chaque souche utilisée en déterminant la densité des dilutions successives d&#39;un inoculum calibré. </li><li> Vérifiez l&#39;inoculum par dilutions logarithmiques série et plaque 100 pi de chaque dilution sur agar pourpre de bromocrésol (BCP) plaques et O / N culture. Administrer par voie intranasale chaque souris 50 ul de la solution contenant 1 x 10 8 à 8 x 10 deux UFC par ml (5 x 10 6 à 1 x 10 7 CFU par souris). </li></ol></li><li> Utiliser C. albicans SC5314 comme une souche de référence. Conserver la souche en milieu de glycérol à 40% à -80 ° C. <ol><li> Supplément bouillon de levure-peptone-dextrose avec 0,015% amikacine pour éviter la contamination bactérienne et faciliter davantage compte. </li><li> Ajouter la levure en utilisant 10 &amp;# 181; l inoculation boucle dans YPD-bouillon préparé complété avec l&#39;amikacine O / N à 37 ° C. </li><li> Levure récolte par centrifugation à 2000 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant dans une élimination des déchets de bioharzard appropriée. Blanc pastille adhérente doit être observée dans le fond du tube de culture. </li><li> Laver et suspendre les bactéries en culot à l&#39;aide de 5 ml de PBS et brève vortex. </li><li> Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.3 un deuxième temps d&#39;effectuer un second lavage. </li><li> Reprendre le culot en utilisant 1 ml de PBS et brève vortex. </li><li> Déterminer la taille de l&#39;inoculum en comptant sur un hématocytomètre Mallassez l&#39;aide d&#39;un microscope standard à un grossissement de 40x. REMARQUE: Concentration (en UFC / ml) est obtenue en utilisant la formule suivante: (nombre de levure 5 x 10) / (nombre de rectangles de la grille sur la comptées hématocytomètre Mallassez). </li><li> Vérifier par dilution en série logarithmique à 10 -5 et 10 -6 pour confirmer que solution contenant 2 x 10 6 UFC / ml. </li><li> Plate sur des plaques de gélose YPD additionné de 0,015% de l&#39;amikacine. </li></ol></li></ol> 3. Airways colonisation par C. albicans REMARQUE: après adaptation à l&#39;environnement, les souris sont pesées deux fois par jour. <ol><li> Sous une hotte, dépôt de 500 pi de sévoflurane sur un 4 cm x 4 cm de gaze (technique ouverte-goutte) 14. <ol><li> Immédiatement placer la gaze sur le plancher d&#39;une chambre d&#39;environ 750 ml d&#39;induction. Placer immédiatement une plate-forme de type à maille en relief au-dessus de la gaze pour éviter le contact direct entre l&#39;animal et la gaze. </li><li> Fermer le couvercle étanche à l&#39;air et attendre 1 à 2 minutes pour permettre la diffusion de sévoflurane dans la chambre. </li><li> Transférer la souris de cage en plate-forme et fermer le couvercle de maille. Légère anesthésie avec la respiration spontanée conservé devrait être atteint dans 30 à 45 sec. </li><li> Surveiller les hypotonie en observant la perte du réflexe de redressement à quel point la souris peut être retiré felon la boîte et inculqué. </li></ol></li><li> Instillation intranasale (peut être réalisée en 10 secondes par un opérateur formé). <ol><li> Maintenez la souris d&#39;une seule main nichée sur son dos tenir debout (figure 4B). </li><li> Utilisation de l&#39;index, soutenir la tête et utiliser le pouce pour maintenir la mâchoire fermée pour éviter l&#39;expectoration (figure 4C). </li><li> Comme décrit à l&#39;étape 2.3.8, veiller à ce que le prêt C. albicans solution contient 2 x10 6 UFC par ml pour un volume de 50 ul inculquées. NOTE: Le deuxième point critique est le volume instillé. Un volume inférieur à 50 pi pourraient entraîner une colonisation insuffisante ou l&#39;instillation inhomogène des voies aériennes, un volume plus important peut provoquer la noyade / suffocation et la mort. </li><li> Instiller la souris par voie intranasale en approchant la pipette pour les narines. </li><li> Introduire à la pipette une baisse de 50 ul formant une bulle contenant la solution sur les narines, ensuite inhalé par le spontaneously respiration souris. </li><li> Placez la souris dans une zone de récupération (par exemple, une grande cage nue bien aérée avec une lampe de chauffage frais généraux). Souris doit être surveillé jusqu&#39;à l&#39;éveil complet. