Name: Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Découvrez l'imagerie 3D pour visualiser et quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques dans les fibres nerveuses intra-épidermiques humaines. Cette méthode d'immunohistochimie fluorescente isole les signaux mitochondriaux complexes pour étudier les maladies neurologiques.

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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions K08 NS061039-01A2, le programme de recherche de neurologie &#38; découverte et l’a. Alfred Taubman Medical Research Institute à l’Université du Michigan. Ce travail a utilisé la morphologie et l’Image analyse Core du Michigan Diabetes Research Center, financé par les instituts nationaux de santé subvention 5P 90 DK-20572 du National Institute of Diabetes et digestives et les maladies des reins. Les auteurs tiens à remercier J. Robinson Singleton et A. Gordon Smith (Université de l’Utah) pour leur généreux don d’échantillons de peau humaine.

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Aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ce protocole est conçu pour isoler, de quantifier et d’analyser la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques au sein de la IENFs en 3D de biopsies de la peau humaine. Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. L’immunohistochimie de fluorescence flottant est conçu pour souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette procédure p...

Mitochondries remplissent des fonctions cellulaires vitales qui comprennent la production d’énergie cellulaire, mise en mémoire tampon de calcium et réglementer nécrotiques et apoptose cellulaire mort1,2,3. Le système nerveux a un métabolisme élevé par rapport au corps4 suggérant que les neurones génèrent un degré élevé d’énergie cellulaire sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le biais de la respiration mitochondriale. Un grand nombre de documents de preuve que les fonctions neuronales dépendent de l’ATP5, surtout dans les synapses6. Par conséquent, la répartition des mitochondries dans les neurones est importante.
Au cours des 10 dernières années, que beaucoup d’information a montré que le trafic et l’accostage des mitochondries neuronales est très réglementées. Protéines motrices sont impliqués dans la distribution des mitochondries à compartiments cellulaires spécifiques tout au long du neurone. Traite des mitochondries est particulièrement importante parce que les neurones du projet les axones et les dendrites loin de soma. Les protéines motrices kinésine directement essentiellement antérograde (à l’opposé le soma) traite des mitochondries le long des microtubules pendant la dynéine protéines motrices direct motilité rétrograde (vers le soma)7,8,9 , 10. il sont a des signaux cellulaires un tel potentiel de membrane mitochondrial et la conduction d’impulsion qui influent sur la présence et la direction de mitochondrial trafic11,12,13.
En plus de transporter les mitochondries, il y a des protéines spécialisées à localiser les mitochondries pour les compartiments cellulaires spécifiques qui ont des exigences de haute énergie, tels que les nœuds de Ranvier et synapses8,14, 17. en effet, la majorité des mitochondries dans les axones sont non motiles9,13,18. Les protéines spécialisées comme mitochondries ancre syntaphilin aux microtubules le long des axones tandis que les autres protéines d’ancrage mitochondries à l’actine cytosquelette19–21. Facteurs de croissance et d’ions tels que le calcium ont été signalées à l’appui de la cessation du mouvement des mitochondries afin de les localiser dans des régions où ils sont nécessaires21,22,23.
Pris ensemble, le trafic et d’amarrage des mitochondries sont vitales pour le bon fonctionnement des neurones. À l’appui de cela, perturbation dans le trafic mitochondriale a été associée liée plusieurs maladies neurologiques dont la maladie d’Alzheimer, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth, maladie de Huntington, spastique héréditaire paraparésie et atrophie optique15,24,25,26,27. Des études récentes ont mis l’accent sur le dysfonctionnement mitochondrial et la pathologie comme un mécanisme potentiel pour la neuropathie diabétique, la perte sensorielle associée diabète28,29,30,31 ,32,,33. L’hypothèse est que le diabète altère la distribution des mitochondries dans les projections sensorielles de terminaison nerveuse cutanée. Par conséquent, il a développé une technique pour visualiser et quantifier les mitochondries dans les fibres de nerf intra-épidermiques (IENFs), l’extrémité distale de la racine dorsale ganglion afférences sensorielles. La technique combine immunohistochimie de fluorescence spécifique mitochondriale et étiquettes de fibres nerveuses avec acquisition de série z microscopie confocale de signaux avec logiciel d’analyse d’image 3D puissant pour mesurer la distribution du nerf spécifiques mitochondries des biopsies punch cutanée humaine pour atteindre cet objectif.

