Récolte de sous-populations leucémiques : une méthode de séparation spatiale des sous-populations de cellules leucémiques à partir de la co-culture 2D

- Lorsque des cellules leucémiques sont co-cultivées avec des cellules stromales mésenchymateuses, elles interagissent avec les cellules stromales et forment trois sous-populations. Cellules suspendues flottant librement, cellules à luminosité de phase adhérent à la surface de la monocouche mésenchymateuse et cellules à atténuation de phase sous la monocouche mésenchymateuse. Pour séparer chaque sous-population, prélever une plaque de culture tissulaire avec une monocouche de cellules stromales mésenchymateuses.

Implantez les cellules leucémiques présentes dans des milieux de culture spécifiques à la tumeur sur la monocouche et incubez la plaque pendant la durée souhaitée. Ensuite, collectez les cellules tumorales en suspension en pipetant les cellules flottant librement dans un tube séparé. Maintenant, ajoutez le milieu frais dans la plaque et pipetez vigoureusement pour déloger les cellules tumorales en phase brillante de la surface monocouche mésenchymateuse.

Collectez ces cellules en les pipetant dans un tube séparé. Ajoutez de la trypsine dans la plaque pour éliminer les cellules mésenchymateuses adhérentes. Ajoutez du sérum fœtal bovin, ou FBS, pour arrêter l’action de la trypsine et pour briser les agrégats cellulaires. Maintenant, rassemblez les cellules de gradation de phase dans un tube. Centrifugez individuellement les trois tubes contenant différentes sous-populations cellulaires et remettez la pastille en suspension dans un milieu frais pour une analyse plus approfondie. Dans le protocole suivant, nous isolerons des cellules leucémiques en suspension, à luminosité de phase et à faible intensité de phase à partir de co-cultures 2D.

- Pour récolter la sous-population tumorale en suspension, aspirez le milieu de la plaque de co-culture de cellules leucémiques et utilisez le même milieu pour rincer doucement la plaque une fois. Ensuite, transférez la sous-population de cellules leucémiques en suspension flottante dans un tube conique de 15 millilitres. Pour récolter la sous-population tumorale en phase brillante, ajoutez 10 millilitres de milieu frais sur la plaque de co-culture

et rincer environ cinq fois assez vigoureusement, pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes sans déloger la monocouche cellulaire adhérente. Ensuite, transférez la sous-population à luminosité de phase dans son propre tube conique de 15 millilitres. Pour récolter la sous-population tumorale en phase dim, retirez le milieu restant avec un rinçage PBS d’un millilitre et détachez les cellules avec trois millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, tapotez doucement les côtés de la plaque pour déloger les cellules adhérentes, puis ajoutez un millilitre de FBS pour arrêter la réaction enzymatique. Ensuite, rincez le sérum trois à cinq fois pour briser tous les gros agrégats cellulaires et transférez la sous-population non purifiée dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Lorsque toutes les sous-populations ont été recueillies, faites tourner les cellules et remettez en suspension chacune des pastilles dans un millilitre de milieu préchauffé.