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu&#39;il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal et réflexe de redressement. À ce stade, la souris peut être retourné à une cage de logement normal. </li></ol></li></ol> 4. P. pulmonaire aiguë des infections de aeruginosa NOTE: Les souris sont pesées pendant les quatre jours suivants. Normalement, les souris prennent du poids pendant C. la colonisation des voies respiratoires albicans (Figure 2A). <ol><li> Préparer la suspension contenant P. aeruginosa le jour après l&#39;instillation de O / N croissance (section 2.2). </li><li> Anesthésier brièvement utilisant inhalé sévoflurane comme décrit ci-dessus (section 3.1). Remarque: Pour effectuer une infection pulmonaire aiguë, recommandé charge bactérienne sont suggérésTableau 1. </li><li> Instiller la souris comme décrit ci-dessus (section 3.2) avec une attention particulière à la récupération post-instillation. </li></ol> 5. Mesure de l&#39;indice des blessures du poumon <ol><li> Préparer une solution contenant de l&#39;albumine marquée au FITC. Injecter cette solution 2 h avant l&#39;euthanasie de l&#39;animal. <ol><li> Peser 0,2 mg d&#39;albumine-FITC avec l&#39;équipement approprié. </li><li> Ajouter 0,2 mg dans 1 ml de PBS. Brièvement vortex. Si pas utilisé immédiatement, placer la solution dans une feuille d&#39;éviter l&#39;exposition à la lumière ambiante. </li><li> Injecter par voie intraperitoneale de 200 ul de solution d&#39;albumine marquée au FITC pour chaque souris. </li></ol></li><li> Euthanasie <ol><li> Peser la souris pour la dernière donnée de poids. </li><li> Euthanasier un simple clic, conformément à l&#39;usage local des animaux dans les lignes directrices du comité de recherche à l&#39;aide d&#39;une injection intra-péritonéale de une surdose mortelle de pentobarbital: 300 pi de 5,47% pentobarbital. </li><li> Retirer la cage de la souris et reçoit lethal injection par l&#39;opérateur. </li><li> Après l&#39;injection, transférer la souris uniquement à une autre cage, caché de tous les autres animaux. Observez la souris jusqu&#39;à ce que l&#39;absence de mouvement. Confirmer la mort est par l&#39;absence de mouvement, le mouvement particulier respiratoires, manque d&#39;impulsion. </li><li> Effectuer la collecte d&#39;échantillons sur chirurgicale animaux morts, donc sans anesthésiques ni antalgiques. </li></ol></li><li> La collecte de l&#39;échantillon chirurgical: stade de thoracologie. REMARQUE: Pour maintenir des conditions stériles, toute la chirurgie est effectuée en utilisant du matériel stérile dans un environnement de biosécurité de niveau 2. <ol><li> Appliquer l&#39;éthanol à la peau. Effectuer une incision cutanée médiane du sternum à la mi abdomen avec des ciseaux. De la ligne médiane incise le long de la cage thoracique de chaque côté. Rabattre la peau de chaque côté du thorax de visualiser la cage thoracique. </li><li> Effectuer une incision verticale de la cage thoracique de chaque côté en remontant vers les clavicules afin d&#39;être en mesure de se reposer toute la paroi antérieure de la poitrine avec la poupeum permettant la visualisation parfaite du cœur et des poumons (figure 5A, 5B). </li><li> Prélever le sang en utilisant une seringue pré-hépariné par ponction du coeur à côté de l&#39;artère interventriculaire le. Retirer un minimum de 500 pi pour obtenir au moins 100 ul de plasma. Placer l&#39;échantillon de sang sur la glace. </li><li> Effectuez une incision cervicale médiane de visualiser la trachée (figure 5B et 5C). Disséquer soigneusement le fascia autour de la trachée. Placez une suture derrière la trachée (Figure 5C et 5D). Ensuite la suture sera fermé autour de l&#39;aiguille de cannulating pour assurer un lavage adéquat. </li><li> Sonder la trachée en utilisant l&#39;aiguille 20 G modifiée gavage (Figure 5D et 4A). Faire un nœud chirurgicale autour de la trachée canule avec la suture placé précédemment. </li><li> Pour effectuer lavages broncho-alvéolaires (BAL), doucement et progressivement injecter et d&#39;en tirer 500 pi de PBS glacé dans / à partir du poumon. Placez l&#39;échantillon sur iCE pour éviter la lyse cellulaire. