Name: Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Découvrez l'analyse de la morphologie mitochondriale dans le cerveau de souris par microscopie électronique à balayage par bloc sériel. Cette technique automatisée permet la reconstruction 3D des structures mitochondriales.

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Nous remercions Sidney Walker de nous avoir fourni une aide technique. Ces travaux ont été financés en partie par une subvention de l’Institut national de la santé (1R01EY024712-01A1).

Déclaration d&#39;éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) à Virginia Tech. Attention: les précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation et de l&#39;élimination de plusieurs composants utilisés dans ce protocole. Avant utilisation, la section locale des directives institutionnelles et pratiques de santé et de sécurité doivent être établies et suivies, en particulier pour le tétroxyde d&#39;osmium, qui est volatile et extrêmement toxique, l&#39;acétate d&#39;uranyle, qui est à la fois un métal lourd et source de radioactivité, et le nitrate de plomb, ce qui est un poison de métal lourd. Thiocarbohydrazide (TCH) peut se décomposer pour produire des gaz explosifs et toxiques, si mal géré. De nombreux établissements seront dotés d&#39;une installation de base EM dans lequel ces réactifs sont couramment utilisés et peuvent fournir de l&#39;aide. 1. Préparation du tissu cérébral et SBFSEM Imaging <ol><li> Anesthetize un jeune (~ 2 - 4 mois) C57 souris noire (C57BL / 6J de souche) en utilisant le 4 - 5% isoflurane suivant les directives institutionnelles. Confirmer anesthetization en surveillant la perte de tonus musculaire, le manque de mouvements volontaires et les réponses aux stimuli aversifs comme un pincement de la queue. </li><li> Pin de la souris sur un plateau de dissection et faire une incision sur la peau sur la ligne médiane ventrale. Faire d&#39;autres incisions dans la peau pour exposer la cage thoracique de la souris. Inciser le diaphragme, et soigneusement disséquer la cavité thoracique le long de la périphérie pour exposer le cœur battant, puis faire une incision sur l&#39;oreillette droite. </li><li> En utilisant une canule de papillon, cathétériser le ventricule gauche. Perfuser la souris à l&#39;aide transcardiaque 10 - 20 ml de solution saline de tampon phosphate (PBS), pH 7,2, jusqu&#39;à ce que l&#39;exsanguination est confirmé par une modification de la couleur du foie. Remarque: Une modification de la couleur du foie est utilisé comme un guide pour déterminer l&#39;étendue de l&#39;exsanguination. Assurez-vous que la couleur du foie passe de brun rougeâtre à rose pâle. </li><li> Perfuser la souris à l&#39;aide transcardiaque 10 - 20 ml de 2% glutaraldéhyde et 4% de paraformaldehyde faite 0,10 M de tampon cacodylate (pH 7,2), pour fixer le tissu cérébral rapidement à partir de l&#39;intérieur. La fixation est contrôlée en observant la queue de raidissement. Note: Préparer le tampon cacodylate 0,10 M (pH 7,2) en dissolvant 2,14 g de cacodylate de sodium dans 80 ml d&#39;eau, ajouter de l&#39;acide chlorhydrique pour ajuster le pH, et de porter le volume à 100 ml avec de l&#39;eau. </li><li> À la suite de la perfusion, décapitent la souris, disséquer le cerveau, suivie par la fixation dans 0,10 M de tampon cacodylate de sodium (pH 7,2) contenant 2% de glutaraldéhyde et de 4% de paraformaldehyde pendant 48 h à 4 ° C </li><li> Après 48 h faire 400 um coupes coronales en utilisant un vibratome puis disséquer soigneusement la région d&#39;intérêt dans le cerveau (par exemple, l&#39;hippocampe) sous le microscope de dissection 42. couper délicatement le tissu et prendre une photo pour préserver l&#39;orientation. Remarque: Déposer les méthodes de coloration des tissus dans SBFSEM de traitement combine une variété de méthodes de coloration de métaux lourds dansafin d&#39;améliorer la résolution et sont basées sur la méthode développée précédemment par Deerinck