<table><tbody><tr><td>2 % Zamboni’s Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&nbsp ;</td><td>1459A</td><td>2 % de paraformaldéhyde, 0,2 % d’acide picrique saturé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td></tr><tr><td>10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>Pour constituer 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td><td>améliore les signaux de colorant Alexa Fluor en réduisant la liaison non spécifique</td></tr><tr><td>Produit génique anti-protéine 9.5 Anticorps (polyclonal de lapin)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>abrégé en PGP9.5, remplace AbD Serotec (Cat. N° 7863-0504) anticorps</td></tr><tr><td>anti-pyruvate déshydrogénase E2/E3bp Anticorps (monoclonal de souris)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>abrégé en PDH</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris Anticorps secondaire Alexa Fluor 594 conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>rouge fluorescent conjugué secondaireanticorps</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin Anticorps secondaire Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>Albumine secondaire conjuguée verte-fluorescente</td></tr> à <tr><td>partir de sérum bovin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>abrégée en BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>abrégée en TX-100</td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Filtre</td><td>EMD Millipore, Billerica MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 &micro ; m Filtre Millipore</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Boucle non calibrée</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>inoculation Loop par Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>Plaque de dosage à 96 puits</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>Coloration DAPI des noyaux</td></tr><tr><td>Couvercle de microscope Verre 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Lames de</td></tr><tr><td>microscope Superfrost Plus Fisher</td><td>Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15</td><td>Lames de microscope</td></tr><tr><td>Leica SP5 Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>Volocity x64 Logiciel&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer, Waltham , MA</td><td>version 4.4.0</td><td>Le logiciel Volocity est utilisé pour les étapes 3.1 et 3.2 dans le protocole de traitement d’image</td></tr><tr><td>Imaris x64 Logiciel d’analyse tridimensionnelle</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>version 7.7.1</td><td>Le logiciel Imaris est utilisé pour les étapes 3.3 à 3.5 dans le protocole d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>version Office 2013</td><td>Un tableur Excel est utilisé pour l’étape 3.6 du protocole afin de résumer les caractéristiques morphométriques</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature Compound</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>abrégé en OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat pour la coupe 50 &micro ; Sections m</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondries-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>Utilisé comme contrôle positif pour marquer les mitochondries avec un signal fluorescent vert</td></tr></tbody></table>

imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Le but du présent protocole est d’étudier les mitochondries dans les fibres nerveuses intra-épidermiques. Par conséquent, des techniques d’imagerie et d’analyse 3D ont été développés pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques et évaluer les altérations induites par la maladie des mitochondries dans l’extrémité distale des nerfs sensitifs. Le protocole associe immunohistochimie de fluorescence, microscopie confocale et techniques d’analyse des images 3D de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Paramètres détaillés sont définies dans les procédures afin de fournir un exemple concret d’utilisation de ces techniques pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques. Anticorps ont été utilisés pour étiqueter le nerf et signaux mitochondriales dans des sections de tissu de peau punch biopsies, qui a été suivie par immunofluorescence indirecte pour visualiser les nerfs et les mitochondries avec un signal fluorescent vert et rouge respectivement. Z-série images ont été acquises avec la microscopie confocale et logiciel d’analyse 3D a été utilisé pour traiter et analyser les signaux. Il n’est pas nécessaire de suivre les paramètres décrits dans, mais il est important d’être cohérent avec ceux choisis tout au long de la coloration, les étapes d’acquisition et d’analyse. La force de ce protocole est qu’il est applicable à une grande variété de circonstances où un signal fluorescent est utilisé pour isoler les autres signaux qui serait autrement impossibles à étudier seul.