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.3.6, 3 fois pour obtenir un total de 1500 échantillons ul BAL de fluides et d&#39;une piscine lavage dans un tube de centrifugeuse de 2 ml (figure 5E). </li><li> Retirez les poumons de la poitrine. Placez un segment du poumon (la taille doit correspondre à la moitié d&#39;un poumon ou d&#39;un lobe) dans 1,5 ml tube de centrifugeuse et stocker rapidement à - 80 ° C. </li><li> Placez un segment du poumon dans un tube à hémolyse pré-pesée contenant PBS pour déterminer la charge bactérienne et le placer sur la glace. </li></ol></li><li> La collecte de l&#39;échantillon chirurgical: stade abdominale. <ol><li> Lancer une autre incision sur le côté gauche de l&#39;abdomen. Observez la rate à travers le péritoine. </li><li> Retirer la rate et le placer dans un deuxième tube à hémolyse contenant 1 ml de PBS et placer sur la glace. </li></ol></li><li> Lung indice de blessures REMARQUE: alvéolo-capillaire perméabilité de la membrane est évaluée en mesurant marqué au FITC-albumine de fuite provenant du compartiment vasculaire au-alvéolaire interstcompartiment initiaux. <ol><li> Centrifugeuse échantillon de sang et de fluide BAL pendant 10 min à 1500 x g. Recueillir les surnageants dans de nouveaux tubes de centrifugation. Les pastilles correspondent aux cellules plasmatiques ou BAL recrutés et devraient être placés sur de la glace. </li><li> Ajouter 100 pi de chaque surnageant de sang (plasma, jaune) ou BAL surnageant dans un plaque à 96 puits transparent (300 ul puits). Placez une feuille sur la plaque si non utilisé immédiatement. </li><li> Mesurer les niveaux de fluorescence dans le plasma et les surnageants BAL en utilisant un lecteur de microplaques à fluorescence (excitation, 487 nm; émission, 520 nm). </li><li> Déterminer l&#39;indice de lésion pulmonaire en calculant le rapport de fluorescence [(BAL surnageant surnageant / sang) x 100]. </li></ol></li><li> Un lavage broncho-alvéolaire (BAL) numération cellulaire différentielle. REMARQUE: Utilisez le culot cellulaire obtenu de la centrifugation du BAL à l&#39;étape 5.5.1. <ol><li> Si nécessaire, utiliser un tampon de lyse des globules rouges. Ajouter 500 ul de tampon de lyse des globules rouges dans le tube de centrifugeuse contenant le cell culot. Brièvement vortex et laisser 10 min sur la glace. Ajouter 500 pi de PBS pour arrêter la lyse des globules rouges. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation pendant 10 min à 1500 x g. Retirer le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS stérile. Énumérer les cellules sur un hématocytomètre Mallassez. L&#39;utilisation d&#39;un Hémacytomètre à compter les cellules. Concentrez-cellules sur une lame avec un cytospin. </li><li> Cellules tache en utilisant le kit de coloration permettant l&#39;identification de la cellule et le nombre (macrophages, les lymphocytes, les neutrophiles). </li></ol></li><li> Charge bactérienne pulmonaire et la diffusion bactérienne NOTE: Pour évaluer la charge pulmonaire bactérienne et la diffusion bactérienne, les poumons et la rate ont été respectivement recueillies et stockées dans des tubes à hémolyse prépesées contenant 1 ml de PBS (étape 5.3.9). <ol><li> Peser des tubes à hémolyse contenant 1 ml de PBS et soit poumon ou de la rate. Homogénéiser les échantillons avec