et al 40. </li><li> Laver les tissus fixées au glutaraldéhyde 3 fois, 5 minutes à chaque fois dans 0,1 M de tampon cacodylate (pH 7,2). </li><li> Préparer une solution d&#39;acide tannique à 0,1% par dissolution de l&#39;acide tannique dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (pH 7,2). Agiter jusqu&#39;à dissolution et filtrer à travers 0,45 um filtre, si nécessaire. </li><li> Postfix les tissus avec cacodylate tamponnée 0,1% d&#39;acide tannique par incubation dans 1 ml de réactif pour 30 - 60 min à température ambiante. Remarque: Le temps d&#39;incubation dépend de la taille des tissus, mais 30 min qui fonctionne le mieux pour la plupart des tissus. </li><li> Laver les tissus 3 fois, 5 minutes à chaque fois dans un tampon de cacodylate (pH 7,2). </li><li> Dissoudre 0,3 g de ferrocyanure de potassium et 0,86 g de cacodylate de sodium dans 10 ml d&#39;eau distillée H 2 O (dh 2 O). Conserver la solution de ferrocyanure de potassium sur la glace. Juste avant utilisation, ajouter 10 ml de 4% de tétroxyde d&#39; osmium (OSO 4). </li><li> Colorer les tissus avec 2% ossolution mium-ferrocyanure pendant 90 min, sur la glace. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O. </li><li> Préparer 1% thiocarbohydrazide (TCH) solution en dissolvant 0,1 g TCH dans 10 ml dH 2 O. Dissoudre à 60 ° C, en agitant toutes les 10 minutes jusqu&#39;à dissolution complète. Respecter les consignes de sécurité lors de la manipulation TCH, en particulier prendre soin d&#39;éviter l&#39;utilisation de métaux, chauffage à haute température, ou de permettre à une solution à sécher. </li><li> Traiter les échantillons fraîchement préparés avec 1% TCH pendant 20 min à température ambiante. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O. </li><li> Diluer 4% OsO 4 à 2% avec dH2Û, les tissus de teinture aqueux à 2% avec du tétroxyde d&#39; osmium en incubant pendant 1 h. Laver les tissus 3 fois, 5 min chacun avec dH 2 O. </li><li> Incuber les échantillons O / N à 1% d&#39; acétate d&#39;uranyle dans dH 2 O à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution de aspartate avance de Walton (comme décrit par Deerinck et al 40). <ol><li> Dissoudre 0,998 g L-aspartate dans dH 2 O de 250puis ajouter 10 l&#39;hydroxyde de potassium (KOH) d&#39;une manière goutte à goutte jusqu&#39;à ce que le pH atteigne 5,5. Après ajustement du pH, ajouter 0,066 g de nitrate de plomb dans 10 ml aspartique stocks d&#39;acide et de la chaleur à 60 ° C pendant 30 min. </li></ol></li><li> Rincer les tissus dans dH2Û et laisser incuber avec du plomb tache aspartate Walton pendant 30 min dans un four à 60 °. Laver 3 fois, 5 min chacune dans dH 2 O. </li><li> Déshydrater les échantillons à travers une série graduée de l&#39;alcool en utilisant des solutions congelées de 20%, 50%, 75%, 85% et 95% d&#39;éthanol pendant 5 minutes à chaque fois, suivi de 100% d&#39;éthanol, 3 fois 10 minutes à chaque fois. Remarque: Utilisez éthanol à 100% de la bouteille fraîchement ouvert, que l&#39;éthanol ouvert absorbe l&#39;eau de l&#39;air et provoquer l&#39;intégration à l&#39;échec. incubations plus longues seront nécessaires avec des échantillons de tissus plus grands. </li><li> échantillons Laver 2 fois, 15 min chacun dans de l&#39;oxyde de propylène. </li><li> Faire résine plastique d&#39;enrobage en utilisant 25 ml de résine, 10,5 ml DDSA (anhydride dodécénylsuccinique), 15,5 ml NMA (Anhydride méthyl nadique) et 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris diméthylaminométhyl phénol). Mélanger la résine par agitation. Spin et laisser la résine reposer jusqu&#39;à ce que des bulles détermination. Note: Ceci est la recette de dureté moyenne standard. D&#39;autres types de microscopie (EM) en résine plastique d&#39;électrons peuvent être utilisés, mais ils doivent être testés avec un échantillon témoin non essentiel à l&#39;avance pas toutes les résines de travail pour SBFSEM. </li><li> Incuber les tissus O / N dans un 50 50 mélange de