Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

L’objectif global de cette technique d’imagerie et d’analyse est d’isoler des informations spécifiques d’un signal complexe. Plus précisément, ce protocole décrit comment visualiser et quantifier les mitochondries spécifiques aux nerfs avec d’autres mitochondries dans l’épiderme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurologie, telles que comment les mitochondries des fibres nerveuses intraépidermiques des individus en bonne santé se comparent-elles aux mitochondries spécifiques aux nerfs des patients présentant des complications neurologiques.

Le principal avantage de cette technique est que nous prenons un signal complexe et en extrayons des informations spécifiques. Ce protocole nous aide à isoler un signal spécifique, tel que le signal de ces pailles, des signaux qui les entourent. Préparez-vous à la coloration par immunohistochimie par fluorescence des biopsies cutanées en marquant d’abord une plaque de 96 puits selon ce schéma.

Ensuite, pipetez 150 microlitres de solution d’amplification du signal de base pour réduire la liaison non spécifique des anticorps secondaires dans chaque puits de la rangée supérieure. Préparez les puits de rinçage en ajoutant 150 microlitres de solution saline tamponnée 1x phosphate dans chaque puits des rangées deux et trois de la plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite 150 microlitres de solution de blocage à 5 % BSA dans les puits de la quatrième rangée.

Diluez les anticorps primaires PGP9.5 et PDH dans 1 500 microlitres de solution de rinçage BSA à 1 % et ajoutez 150 microlitres dans chaque puits de la cinquième rangée. À l’aide d’une boucle d’inoculation, transférez les sections dans la solution d’amplification du signal de la première rangée. Une fois que les sections sont dans la solution d’anticorps primaire de la cinquième rangée, enveloppez hermétiquement la plaque d’un film de laboratoire pour éviter l’évaporation, puis agitez les échantillons sur une bascule plate à température ambiante pendant une heure.

Incuber avec bercement pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Commencez le deuxième jour de la procédure en pipetant 150 microlitres de solution de rinçage BSA à 1 % dans les puits des rangées six, sept et huit de la plaque à 96 puits. Ajoutez les anticorps secondaires conjugués au fluorophore à 1 500 microlitres de BSA à 1 %.

Ensuite, pipetez 150 microlitres de la solution secondaire d’anticorps dans chaque puits de la neuvième rangée. Rincez les sections en passant par les puits six, sept et huit. Une fois que les sections sont dans la solution d’anticorps secondaire de la neuvième rangée, enveloppez la plaque dans du parafilm et couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour protéger les signaux de fluorescence.

Incuber avec le balancement comme précédemment. Le troisième jour, pipetez 150 microlitres de PBS filtré stérile dans les rangées 10, 11 et 12. Transférez les échantillons dans la rangée 10 puis recouvrez la plaque de papier d’aluminium.

Rincer pendant une heure à température ambiante avec bascule. Ensuite, préparez une lame de microscope pour le montage des sections en pipetant 50 microlitres de PBS filtré 1x sur la lame. Une fois les rinçages terminés, transférez une section de la rangée 12 sur la lame, puis ajoutez une à deux gouttes de réactif de montage contenant du DAPI directement sur le dessus de la section.

Placez délicatement une lamelle en verre de microscope de 50 millimètres sur 24 millimètres de 1,5 sur la section. Placez les lames dans l’obscurité pendant la nuit à température ambiante pour durcir le support de montage avant de les stocker ou de les imager. Sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 40X sur un microscope confocal à balayage laser inversé.

Sélectionnez les lasers et les détecteurs appropriés pour imager les noyaux, les fibres nerveuses et les mitochondries. Entrez les paramètres de balayage suivants dans le logiciel du microscope : résolution d’intensité de 12 bits, vitesse de balayage de 500 Hertz avec moyenne de deux images et zoom de 2,2. Réglez le logiciel du microscope pour une résolution latérale optimisée en sélectionnant une résolution de balayage de 1024 par 1024.