un homogénéisateur de tissu pour obtenir des homogénats de poumon et de rate homogénats. </li><li> Dépôt de 100 pi de l&#39;homo de tissusgenates dans des tubes de centrifugeuse contenant 900 pi de PBS stérile pour obtenir des dilutions logarithmiques série. </li><li> Plaque les deux derniers échantillons dilués appropriés (10 -3 et 10 -2) de chaque BCP-agar pour P. aeruginosa ou de l&#39;agar YPD-amikacine supplémenté pour C. albicans poumon et de la détermination de la charge de la rate. </li><li> Incuber les plaques O / N à 37 ° C. Le lendemain, énumérer les colonies sur des plaques. </li><li> Indice le résultat du poids du poumon pour obtenir un CFU par gramme de poumon. La taille des échantillons pulmonaires ne sont pas les mêmes, les résultats doivent être exprimés en CFU par gramme de poumon. Formule de l&#39;indice est: [CFU] x [poids du tube à hémolyse et poumon] - [poids du tube à hémolyse]. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Modèles animaux, en particulier les mammifères, sont utiles pour élucider les mécanismes complexes d&#39;interaction hôte-pathogène dans les domaines de l&#39;immunité. Bien sûr, le besoin d&#39;information obtenue uniquement à partir des modèles animaux doivent être essentielles; par ailleurs, l&#39;utilisation d&#39;animaux doit être remplacé par des modèles in vitro. Ce modèle animal illustre l&#39;idée qui ne peut être fourni par un modèle animal puisque l&#39;interaction entre les agents pathogènes est méd...

Des modèles animaux, en particulier des souris, ont été largement utilisés pour étudier les réponses immunitaires contre des agents pathogènes. Bien que l&#39;immunité innée et acquise diffèrent entre les rongeurs et les humains 7, la facilité pour la reproduction et le développement des ouvertures pour de nombreux gènes, font souris un excellent modèle pour étudier les réponses immunitaires 8. La réponse immunitaire est complexe et résulte de l&#39;interaction d&#39;un agent pathogène, la flore résidents microbiennes et plusieurs immunitaires (lymphocytes, les neutrophiles, les macrophages) et non-immunitaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales) types cellulaires 2. Des études in vitro ne permet pas l&#39;observation ces interactions complexes et se concentrent principalement sur les interactions uniques cellules pathogènes. Alors que les modèles animaux doivent être utilisés avec prudence et limitées à des questions très précises et pertinentes, des modèles de souris fournissent un bon aperçu de la réponse immunitaire des mammifères in vivo et peuvent porter sur des parties de 7 questions cliniques importantes. 6. Alors que ce qui constitue un microbiome des voies respiratoires &quot;normale&quot; reste à déterminer, les communautés résidentes sont souvent polymicrobiennes, et proviennent de diverses sources écologiques. Les patients atteints de maladie chronique suppurée pulmonaire (fibrose kystique, bronchectasies) ou les patients ventilés mécaniquement présentent une flore particulière en raison de la colonisation des voies aériennes par des microorganismes de l&#39;environnement acquises 9. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes 5, souvent isolé ensemble à partir d&#39;échantillons trachéo , et responsable d&#39;infections opportunistes graves chez ces patients, en particulier dans l&#39;unité de soins intensifs (USI) 4. Isolement de ces micro-organismes lors de la pneumonie aiguë dans les résultats de l&#39;USI dans le traitement anti-microbienne contre P. aeruginosa but levure sont généralement pas considérés pathogène sur ce site 5. interactions in vitro entre P. aeruginosa et C. albicans ont été largement publiées et a montré que ces micro-organismes peuvent affecter la croissance et la survie de l&#39;autre, mais les études ne pouvaient pas conclure si la présence de C. albicans est nuisible ou bénéfique pour l&#39;hôte 