résine et de propylène oxyde d&#39;enrobage, dans un flacon qui est coiffé d&#39;abord, puis, après 2 h non écrêtée de sorte que l&#39;oxyde de propylène évapore pendant la période d&#39;environ 8 à 10 heures. </li><li> Transférer les tissus à 100% de résine d&#39;enrobage frais dans des flacons propres pendant 2 heures. </li><li> échantillons Intégrer en résine d&#39;enrobage frais, dans des moules plats contenant imprimées des étiquettes en papier, et soignez-les dans un four à 60 ° C pendant 48 heures. Après environ 1 heure, vérifier le placement des tissus et de l&#39;alignement à nouveau, et ajuster si nécessaire. </li><li> Couper des échantillons vers la zone d&#39;intérêt et de montage sur une broche d&#39;aluminium en utilisant Gelling cyanoacrylate de colle ou d&#39;une résine époxy conductrice, ensuite une couche d&#39;argent colloïdal coller sur les côtés du bloc pour fournir un chemin conducteur à la broche d&#39;aluminium. </li><li> Examiner les échantillons de tissus en utilisant un système de microscope électronique à balayage équipé d&#39;un étage dans la chambre basse et ultramicrotome kV détecteur d&#39;électrons rétrodiffusés 32. Note: Obtenir instrument- et le site de formation en microscopie électronique à balayage (MEB) utiliser et devenir un utilisateur autorisé. Alternativement, la collaboration avec un centre de chercheur ou de base pour les petits projets peut être possible. la formation de rayonnement peut également être nécessaire que MEB génèrent des radiographies. </li><li> Pour l&#39;image des échantillons, utilisez les paramètres suivants: 2,25 kV, de 5 - 10 nm / pixels de résolution, avec des tailles de champ entre 80-250 um en x, y (autre domaine tailles possible), et l&#39;épaisseur de tranche de 50 - 100 nm, avec un total de 250 - 600 tranches dans un 16 - période de 20 h. Remarque: Les paramètres varient considérablement entre les différents microscopes, indiéchantillons individuels, et de la résolution souhaitée. Ces paramètres doivent produire des images qui sont facilement interprétables pour de nombreux échantillons. </li></ol> 2. Analyse de l&#39;Dataset Imaging Note: Le J / Fiji logiciel Image est utilisé pour analyser l&#39;ensemble de données et repose sur le plugin TrakEM2. étapes de prétraitement peuvent être effectuées en utilisant une variété de logiciels, et peuvent être étendus ou mineur selon le niveau d&#39;expérience et les piles obtenues. Les principales transformations en utilisant le logiciel open-source (ImageJ ver 1.50b, FIDJI télécharger 1 octobre 2015) sont décrites ici. <ol><li> Convertir des images au format TIFF 8 bits à partir des propriétaires images originales 16 bits en ouvrant dans le logiciel et la sélection des éléments de menu image → Type → 8 bits. <ol><li> Si la conversion automatique de contraste / luminosité lors de cette étape est idéal pour les images, rouvrir les images 16 bits, et appuyez sur l&#39;image → Régler → Luminosité / Contraste. Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images, et appuyez sur Appliquer. Puis effectuer cCONVERSION. Remarque: Sur certains MEB, cette étape peut nécessiter un logiciel de fabricant de microscope. </li><li> Si nécessaire, en raison du mouvement d&#39;image inacceptable entre les tranches (par ex. La dérive due à la charge), enregistrer / aligner les piles d&#39;images (éléments de menu Plugins → Enregistrement → StackAlignmentWithSIFT linéaire). Dans la plupart des logiciels d&#39;enregistrement, défini pour le mode &quot;traduction uniquement&quot; plutôt que &quot;corps rigide&quot;. Remarque: De nombreuses approches et logiciels peuvent travailler: les inscriptions EIPD plug-in fonctionne pour de nombreuses applications et il y a une version virtuelle de la pile. <ol><li> Si nécessaire, agrandir la taille de la toile avant l&#39;enregistrement (image → Régler → taillecanevas) ou la réduire à une zone d&#39;intérêt (image → Rogner). Remarque: Certaines dérive ou évasement peuvent se produire, et d&#39;essayer d&#39;autres plugins ou logiciel peut produire de meilleurs résultats. Options manuelles sont également disponibles (par ex. ImageJ / FIDJI, Plugins → Enregistrement → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Si desired, images à l&#39;échelle de taille plus petite, plus facile à gérer (par exemple. 