Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

L’objectif global de la technique de microscopie électronique à balayage en série est d’analyser la morphologie, la structure, la distribution, le volume et le nombre de mitochondries dans une région définie du cerveau de la souris. Cette méthode peut aider à répondre à de nombreuses questions clés en neurobiologie, telles que la question de savoir si les changements dans la structure, le nombre et la distribution des mitochondries cérébrales contribuent de manière substantielle aux troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle automatise le processus d’imagerie des coupes en série en incorporant un ultramicrotome personnalisé intégré dans la chambre du microscope électronique à balayage à faible vide.

Pour commencer l’expérience, lavez les tissus préalablement préparés avec du glutaraldéhyde trois fois pendant cinq minutes chacun dans un tampon cacodylate de 0,1 molaire. Post-fixez les tissus avec 1 millilitre de cacodylate tamponné à 0,1 % d’acide tannique pendant 30 minutes à température ambiante. Après la post-fixation, lavez les tissus dans un tampon cacodylate.

Dissoudre 0,3 gramme de ferrocyanure de potassium et 0,86 gramme de cacodylate de sodium dans 10 millilitres d’eau distillée. Juste avant l’utilisation, ajoutez 10 millilitres de tétroxyde d’osmium à 4 % et colorez les tissus avec une solution de ferrocyanure d’osmium à 2 % pendant 90 minutes sur de la glace. Après la coloration, lavez le tissu dans de l’eau distillée.

Traitez les échantillons avec une solution de thiocarbohydrazide à 1 % ou de TCH fraîchement préparée pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les échantillons. Ensuite, colorez les tissus avec du tétroxyde d’osmium aqueux à 2 % pendant une heure.

Après la coloration, lavez les mouchoirs à l’eau distillée. Incuber les échantillons pendant la nuit dans de l’acétate d’uranyle à 1 % dans de l’eau distillée à 4 degrés Celsius. Le lendemain, rincez les tissus à l’eau distillée et incubez-les avec la coloration au plomb-aspartate de Welton dans un four.

L’obtention des meilleures colorations possibles des tissus est essentielle à l’imagerie, car une mauvaise coloration entraîne un phénomène de charge sur l’échantillon qui rend l’imagerie difficile, voire impossible. Lavez le mouchoir à l’eau distillée. Déshydratez les échantillons à travers une série graduée d’alcool à l’aide de solutions réfrigérées d’éthanol pendant cinq minutes chacune, suivie d’une déshydratation à 100 % d’éthanol trois fois pendant 10 minutes chacune.

Lavez les échantillons deux fois pendant 15 minutes chacun avec de l’oxyde de propylène. Placez les mouchoirs dans un mélange 1:1 de résine d’enrobage et d’oxyde de propylène, bouchez le flacon et incubez les mouchoirs pendant la nuit. Débouchez le flacon au bout de deux heures afin que l’oxyde de propylène s’évapore au cours de la période de neuf heures.

Transférez les mouchoirs sur de la résine d’enrobage 100 % fraîche dans des flacons propres pendant deux heures. Incorporez les échantillons dans de la résine d’enrobage fraîche dans des moules plats contenant des étiquettes en papier imprimées et faites-les durcir dans un four. Après une heure, vérifiez le placement et l’alignement des tissus et ajustez si nécessaire.

Coupez les échantillons à la zone d’intérêt et montez-les sur une goupille en aluminium à l’aide de super colle cyanoacrylate gélifiante. Enduisez ensuite l’échantillon d’une pâte d’argent colloïdal sur les côtés du bloc pour fournir un chemin conducteur vers la broche en aluminium. Examinez les échantillons de tissus à l’aide d’un système de microscope électronique à balayage équipé d’une platine d’ultramicrotome dans la chambre et d’un détecteur d’électrons rétrodiffusés de faible kilovolts.

Imagez les échantillons avec ces paramètres. Commencez l’analyse en sélectionnant Image, Type, puis 8 bits pour convertir les images au format TIFF 8 bits à partir du format propriétaire d’origine 16 bits. Si la conversion automatique du contraste et/ou de la luminosité au cours de cette étape n’est pas idéale pour les images, rouvrez les images 16 bits et appuyez sur Image, Ajuster, Luminosité/Contraste.

Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images et appuyez sur Appliquer. Effectuez ensuite la conversion. S’il y a eu un mouvement d’image inacceptable entre les tranches, alignez les piles d’images en sélectionnant Plugins, Enregistrement et Alignement de la pile linéaire avec SIFT et définissez l’alignement pour le mode de traduction uniquement plutôt que pour le corps rigide.

Agrandissez la taille de la zone de travail avant l’enregistrement en sélectionnant Image, Ajuster, Taille de la zone de travail. Vous pouvez également réduire l’image à une zone d’intérêt en sélectionnant la région souhaitée, puis en la recadrant. Si nécessaire, mettez les images à l’échelle à une taille plus petite et plus facile à gérer à l’aide d’ImageJ, puis en sélectionnant Image et mise à l’échelle.

La microscopie confocale sur des cultures neuronales de faible densité a montré que les mitochondries résidant dans le soma neuronal forment un réseau réticulaire, tandis que celles résidant dans les neurites distaux présentent une morphologie allongée discrète. En utilisant la microscopie électronique à balayage en série, ou technique SBFSEM, les mitochondries, les dendrites et les varicosités axonales ont été clairement observées dans le cerveau de la souris. Des reconstructions de trois jours des mitochondries dans les neurites du tissu cérébral de souris ont montré une différence de taille entre les mitochondries dendritiques et axonales.

Les données extraites d’une image représentative 2D SBFSEM ont révélé que le volume ou la taille des mitochondries résidant dans les présynapses neuronales était significativement plus petit que ceux résidant dans la région extrasynaptique. Les images acquises par l’analyse SBFSEM offrent une résolution accrue pour visualiser les caractéristiques ultrastructurales des mitochondries individuelles. Il est possible de classer le compartiment cellulaire des mitochondries en déterminant sa proximité avec des structures facilement identifiables comme les mitochondries somatiques non synaptiques et les mitochondries présynaptiques.

Cette technique peut être réalisée en sept jours environ, ce qui comprend trois jours de coloration, deux jours pour le durcissement de la résine, un jour d’imagerie pour produire un empilement adapté à cette analyse, et environ deux à quatre heures pour le post-traitement de l’image en préparation de l’analyse. Cette procédure peut également être utilisée en conjonction avec d’autres méthodes d’imagerie des mitochondries, telles que l’imagerie en direct avec des mitochondries génétiquement marquées pour répondre à des questions sur le trafic mitochondrial et la dynamique de leur fission et de leur fusion.