10. Des modèles de souris ont été développés pour répondre à cette pertinence de P. aeruginosa et C. albicans in vivo, mais l&#39;interaction entre les microorganismes n&#39;a pas été le point clé. En effet, le modèle a été créé pour évaluer l&#39;implication de C. albicans dans la réponse immunitaire de l&#39;hôte, et le résultat. Un modèle précédent établi par Roux et al déjà utilisé une colonisation initiale avec C. albicans suivie par une infection pulmonaire aiguë induite par P. aeruginosa. Grâce à leur modèle, les auteurs ont trouvé un rôle délétère de prieur C. albicans colonisation des 11. Cependant Roux et al ont utilisé une charge élevée de C. albicans dans leur modèle avec 2 x 10 6 UFC / souris pendant 3 jours consécutifs. Nous avons établi un modèle de 4 jours de C. albicans voies respiratoires colonisation, ou du moins sans la persistance des lésions pulmonaires, Dans ce modèle C. albicans a été récupéré jusqu&#39;à 4 jours après l&#39;instillation d&#39;une seule de 10 5 UFC par souris (figure 2B) 12,13. Après 4 jours, aucune preuve de recrutement de cellules inflammatoires, production de cytokines inflammatoires, ni altération de l&#39;épithélium a été observée. À 24 - 48 h, à la présence de pic de C. albicans, même si une réponse immunitaire innée cellulaire et cytokine a été observée, il n&#39;y avait aucune preuve de lésions pulmonaires. De manière surprenante, les souris ainsi colonisés par C. albicans 48 h avant l&#39;instillation intranasale de P. aeruginosa avait atténué l&#39;infection par rapport à des souris avec P. aeruginosa infection seul. jen fait, les souris exposées lésion pulmonaire moindre et une diminution de la charge bactérienne 12,13. Plusieurs hypothèses pourraient expliquer cet effet bénéfique de la colonisation avant avec C. albicans sur P. aeruginosa médiée infection pulmonaire aiguë. D&#39;abord, une diaphonie interspécifique impliquant chacun des microorganismes des systèmes de détection de quorum, le P. base homoserinelactone- et le système aeruginosa basé farnesol C- système albicans, ont été évalués. Deuxièmement, C. albicans agissant comme une cible &quot;leurre&quot; pour P. aeruginosa détourner l&#39;agent pathogène à partir de cellules épithéliales pulmonaires a été étudiée. Les deux hypothèses ont été invalidés (données non publiées). La troisième hypothèse est celle d&#39;un &quot;amorçage&quot; du système immunitaire inné de C. albicans responsable d&#39;une réponse innée subséquente accrue contre P. aeruginosa. Cette dernière hypothèse a été confirmée. En effet C. albicans colonisation a conduit à un amorçage de l&#39;immunité innée through IL-22, principalement sécrétée par les cellules lymphoïdes innées, ce qui entraîne une augmentation de la clairance bactérienne et réduit les lésions pulmonaires 12. En conclusion, l&#39;hôte est un acteur central dans l&#39;interaction entre les microorganismes modulant la réponse immunitaire innée et impliquant différents types de cellules inflammatoires. Bien que ces interactions immunitaires complexes peuvent être disséqués in vitro les hypothèses de départ ne peuvent être fournis par des mesures appropriées de modèles in vivo. Le protocole suivant fournit un exemple d&#39;étude in vivo de l&#39;agent pathogène interaction hôte-médiation qui peut être adapté à d&#39;autres micro-organismes.