25%) en utilisant ImageJ (image → Scale). </li></ol></li><li> Lancez le logiciel, sélectionnez Fichier → Importer → séquence d&#39;images, puis sélectionnez les fichiers TIFF. </li><li> Lancez le plugin en sélectionnant Fichier → Nouveau → TrakEM2 (Blank). Deux fenêtres seront ouvertes; on gère le projet et area_lists et l&#39;autre gère le traçage, et est appelée la «toile». </li><li> Charger la pile d&#39;images dans le plug-in en faisant un clic droit sur l&#39;importation de la toile. Sélectionnez l&#39;importation et cliquez sur la pile d&#39;importation. Dans les options de pop-up, cochez la case pour les piles virtuelles. Note: Bien que les piles d&#39;images sont déjà ouvertes dans le logiciel, ils doivent également être ouverts dans le plug-in. L&#39;ordinateur peut fonctionner plus en douceur si la boîte de piles virtuelles est cochée. </li><li> Après les mipmaps sont créés et la pile est chargée, cliquez droit de nommer le projet sous la fenêtre du plugin. Clic droit sur «nouveau projet» dans le col de modèlelonne, et sélectionnez «Ajouter nouvel enfant» pour ce projet. Faites un clic droit à nouveau pour sélectionner &#39;area_list&#39;. </li><li> Réglez l&#39;échelle de l&#39;axe Z du projet d&#39;accord avec les paramètres d&#39;un microscope électronique d&#39;origine par un clic droit sur la toile, puis cliquez sur Affichage et sélectionnez l&#39;étalonnage. Aussi, réglez le Z-échelle en sélectionnant toutes les couches dans la fenêtre du plug-in, cliquez à droite pour sélectionner l&#39;échelle Z et de l&#39;épaisseur. </li><li> Cliquez et faites glisser le «projet» et tous les «enfants» dans le projet Objets section pour créer les «listes de la zone» sous l&#39;onglet &#39;Z de l&#39;espace »dans la fenêtre de toile. </li><li> Sélectionnez la «liste de la zone» et cliquez à droite pour sélectionner et définir une couleur. Maintenant, utilisez l&#39;outil pinceau pour tracer des objets tels que les mitochondries, dans les images d&#39;un microscope électronique. Utilisez &#39;Maj + clic »pour remplir un cercle fermé,&#39; Ctrl + défilement &#39;pour zoomer et dézoomer, et« Alt + clic pour faire tourner pinceau curseur dans une gomme à effacer. </li><li> Sélectionnez deux zones de ~ 10 à 15 umpar 10-15 um dans le coin gauche en haut et en bas à droite de l&#39;image et d&#39;identifier toutes les mitochondries dans ces domaines pour permettre un échantillonnage biaisé des mitochondries dans chaque jeu de données. </li><li> Sur la &#39;toile&#39;, observer et suivre les mitochondries dans les sections. Remarque: Les mitochondries sont des organites assez sombres / denses apparaissant, de taille similaire de diamètre et vaguement cylindriques. Le cristae unique, formé par la membrane interne sont faciles à distinguer à l&#39;intérieur de cet organite. </li><li> Lorsque vous avez terminé avec le traçage, cliquez droit sur le area_list sous l&#39;onglet de l&#39;espace Z, sélectionnez «Afficher en 3D». Cela permet de lancer le visualiseur plug-in 3D pour afficher une reconstruction 3D de l&#39;image tracée. <ol><li> Pour effectuer des mesures de volume mitochondriales, sélectionnez l&#39;objet dans la visionneuse 3D, cliquez sur l&#39;onglet «Modifier» et sélectionnez «Propriétés de l&#39;objet». L&#39;estimation du volume mitochondrial est répertorié avec plusieurs autres mesures. </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. Emily K Benson est une employée rémunérée de Renovo Neural Inc., et Grahame J Kidd est directeur scientifique de 3DEM chez Renovo Neural Inc., qui est un fournisseur commercial de services et d’analyse SEM de face de bloc en série.

