Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Méthode rentable de suivi des sources microbiennes à l’aide de virus humains et animaux spécifiques. L’étude décrit une méthode rentable pour l’identification de la source de contamination de l’urine fécale ou de la contamination par les nitrates dans l’eau à l’aide de la PCR quantitative pour la quantification spécifique des virus humains porcins, bovins, à ADN, adénovirus et polyomavirus proposés comme outils de suivi des sources microbiennes. Nous avons développé un protocole de concentration de virus à partir d’échantillons de 10 litres d’eau par floculation organique par lait écrémé, extraction d’acides nucléiques viraux à partir des sédiments et quantification des virus DNI humains, bovins ou porcins par PCR quantitative.

Il est bien connu que la contamination microbienne de la vitamine représente un risque important pour la santé et nous devons connaître les sources de la contamination. Nous avons proposé l’utilisation de virus à ADN très répandus comme outils de suivi des sources microbiennes. Les virus sélectionnés sont des adénovirus et des polyomavirus.

Ces virus sont excrétés de manière persistante tout au long de l’année et dans toutes les zones géographiques. Étudié dans des études précédentes. Nous avons mis au point des méthodes robustes de concentration à faible coût pour les virus dans l’eau, et nous avons travaillé à la mise au point de tests QPCR pour la quantification des adénovirus puriques et des polyomavirus bovins.

De plus, nous utilisons des adénovirus humains, des polyomavirus NGC, testés par QPCR, également comme marqueurs de contamination humaine dans l’eau, collecte d’échantillons d’eau. Dans cette étude, quatre répétitions de 10 litres par échantillon d’eau sont collectées dans des récipients en plastique à fond plat et un échantillon supplémentaire comme contrôle du processus. Ce dernier échantillon sera ensemencé avec une quantité connue de particules virales utilisées comme témoin.

Un contrôle négatif est préparé en laboratoire en utilisant de l’eau du robinet dans un récipient supplémentaire en plastique de 10 litres. Si l’échantillon présente une grande quantité de matières en suspension, de sable et d’autres matériaux, laissez-le sédimenter pendant 15 minutes, transférez l’eau dans un nouveau récipient. Concentration virale par floculation organique.

La détection de virus dans des échantillons d’eau faiblement ou modérément pollués nécessite la concentration des virus d’au moins plusieurs litres d’eau dans un volume beaucoup plus petit. La procédure de concentration comprend l’acidification de 10 litres d’échantillons d’eau, la floculation à l’aide de lait écrémé par gravité, la sédimentation des troupeaux et la collecte du précipité dans 10 millilitres de tampon phosphate pour démarrer le processus, une solution de localisation du lait écrémé dans l’eau de mer artificielle est préparée en dissolvant 10 grammes de lait écrémé en poudre dans un litre d’eau de mer artificielle et en ajustant soigneusement le pH à 3,5. Avec de l’acide chlorhydrique, le troupeau doit être visible.

Préparez la solution juste avant de l’utiliser ou conservez-la à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Les échantillons d’eau sont agités et la conductivité des échantillons est mesurée. S’il est inférieur à 1,5 millisiemens, des sels de mer seront ajoutés.

Ajustez le pH de l’échantillon d’eau à 3,5 par l’ajout d’acide chlorhydrique. Enregistrer le pH des échantillons avant et après le conditionnement, ainsi que le volume d’acide chlorhydrique utilisé. La conductivité doit également être enregistrée.

Après avoir ajusté le pH, nous ajoutons 100 millilitres de lait écrémé prefflod, 1 % à l’échantillon d’eau de 10 litres, et remuons les échantillons pendant huit à 10 heures pour permettre aux virus d’être absorbés par les troupeaux. Pour l’échantillon de pointe utilisé comme contrôle de processus, ajoutez le volume standard du virus de contrôle, un millilitre, par exemple, à l’échantillon. Arrêtez l’agitation et laissez le troupeau sédimenter par gravité pendant huit à 10 heures.

Après 16 heures, généralement le lendemain, nous pourrons collecter les sédiments. Pour ce faire, retirez le surnageant à l’aide d’une pompe péristaltique. Recueillir les sédiments avec les troupeaux, soit environ 500 millilitres dans une bouteille à centrifuger.