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>Flacon plastique de 250 ml</td></tr><tr><td>Lecteur de fluorescence Mithras&nbsp ; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>référence dans la première colonne</td><td>aucun commentaire</td></tr><tr><td>Bromo-crésol gélose pourpre</td><td>Biomérieux</td><td>43021</td><td>20x par unité</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47 %</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>Flacon plastique 100 ml</td></tr><tr><td>Valve 2 têtes&nbsp ;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation stérile 10 &micro ; l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 conditionnement</td></tr><tr><td>Seringues Insuline 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>pour 100 conditionnement</td></tr><tr><td>2 positions Tube de culture 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&nbsp ;</td><td>General Electric sciences de la vie</td><td>80-2116-30</td><td>aucun commentaire Tubes d’hémolyse</td></tr><tr><td>13 x 75 mm&nbsp ;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>par 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life</td><td>technologies 10010023</td><td>emballé dans 500 ml</td></tr><tr><td>d’amikacine 1 g</td> de <td>Mylan</td><td>62516778</td><td>par 10&nbsp ;</td></tr><tr><td>Héparine 10 000 UI dans 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x par unité</td></tr><tr><td>Kit de coloration RAL 555</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons de 100 mL</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparent 300 & micro ; l Plaque 96 puits</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>aucun commentaire</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Bouillon</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>en poudre</td></tr><tr><td>FITC-albumine</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>en poudre</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>en poudre</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 25</td><td>Terumo ou unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditionnement</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>aucun commentaire</td></tr></tbody></table>

etudier communautés microbiennes<em&gt; in vivo</em&gt;: un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire entre<em&gt; candida albicans</em&gt; et<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; dans les airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Étude de l&#39;interaction hôte-pathogène nous permet de comprendre les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité lors d&#39;une infection microbienne. Le pronostic de l&#39;hôte dépend de l&#39;implication d&#39;une réponse immunitaire adaptée contre l&#39;agent pathogène 1. Réponse immunitaire est complexe et les résultats de l&#39;interaction des pathogènes et plusieurs types cellulaires immunitaires ou non immuns 2. Des études in vitro ne peuvent pas caractériser ces interactions et de se concentrer sur les interactions cellulaires-pathogène. En outre, dans les voies respiratoires 3, en particulier chez les patients atteints de maladie pulmonaire chronique purulente ou chez les patients ventilés mécaniquement, communautés polymicrobiennes sont présents et compliquent l&#39;interaction hôte-pathogène. Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans sont à la fois problème pathogènes 4, fréquemment isolés à partir d&#39;échantillons trachéo-bronchique, et associée à des infections graves, en particulier en unité de soins intensifs 5. Microbiens ont interactionsété signalés entre ces agents pathogènes in vitro, mais l&#39;impact clinique de ces interactions reste incertaine 6. Pour étudier les interactions entre C. Albicans et P. aeruginosa, un modèle murin de C. albicans colonisation des voies respiratoires, suivi d&#39;un P. infection pulmonaire aiguë aeruginosa- médiation a été effectuée.

Comme vu précédemment lors de la description de protocole, l&#39;expérience a besoin de 5 jours pour compléter (Figure 1: expérience timeline). Un opérateur est sollicité pendant la course entière de l&#39;expérience et peut gérer les processus jusqu&#39;à un maximum de 10 souris. Si plus d&#39;animaux sont tenus, deux personnes sont nécessaires notamment pour la collecte de l&#39;échantillon chirurgicale. En effet tous les échantillons doivent être prélevés en moins de 2 heures pour éviter une fuite de...