La complexité du système nerveux représente un défi important dans la reconstruction de grands volumes de tissus et l&#39;analyse de la morphologie et la distribution des organites tels que les mitochondries, avec une résolution suffisante. Plusieurs cellules , y compris les neurones, les oligodendrocytes et les astrocytes avec de nombreux processus étendus en trois dimensions interagissent dans le tissu cérébral 43. Depuis mitochondries réside à la fois dans le soma des cellules et des processus distants, la...

Les mitochondries sont des organelles dynamiques qui changent leur forme et leur emplacement en fonction des besoins et des signaux cellulaires, en interaction étroite avec le cytosquelette cellulaire, et en réponse à des événements cellulaires tels que les courants de calcium dans les neurones 1. Les mitochondries interagissent également avec d&#39; autres organites cellulaires , par exemple réticulum endoplasmique, qui à son tour régule leur dynamique et leur métabolisme 2. Morphologie mitochondriale montre une hétérogénéité dans différents types de cellules ie. la forme de l&#39;organite varie d&#39; un tube à celui constitué par des feuilles, des sacs et des ovales 3. Il a été montré que les protéines du cycle de fusion et de fission mitochondriale peuvent réguler l&#39;emplacement, la taille, la forme et la distribution des mitochondries 4. De plus, les changements dans la forme mitochondriale sont associés à la neurodégénérescence, la plasticité neuronale, une atrophie musculaire, la signalisation du calcium, de l&#39;oxygène production d&#39;espèces réactives ainsi que la durée de vie et la mort cellulaire impliquant thala morphologie des mitochondries des cellules T spécifiques est essentielle pour le maintien de la fonction cellulaire normale 11/05. Une fonction majeure bioénergétique des mitochondries est de générer de l&#39; adénosine triphosphate (ATP) en exécutant une série de réactions métaboliques qui impliquent ventilation complète des nutriments (c. -à- glucose, acides gras ou acides aminés) par l&#39; intermédiaire du cycle de TCA et OXPHOS voies 12. Le cerveau humain ne représente que 2% du poids du corps mais il consomme environ 20% de l&#39; énergie totale produite qui en fait une énergie extrêmement exigeante organe 13. Il est donc pas surprenant que le dysfonctionnement mitochondrial chez l&#39; homme conduit à un grand nombre de manifestations neurologiques 14-17. Les mutations génétiques dans les composants OXPHOS qui nuisent conduit ATP génération à des troubles mitochondriaux 17,18, qui sont un groupe hétérogène de troubles cliniquement avec une prévalence de 1 ~: 5.000 personnes, et l&#39; une des causes les plus communes de mtroubles etabolic chez les enfants et les adultes. Déficit de l&#39; ATP des mitochondries dérivées affecte plusieurs organes et systèmes d&#39;organes exigeants de haute énergie tels que le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques étant principalement affectés chez ces patients 14,17,18. Au cours des dernières années, plusieurs études ont fourni des preuves pour le dysfonctionnement mitochondrial dans les deux troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératives 15-17,19,20. Comme les mitochondries sont essentielles et critiques pour le développement et le fonctionnement du cerveau, il est impératif d&#39;élaborer des protocoles qui peuvent analyser les changements dans le cerveau mitochondrial la morphologie, la structure, la taille, le nombre et la distribution au titre des deux états sains et malades. Des modèles de souris avec mitochondrie ciblée protéine fluorescente verte (GFP) ont été produits pour visualiser les mouvements mitochondriales et la localisation dans le cerveau 21,22. Bien que ce soit un outil extrêmement utile pour examiner la motilité mitochondrial et la distribution générale, il y a quelques inconvénients qui INCLUDe résolution limitée et la sensibilité de la microscopie par fluorescence. Ces attributs font qu&#39;il est difficile de suivre les relativement petites mitochondries de taille. De même, la microscopie de série électronique à transmission a été utilisé avec succès pour afficher les mitochondries synaptique 23, mais cette méthode est très coûteuse en temps. Morphologie mitochondriale est connue pour être hautement dynamique car ils sont soumis à des cycles de fission et de fusion en continu, et dans la plupart des cellules mitochondries maintenir un réseau fortement connecté 24-26. Les neurones sont des cellules fortement avec plusieurs dendrites et des axones étendus et les mitochondries qui forment un réseau réticulaire connecté dans le corps de la cellule polarisée peut avoir à séparer car elles se frayer un chemin à travers ces neurites (figure 1). Cela rend les mitochondries cérébrales extrêmement variées en taille et en forme. Par exemple, en utilisant la microscopie électronique à balayage d&#39;îlot série (SBFSEM) technique, nous l&#39;avons déjà fait remarquer que la différence dans le volume ou la taille de mitochondr extrasynaptiqueia aux mitochondries présentes dans les terminaisons nerveuses peut être jusqu&#39;à seize replient 27. Il existe plusieurs approches pour réaliser le volume des analyses 28, qui comprend de série section TEM 29, bande automatisé collecte ultramicrotome SEM 30, faisceaux d&#39; ions focalisés SEM 31, et SBFSEM 32. L&#39;analyse de SBFSEM présente des avantages en ce qu &#39;il a une résolution pour fournir des données quantitatives sur la forme morphologique, la taille, la distribution et le nombre d&#39;organites tels que les mitochondries dans des zones allant jusqu&#39;à 1 mm du cerveau. Le fonctionnement technique est aussi le moins exigeant, avec l&#39;acquisition de données et d&#39;analyse au sein des capacités de nombreux laboratoires biologiques qui manquent d&#39;expérience EM précédente. L&#39;avènement des instruments du commerce pour générer des images de section en forme de série a fait une analyse des tissus microscopie électronique 3D une technique de routine, ce qui permet en outre une analyse volumétrique non biaisé de façon rapide et reproductible 28 </sup&gt;. Le SBFSEM a d&#39; abord été décrite et utilisée dans le domaine de la neurobiologie en 2004 32, basé sur une idée introduite par Leighton en 1981 33. De nombreuses études depuis ont mis en place cette technique comme un outil majeur dans l&#39; analyse de la reconstruction des circuits neuronaux 34. En outre, pour de nombreux projets à plus petite échelle, il fournit une analyse de la reconstruction pour identifier les organites cellulaires 27,35-39. Depuis, les images acquises sont dérivées de basse tension des électrons de rétrodiffusion, de nouveaux protocoles de coloration qui combinent différentes techniques connues de coloration des métaux lourds ont été développés pour augmenter la résolution 40. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour l&#39; utilisation de la 3D imagerie par microscopie électronique et analyse volumétrique des mitochondries cérébrales basée sur les méthodes qui ont déjà été utilisées par nous et d&#39; autres 38,39,41. Les méthodes de tissus post-traitement ont été utilisées comme décrit précédemment par Deerinck et al40.

