Modélisation chimiothérapie leucémie résistant In Vitro

L’objectif global de cette procédure est de mieux modéliser la leucémie lymphoblastique aiguë résistante, ou LAL, in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le traitement de la LAL réfractaire sur la façon dont le microenvironnement de la moelle osseuse influence la résistance chimiothérapeutique des cellules LAL. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est considérablement moins chère et prend moins de temps que l’utilisation de modèles animaux traditionnels pour examiner la promotion de la drogue sur les cellules LLALES réfractaires.

Commencez par ensemencer cinq à 20 fois 10 à 10 cellules leucémiques dans 10 millilitres de milieu de culture spécifique à la tumeur sur une plaque de 100 millimètres de 80 à 90 % de cellules stromales confluentes de la moelle osseuse ou d’ostéoblastes. Tous les quatre jours, inclinez la plaque sur le côté et aspirez tout le milieu sauf un millilitre, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire adhérente. Ensuite, ajoutez soigneusement neuf millilitres de milieu de culture cellulaire leucémique frais dans le coin de la plaque sur le côté pour assurer une perturbation minimale des cellules adhérentes.

Après le 12e jour de co-culture, pipetez doucement le milieu de culture de haut en bas sur la plaque environ cinq à 10 fois pour recueillir les cellules leucémiques flottantes. Et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, réensemencez les cellules sur une nouvelle plaque de 80 à 90 % de cellules stromales confluentes de la moelle osseuse, ou ostéoblastes, comme nous venons de le démontrer.

Au quatrième jour, trois sous-populations de cellules leucémiques se seront formées, les cellules leucémiques en suspension flottant librement dans le milieu. Les cellules leucémiques Phase Bright adhèrent à la surface de la monocouche cellulaire adhérente, et les cellules leucémiques Phase Dim ont migré sous la monocouche. Pour préparer les colonnes de billes G10, réchauffez d’abord 30 millilitres de milieu de culture cellulaire par colonne à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, tirez la laine de verre en brins fins et lâches. Et ajoutez plusieurs couches de brins légèrement tassés à une seringue de 10 millilitres par colonne nécessaire. Lorsque la seringue est pleine aux 2/3, fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel en position fermée à l’embout et fixez la seringue sur un support à anneau suffisamment haut pour qu’un tube de collecte conique de 50 millilitres puisse être placé sous le robinet d’arrêt.

Maintenant, placez un tube de prélèvement sous la colonne de seringue. Et utilisez une pipette de 10 millilitres pour ajouter des gouttes de particules G10, en suspension dans du PBS, sur la laine de verre. Continuez à ajouter les particules de G10 jusqu’à ce qu’une pastille de deux millilitres se forme.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d’aliquotes du milieu préchauffé à la colonne. Et ouvrez lentement la vanne d’arrêt, de sorte que le fluide s’écoule de la colonne dans le sens de la goutte. Lorsque 10 millilitres de fluide se sont complètement écoulés à travers la colonne, fermez le robinet d’arrêt.

Jetez le flux continu et placez un nouveau tube de collecte sous la colonne. Pour récolter la sous-population tumorale en suspension, aspirez le milieu de la plaque de co-culture de cellules leucémiques et utilisez le même milieu pour rincer doucement la plaque une fois. Ensuite, transférez la sous-population de cellules leucémiques en suspension flottante dans un tube conique de 15 millilitres.

Pour récolter la sous-population tumorale Phase Bright, ajoutez 10 millilitres de milieu frais sur la plaque de co-culture. Et rincez environ cinq fois assez vigoureusement pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes sans déloger la monocouche cellulaire adhérente. Ensuite, transférez la sous-population Phase Bright dans son propre tube conique de 15 millilitres.

Pour récolter la sous-population tumorale Phase Dim, retirez le milieu restant avec un rinçage PBS d’un millilitre. Et détachez les cellules avec trois millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, tapotez doucement les côtés de la plaque pour déloger les cellules adhérentes, puis ajoutez un millilitre de FBS pour arrêter la réaction enzymatique.

Ensuite, rincez le sérum trois à cinq fois pour briser les agrégats de grosses cellules. Et transférez la sous-population non purifiée Phase Dim dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Lorsque toutes les sous-populations ont été collectées, faites tourner les cellules.

Et remettez en suspension chacune des pastilles dans un millilitre de milieu préchauffé. Avec le robinet complètement fermé, pour chaque sous-population, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter tout le volume d’un millilitre de cellules, goutte à goutte, sur le dessus de l’une des colonnes G10 préparées, en vous assurant que les cellules restent au-dessus ou à l’intérieur de la pastille G10. Laissez les cellules incuber sur la pastille G10 pendant 20 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un à trois millilitres de milieu frais préchauffé à la colonne. Et ouvrez le robinet d’arrêt pour que le fluide sorte lentement des colonnes, goutte à goutte. Continuez à ajouter du milieu préchauffé aux colonnes, par incréments d’un à deux millilitres.

Lorsqu’un total de 15 à 20 millilitres de cellules leucémiques a été prélevé, fermez le robinet d’arrêt et bouchez le tube de prélèvement. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans le tampon d’analyse en aval approprié. Après la trypsinisation de la couche cellulaire adhérente, deux populations distinctes de cellules sont observées par l’analyse de diffusion directe ou latérale.

Après la séparation de G10, une population pure de cellules LAL est récupérée. Il est particulièrement intéressant de noter que toutes les cellules Phase Dim récupérées à partir de cellules stromales de moelle osseuse, ou de co-cultures d’ostéoblastes, présentent peu ou pas de décès après leur exposition à une chimiothérapie cytotoxique. Lors de la tentative de ces procédures, il est important de se rappeler d’effectuer ces étapes aussi correctement que possible afin de réduire tout changement phénotypique qui peut se produire dans les cellules leucémiques.

Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la leucémie de modéliser la leucémie résistante à la chimiothérapie dans un modèle in vitro qui ressemble davantage au microenvironnement de la moelle osseuse.