Alors que l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène permet de caractériser des réponses immunitaires spécifiques, des modèles in vivo sont nécessaires pour observer les effets de réponses complexes. En utilisant l’exposition à Candida albicans suivie d’une infection pulmonaire médiée par Pseudomonas aeruginosa, nous avons établi un modèle murin des interactions microbiennes impliquées dans la pathogénicité de la pneumonie associée à la ventilation assistée.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

L'objectif général de cette procédure est de construire un modèle permettant d'étudier les interactions entre une bactérie individuelle et un champignon unique. Ce message peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions entre pathogènes, telles que les facteurs impliqués dans la communication croisée et le dialecte interspécifique. Le principal avantage de cette technique est que les données générées par ce modèle in vivo présentent une pertinence clinique.Pour administrer par voie intranasale le champignon, diluez d'abord deux fois dix puissance six UFC de C.albicans par millilitre dans du PBS stérile. Ensuite, après avoir confirmé la perte du réflexe d'orientation chez une souris adulte hypotonique, aspirez au moins 50 microlitres de la suspension fongique dans une pipette de 200 microlitres. Saisissez ensuite la souris avec une main et retournez l'animal afin qu'il soit allongé sur le dos, avec son abdomen dirigé vers le haut.Lorsque la souris est en position, utilisez l'index de la main qui tient la souris pour soutenir la tête, et le pouce pour maintenir la mâchoire fermée, puis approchez la pointe de la pipette près du nez de l'animal. Ensuite, délivrez soigneusement une goutte de 50 microlitres de champignon sur les narines, en permettant à la goutte d'être inhalée par la respiration spontanée de la souris. Placez ensuite la souris seule dans une cage jusqu'à ce qu'elle soit complètement remise.Quatre jours après l'installation de C.albicans, raser l'abdomen de l'animal euthanasié, puis stériliser la peau exposée à l'éthanol. Ensuite, utiliser des ciseaux pour ouvrir la peau du sternum jusqu'au milieu de l'abdomen. Puis, prolonger l'incision le long de la cage thoracique de chaque côté de la ligne médiane et rabattre la peau de chaque côté du thorax.Lorsque la cage thoracique est visible, effectuez une incision verticale de chaque côté de la poitrine en direction des clavicules, puis utilisez le sternum pour rabattre toute la paroi thoracique antérieure afin de visualiser le cœur et les poumons. Ensuite, à l’aide d’une seringue pré-héparinisée, percez le cœur à proximité de l’artère intraventriculaire et prélèvez un minimum de 500 microlitres de sang. Placez l’échantillon de sang sur de la glace.Ensuite, réalisez une incision cervicale médiane afin de mettre la trachée à nu. Disséquez soigneusement le fascia entourant la trachée, puis placez un point de suture sous la trachée. Utilisez ensuite une aiguille de gavage modifiée de calibre 20 pour cathétériser la trachée, en fixant la canule à l’aide du point de suture préalablement mis en place.Pour réaliser une lavage bronchoalvéolaire, délivrer délicatement 500 microlitres de PBS glacé dans le poumon. Ensuite, aspirer le liquide de lavage et transférer le liquide dans un tube de centrifugation de deux millilitres placé sur de la glace. Après avoir collecté deux autres échantillons de 500 microlitres, retirer les poumons de la cavité thoracique et placer un fragment de poumon dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre pour un stockage immédiat à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, placer un autre morceau de tissu pulmonaire dans un tube d'hémolyse préalablement pesé contenant du PBS sur de la glace. Enfin, pratiquer une incision du côté gauche de l'abdomen. Prélever la rate dans un deuxième tube d'hémolyse contenant un millilitre de PBS et placer le tube sur de la glace.Un modèle de persistance sur quatre jours est obtenu par instillation intranasale de cinq fois dix à la puissance cinq UFC de C.albicans par souris. Au cours de ces quatre jours, les souris prennent du poids, mais ne présentent pas de lésion pulmonaire. Toutefois, lorsque le nombre d'UFC de l'inoculum augmente, la lésion pulmonaire augmente également.Avec des lésions pulmonaires maximales observées entre 24 et 36 heures après l'infection. La charge bactérienne, en revanche, montre une diminution d'un logarithme d'unités formant colonies par millilitre toutes les 24 heures, avec une augmentation cumulative de la dissémination bactérienne observée chaque jour. Dans le lavage bronchoalvéolaire prélevé chez les souris infectées, les neutrophiles sont largement recrutés, le comptage différentiel des cellules révélant une population de cellules immunitaires infiltrantes composée à 90 pour cent de neutrophiles et à 10 pour cent de macrophages et de lymphocytes.Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'analyse du lavage bronchoalvéolaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la caractérisation de la réponse inflammatoire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place une colonisation par Pseudomonas. N'oubliez pas que le travail avec des souches luminescentes de Candida peut présenter un danger extrême, et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection pour éviter la contamination par gouttelettes, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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