<table><tbody><tr><td>souris C57BL/6J Jackson</td><td>laboratoire&nbsp ;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, nom commercial Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de dissection</td><td>Fisher scientific&nbsp ;</td><td>S65105&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Canule papillon</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filtre (0,45 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Système de sectionnement vibratome</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Acide tannique</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium 4 % Solution</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de plomb</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 KIT D’ENROBAGE</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Contient de la résine Embed 812, DDSA, NMA et DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde 25 % EM Grade</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Moule d’enrobage</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Goupille d’échantillon en aluminium</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Argent colloïdal Liquid</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Les magasins de quincaillerie/artisanat proposent cet article</td></tr><tr><td>Epoxy conducteur</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome en chambre pour MEB</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Peut être conçu pour d’autres MEB</td></tr><tr><td>Microscope de coupe pour la préparation des broches</td><td>Gatan Inc.</td><td>fourni dans le cadre du système</td><td></td>3View</tr><tr><td>Détecteur d’électrons rétrodiffusés à faible kV</td><td>Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Package de traitement Fidji&nbsp ;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

analyse de brain mitochondries utilisant serial bloc-face microscopie électronique à balayage



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Le cerveau humain est un organe de consommation d&#39;énergie élevée qui repose principalement sur le glucose comme source de carburant. Le glucose est catabolisme par les mitochondries du cerveau via la glycolyse, l&#39; acide tri-carboxylique (TCA) et le cycle de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) voies pour produire l&#39; énergie cellulaire sous la forme d&#39;adénosine triphosphate (ATP). Dépréciation de la production d&#39;ATP mitochondrial provoque des troubles mitochondriaux, qui présentent cliniquement avec des symptômes neurologiques et myopathes importants. Défauts mitochondriaux sont également présents dans les troubles neurodéveloppementaux (par exemple l&#39; autisme des troubles du spectre) et des troubles neurodégénératifs (par exemple , la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d&#39; Alzheimer et la maladie de Parkinson). Ainsi, il y a un intérêt croissant dans le domaine pour effectuer une analyse 3D de la morphologie mitochondriale, la structure et la distribution dans les deux états sains et les maladies. La morphologie du cerveau mitochondrial est extrêmement diversifié, avec quelques mitochondries en particulier ceuxla région synaptique étant dans la gamme de &lt;200 nm de diamètre, ce qui est en dessous de la limite de résolution de la microscopie optique traditionnelle. Exprimant une protéine mitochondriale ciblée fluorescente verte (GFP) dans le cerveau améliore considérablement la détection des organites par microscopie confocale. Toutefois, il ne résout pas les contraintes pesant sur la sensibilité de détection de relativement petites dimensions, sans mitochondries sursaturer les images de grandes dimensions mitochondries. Alors que la microscopie de série électronique à transmission a été utilisée avec succès pour caractériser les mitochondries dans les synapses des neurones, cette technique est extrêmement chronophage en particulier lorsque l&#39;on compare les échantillons multiples. La technique de la microscopie électronique à balayage d&#39;îlot série (SBFSEM) implique un processus automatisé de sectionner, blocs d&#39;imagerie d&#39;acquisition des tissus et des données. Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer SBFSEM d&#39;une région définie du cerveau de rongeur pour reconstruire rapidement et de visualiser la morphologie mitochondriale. Cette technologienique peut également être utilisé pour fournir des informations précises sur le nombre mitochondriale, le volume, la taille et la distribution dans une région du cerveau définie. Depuis la résolution de l&#39;image obtenue est élevée (typiquement de moins de 10 nm) des défauts morphologiques mitochondriales bruts peuvent également être détectées.

Nous démontrons que la morphologie du cerveau et la taille mitochondrial est hétérogène dans les différents sous-compartiments neuronaux. La microscopie confocale sur des cultures de neurones de faible densité transduction avec des lentivirus exprimant la protéine fluorescente verte mitochondrial ciblée a montré que les mitochondries résidant dans le soma des neurones forment un réseau réticulaire, alors que ceux qui résident dans distaux de neurites présentent une morphologie allongée d...