Optimisez la résolution axiale et le sectionnement optique en sélectionnant une ouverture confocale d’une unité d’air avec une taille de pas Z de 210 nanomètres. Scannez chaque signal séparément et ajustez la tension et le décalage du détecteur pour supprimer les pixels saturés ou sous-saturés. Activez un balayage en direct du signal nerveux et ajustez la commande de mise au point Z pour trouver et régler les plans focaux supérieur et inférieur dans le logiciel du microscope qui englobent le signal nerveux dans la section de tissu.

Scannez la série Z finale avec un balayage séquentiel pour éliminer la diaphonie du signal de fluorescence. Isolez l’épiderme de la couche cornée et du derme en dessinant une région autour de l’épiderme à l’aide d’un outil de sélection sur une image dupliquée de l’image originale. Recadrez ensuite l’image à la sélection.

Calculez les fonctions d’étalement des points pour les signaux confocaux de fluorescence vert et rouge à l’aide de la fonction de calcul de la fonction d’étalement. Réglez ensuite les paramètres de l’indice de réfraction moyen pour l’huile à 1,515 et l’ouverture numérique pour l’objectif d’huile 40X à 1,25. Réglez le sténopé du détecteur sur une unité d’air et choisissez une longueur d’onde d’excitation laser.

Utilisez une restauration itérative réglée à 100 % de confiance, une limite d’itération de 10 cycles et les PSF vertes et rouges pour la déconvulation des signaux de fluorescence verts et rouges. Utilisez l’outil de création de surface pour créer une surface autour des signaux nerveux déconvolutés en sélectionnant décocher la fonction lisse, l’intensité absolue pour le seuillage, un seuil inférieur de 3 000 et un seuil supérieur de 65 535. Gardez les surfaces au-dessus de 10 voxels.

Supprimez les surfaces non nerveuses à l’aide de l’onglet d’édition de la surface nerveuse pour sélectionner des surfaces non nerveuses uniques ou maintenez la touche Ctrl enfoncée pour sélectionner plusieurs surfaces non nerveuses. Supprimez les surfaces non nerveuses sélectionnées en appuyant sur le bouton Supprimer. Utilisez l’onglet d’édition de la surface nerveuse et appuyez sur le bouton masque tout dans les propriétés du masque.

Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez le canal cinq mitochondries déconvoluées sous la sélection du canal, puis vérifiez le canal dupliqué avant d’appliquer le masque. Appuyez sur le bouton radio pour une constante intérieur/extérieur et vérifiez que la surface extérieure des voxels est réglée sur 0,0 et appuyez sur le bouton OK. Enfin, créez des surfaces spécifiques aux mitochondries à l’aide de l’outil de création de surface pour créer une surface autour des signaux mitochondriaux déconvolués masqués en sélectionnant décocher la fonction lisse et en utilisant la soustraction d’arrière-plan pour le seuillage.

Réglez le diamètre de la plus grande sphère à 1,50 micromètre, le seuil inférieur à 2 000 et le seuil supérieur à 65 535 au maximum. Assurez-vous de garder les surfaces au-dessus de 1,0 voxels. Cette image représentative de la microscopie confocale 3D illustre le signal de fluorescence verte spécifique au nerf.

Une surface 3D représentée en cyan est créée pour le signal nerveux. Ensuite, le signal mitochondrial spécifique au nerf est isolé du reste des signaux mitochondriaux épidermiques en utilisant la surface nerveuse comme outil de masquage. Le signal de fluorescence rouge mitochondriale spécifique au nerf qui en résulte est utilisé pour créer des surfaces représentées par du magenta autour des mitochondries à l’intérieur de la surface du nerf, qui est représentée en cyan.

Cela permet de voir en détail les mitochondries des fibres nerveuses. Ici, les données de surface mitochondriale sont présentées sous forme d’histogramme de fréquence de taille pour visualiser le pourcentage de mitochondries présentes dans chacune des différentes courbures en fonction de leur volume. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prendre soin du tissu pendant le processus de coloration pour s’assurer que le tissu est entièrement immergé dans les solutions pour fournir une coloration uniforme et cohérente sur toutes les sections.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser et de quantifier les mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques humaines. Notre protocole détaillé a été conçu pour enseigner à d’autres chercheurs comment colorer, imager, traiter et analyser des biopsies de peau humaine dans le but de comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse des maladies neurologiques mitochondriales telles que la neuropathie.