Équilibrez les pots par l’ajout de lait écrémé pH 3,5, centrifugez les pots avec une centrifugeuse à grande vitesse, 8 000 G 30 minutes à quatre degrés Celsius. Dès que la centrifugeuse s’arrête, retirez soigneusement les pots de la centrifugeuse. Versez très doucement et jetez le surnageant.

Dissoudre la pastille dans chaque bouteille de centrifugation jusqu’à un volume final de 10 millilitres de phosphate, extraction des acides nucléiques et quantification des virus. Le concentré viral est utilisé pour l’extraction des acides nucléiques viraux et des adénovirus et polyomes spécifiques d’intérêt seront quantifiés par A-Q-P-C-R. Effectuez une extraction d’acide nucléique avec le mini kit d’ARN viral key amp.

La lyse des virus présents dans 140. Des microlitres de concentrés viraux sont effectués manuellement et les acides nucléiques totaux sont extraits à 80 microlitres. Ce kit permet l’utilisation d’une plate-forme automatisée telle que Key cube.

L’étape suivante est la quantification du génome viral. Les copies dans les échantillons à l’aide d’une PCR quantitative avec des sondes tacman, des adénovirus humains, des virus du polyome JC et des virus du polyome bovin peuvent être quantifiées dans la même plaque à 96 puits. Étant donné que tous utilisent les mêmes cycles d’amplification, les adénovirus porcins doivent être testés séparément dans une plaque indépendante pour la quantification du virus cible.

Préparez le mélange PCR quantitatif dans une zone propre et séparée. Une fois le mélange préparé, répartissez 15 microlitres dans chaque puits, y compris les témoins. Ajouter les extractions d’acides nucléiques des échantillons de 10 microlitres dans une zone séparée, effectuer une dilution directe et une dilution décuplée dans de l’eau purifiée de chaque échantillon en double le volume total pour une réaction après l’ajout de la cible sera de 25 microlitres, 15 de mélange plus 10 d’échantillon ou couvrir les puits contenant les échantillons avec une partie d’un couvercle adhésif.

Conservez l’autre partie du couvercle pour l’étape suivante. Dilution AB des suspensions standard d’ADN. 10 microlitres de 10 à zéro à 10 à six copies du génome, simuler des microlitres par triples et en utilisant un micro pbit exclusivement utilisé pour la couverture d’ADN standard.

Les puits contenant les normes avec le couvercle adhésif préalablement coupé. Cette figure montre la répartition des échantillons de suspension standard et des témoins. Dans la plaque à 96 puits.

Effectuez la QPCR dans un système adéquat, en sélectionnant les paramètres appropriés après l’activation de l’amplitude de l’or pendant 10 minutes. À 95 degrés Celsius, 40 cycles d’amplification sont effectués une fois les réactions terminées. Stockez les données et les résultats comme décrit dans le manuel d’utilisation de l’équipement utilisé.

La quantité d’ADN sera définie comme la médiane des données obtenues après correction du facteur de dilution si nécessaire. Le graphique d’amplification et la courbe standard obtenus pour la quantification des adénovirus porcins ont montré un coefficient de corrélation de 0,999. Les valeurs de pente acceptables varient de moins 3,1 à moins 3,6 selon la procédure.

Les virus humains et animaux décrits ont été testés dans des échantillons d’eau souterraine provenant d’une zone présentant des niveaux élevés de nitrates afin de définir les sources de contamination. Les quatre répétitions analysées ont montré des résultats positifs pour la valeur moyenne des adénovirus porcins, soit 7,74 pour 10 à deux copies du génome par litre, ce qui serait lié à la présence de boues porcines dans la zone entourant le site d’échantillonnage, et prouverait la présence d’une contamination fécale porcine dans les eaux souterraines. Aucune contamination humaine n’était présente dans les échantillons analysés.

Les données virologiques ont été confirmées par PCR emboîtée et analyse de séquençage. Conclusion. Dans cette étude, nous avons présenté des résultats d’analyse d’échantillons d’eau souterraine, présentant une contamination d’origine porcine en l’absence de contamination humaine ou bovine. La procédure a également été appliquée à l’analyse des eaux de baignade, de l’eau de mer et de l’eau de rivière.

Nous présentons ici la procédure d’application de ces outils à l’identification de la source de contamination dans les eaux souterraines, en présentant des niveaux élevés de nitrate comme exemple de l’applicabilité des méthodes développées pour détecter la source de contamination dans l’environnement.