La visualisation et l’analyse mitochondriales à partir de tissus cérébraux de mammifères constituent une tâche difficile. Ici, nous décrivons comment l’analyse de reconstruction tridimensionnelle (3D) de la microscopie électronique à balayage en série (SBFSEM) peut être utilisée pour mieux comprendre l’analyse morphologique et volumétrique de cet organite générateur d’énergie critique.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

L'objectif général de la microscopie électronique à balayage en coupe sérielle est d'analyser la morphologie, la structure, la distribution, le volume et le nombre de mitochondries dans une région définie du cerveau de souris. Cette méthode peut aider à répondre à de nombreuses questions clés en neurobiologie, comme savoir si les modifications de la structure, du nombre et de la distribution des mitochondries cérébrales contribuent de manière significative aux troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux. Le principal avantage de cette technique réside dans son automatisation du processus d'imagerie de sections sérielles, grâce à l'intégration d'un ultramicrotome sur mesure intégré à la chambre de microscope électronique à balayage sous vide partiel.Pour commencer l'expérience, laver les tissus préparés au préalable et fixés au glutaraldéhyde trois fois pendant cinq minutes chacun dans du tampon cacodylate 0,1 molaire. Postfixer les tissus avec 1 millilitre d'acide tannique à 0,1 % en tampon cacodylate pendant 30 minutes à température ambiante. Après la post-fixation, laver les tissus dans du tampon cacodylate.Dissoudre 0,3 gramme de ferrocyanure de potassium et 0,86 gramme de cacodylate de sodium dans 10 millilitres d'eau distillée. Juste avant utilisation, ajouter 10 millilitres d'osmium tétraoxyde à 4 % et colorer les tissus avec une solution de ferrocyanure d'osmium à 2 % pendant 90 minutes sur de la glace. Après la coloration, laver le tissu dans de l'eau distillée.Traitez les échantillons avec une solution fraîchement préparée de thiocarbohydrazide (TCH) à 1 % pendant 20 minutes à température ambiante. Rincez ensuite les échantillons. Puis, coloriez les tissus avec une solution aqueuse d'osmium tétraoxyde à 2 % pendant une heure.Après la coloration, laver les tissus avec de l'eau distillée. Incuber les échantillons toute la nuit dans 1 % d'acétate d'uranyle dans de l'eau distillée à 4 degrés Celsius. Le jour suivant, rincer les tissus dans de l'eau distillée et les incuber avec la coloration au plomb d'aspartate de Welton dans une étuve.Obtenir des colorations tissulaires optimales est essentiel pour l'imagerie, car une mauvaise coloration entraîne un phénomène de charge sur l'échantillon qui rend l'imagerie difficile, voire impossible. Laver le tissu à l'eau distillée. Déshydrater les échantillons à l'aide d'une série progressive d'alcool en utilisant des solutions d'éthanol refroidies pendant cinq minutes chacune, suivies d'une déshydratation à l'éthanol à 100 % effectuée trois fois pendant 10 minutes chacune.Lavez les échantillons deux fois pendant 15 minutes chacune dans de l'oxyde de propylène. Placez les tissus dans un mélange 1:1 de résine d'inclusion et d'oxyde de propylène, fermez le flacon et incubez les tissus toute la nuit. Ouvrez le flacon après deux heures afin que l'oxyde de propylène s'évapore pendant une période de neuf heures.Transférez les tissus dans de la résine d'inclusion fraîche à 100 % dans des flacons propres pendant deux heures. Incorporez les échantillons dans de la résine d'inclusion fraîche dans des moules plats contenant des étiquettes en papier imprimées et polymérisez-les au four. Après une heure, vérifiez le positionnement et l'alignement des tissus et effectuez les ajustements nécessaires.Rabotez les échantillons à la zone d'intérêt et montez-les sur une broche en aluminium à l'aide d'une colle cyanoacrylate super adhésive en gel. Ensuite, recouvrez l'échantillon de pâte argentée colloïdale sur les côtés du bloc afin d'assurer un chemin conducteur vers la broche en aluminium. Examinez les spécimens de tissus à l'aide d'un système de microscopie électronique à balayage équipé d'un porte-objet ultramicrotome intégré à la chambre et d'un détecteur d'électrons rétrodiffusés à basse tension kilovolt. Imager les échantillons avec ces paramètres. Commencer l'analyse en sélectionnant Image, Type, puis 8 bits pour convertir les images au format TIFF 8 bits à partir du format propriétaire d'origine 16 bits. Si la conversion automatique du contraste et/ou de la luminosité durant cette étape n'est pas optimale pour les images, rouvrir les images 16 bits et appuyer sur Image, Ajuster, Luminosité/Contraste.Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images et appuyez sur Appliquer. Ensuite, effectuez la conversion. S'il y avait un mouvement d'image inacceptable entre les coupes, alignez les piles d'images en sélectionnant Modules complémentaires, Enregistrement et Alignement linéaire de pile avec SIFT, puis configurez l'alignement en mode translation uniquement, plutôt que corps rigide.Agrandissez la taille du canevas avant l'enregistrement en sélectionnant Image, Ajuster, Taille du canevas. Sinon, réduisez l'image à une zone d'intérêt en sélectionnant la région souhaitée, puis en la rognant. Si nécessaire, redimensionnez les images à une taille plus petite et plus facile à gérer à l'aide d'ImageJ, puis sélectionnez Image et Échelle.La microscopie confocale sur des cultures neuronales de faible densité a montré que les mitochondries situées dans le corps cellulaire neuronal forment un réseau réticulé, tandis que celles présentes dans les neurites distaux présentent une morphologie allongée et discrète. Grâce à la microscopie électronique à balayage en coupe sérielle, ou technique SBFSEM, les mitochondries, les dendrites et les varicosités axonales ont été clairement observées dans le cerveau de souris. Des reconstructions sur trois jours des mitochondries dans les neurites de tissu cérébral de souris ont révélé une différence de taille entre les mitochondries dendritiques et axonales.Les données extraites d'une image représentative de SBFSEM en 2-D ont révélé que le volume ou la taille des mitochondries situées dans les présynapses neuronales était significativement plus faible que celui des mitochondries situées dans la région extrasynaptique. Les images obtenues par analyse SBFSEM offrent une résolution accrue permettant de visualiser les caractéristiques ultrastructurales des mitochondries individuelles. Il est possible de classer le compartiment cellulaire des mitochondries en déterminant leur proximité avec des structures facilement identifiables, telles que les mitochondries somatiques non synaptiques et les mitochondries présynaptiques.Cette technique peut être réalisée en environ sept jours, ce qui inclut trois jours de coloration, deux jours pour le durcissement de la résine, un jour d'acquisition d'images afin de produire un empilement adapté à cette analyse, et environ deux à quatre heures de post-traitement des images en préparation de l'analyse. Ce protocole peut également être utilisé en combinaison avec d'autres méthodes d'imagerie des mitochondries, comme l'imagerie en temps réel avec des mitochondries marquées génétiquement, afin de répondre à des questions relatives au trafic mitochondrial et à la dynamique de leur division et fusion.