Visualisation et la quantification des mitochondries dans les IENFs humaines
Fluorescence immunohistochimie permet l’étiquetage simultanée de signaux multiples dans les biopsies de la peau humaine pour visualiser les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Une plaque à 96 puits constitue un moyen pratique d’organiser les étapes de la procédure de l’immunohistochimie. La figure 1 mon...

Ce protocole utilise des techniques d’imagerie et d’analyse en trois dimensions (3D) de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Les techniques sont applicables à d’autres situations où un signal fluorescent est utilisé pour isoler un sous-ensemble des données d’un autre signal fluorescent.

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

L'objectif général de cette technique d'imagerie et d'analyse est d'isoler des informations spécifiques à partir d'un signal complexe. Plus précisément, ce protocole décrit comment visualiser et quantifier les mitochondries spécifiques aux nerfs par rapport aux autres mitochondries présentes dans l'épiderme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurologie, comme par exemple comment les mitochondries présentes dans les fibres nerveuses intraépidermiques d'individus sains se comparent aux mitochondries spécifiques aux nerfs chez des patients souffrant de complications neurologiques.Le principal avantage de cette technique est que nous prenons un signal complexe et en extrayons des informations spécifiques. Ce protocole nous aide à isoler un signal particulier, comme le signal provenant de ces pailles, parmi les signaux environnants. Préparez la coloration en immunohistochimie en fluorescence de biopsies cutanées en étiquetant d'abord une plaque de 96 puits selon ce schéma.Ensuite, pipeter 150 microlitres de solution mère d'amplificateur de signal pour réduire la liaison non spécifique des anticorps secondaires dans chaque puits de la première

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Neurosciences

Source : Hamid, H. S.,  et al. Imagerie et analyse tridimensionnelles des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques humaines. J. Vis. exp. (2017) Cette vidéo montre la méthode de visualisation des mitochondries spécifiques aux nerfs à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle. Il décrit le processus d’acquisition de scans séquentiels de fibres nerveuses intraépidermiques pré-marquées et de génération d’images de surface 3D pour isoler et afficher les mitochondries en relation avec...

Visualisation des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques

Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

L&#39;imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

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Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d&#39;imagerie par fluorescence

La visualisation et l’analyse mitochondriales à partir de tissus cérébraux de mammifères constituent une tâche difficile. Ici, nous décrivons comment l’analyse de reconstruction tridimensionnelle (3D) de la microscopie électronique à balayage en série (SBFSEM) peut être utilisée pour mieux comprendre l’analyse morphologique et volumétrique de cet organite générateur d’énergie critique.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Cette étude présente une approche in vivo d’imagerie à deux photons pour visualiser les structures des terminaisons axoniques des mécanorécepteurs (LTMR) à faible seuil dans la peau des pattes avant des souris. Utilisant des images répétées et haute résolution d’axones individuels, cette méthode offre une nouvelle plateforme pour étudier la structure et la fonction du circuit sensoriel cutané pendant le développement et chez l’adulte.

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Injections locales d’une cellule de Schwann terminale marquante mitochondriale in vivo pour microscopie confocale. Cette méthode utilise des preuves de concept démontrées dans le tissu musculaire squelettique de souris avec un muscle sain ou malade pour fournir une visualisation mitochondriale à haute résolution.

Méthodes pour la quantification in situ de la morphologie mitochondriale dans les cellules musculaires et terminales de Schwann de souris

Découvrez l'imagerie 3D pour visualiser et quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques dans les fibres nerveuses intra-épidermiques humaines. Cette méthode d'immunohistochimie fluorescente isole les signaux mitochondriaux complexes pour étudier les maladies neurologiques.

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

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