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Source : Mukherjee, K., et. al. Analyse des mitochondries cérébrales à l’aide de la microscopie électronique à balayage en série Block-face. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la préparation, l’imagerie et l’analyse du tissu cérébral de souris à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face de bloc en série (SBFSEM) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale, permettant une cartographie précise de leur morphologie et de leur distribution spatiale dans les compartiments...

 Imagerie des mitochondries neuronales à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face carrée en série

Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l'imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l'évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou In Vivo

Nous présentons un protocole pour étudier la distribution des mitochondries et du réticulum endoplasmique dans les cellules entières après modification génétique utilisant la lumière corrélative et la microscopie électronique de volume comprenant la peroxidase d'ascorbate 2 et la coloration de peroxidase de raifort, sectionnement en série des cellules avec et sans le gène cible dans la même section, et imagerie en série par microscopie électronique.

Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Le réseau mitochondrial est extrêmement complexe, ce qui le rend très difficile à analyser. Un nouvel outil MATLAB analyse les mitochondries confocales en direct dans des images timelapse, mais il en résulte un volume de sortie important nécessitant une attention manuelle individuelle. Pour résoudre ce problème, une optimisation de routine a été développée, permettant une analyse rapide des fichiers.

Analyse automatisée optimisée de la modulation de l’homéostasie des mitochondries neuronales vivantes par des récepteurs d’acide rétinoïque spécifiques aux isoformes

Cette étude présente une méthode d’analyse de la morphologie des mitochondries basée sur l’immunomarquage et l’analyse d’images dans le tissu cérébral de souris in situ. Il décrit également comment cela permet de détecter les changements dans la morphologie mitochondriale induits par l’agrégation des protéines dans les modèles de la maladie de Parkinson.

Examen histologique de la morphologie mitochondriale dans un modèle de maladie de Parkinson

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Ce protocole fournit une approche standardisée pour l’imagerie de la morphologie mitochondriale dans plusieurs tissus de C. elegans au cours du vieillissement.

Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement

Dans cette étude, nous décrivons un protocole étape par étape et mettons l’accent sur les détails clés pour déterminer les caractéristiques morphologiques des mitochondries dans les cellules vivantes, y compris la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Cette méthode est couramment utilisée pour examiner la morphologie mitochondriale afin d’étudier diverses conditions.

Détermination de la morphologie mitochondriale dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale

Découvrez l'analyse de la morphologie mitochondriale dans le cerveau de souris par microscopie électronique à balayage par bloc sériel. Cette technique automatisée permet la reconstruction 3D des structures mitochondriales.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

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