Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Méthode économique pour le traçage de la source microbienne en utilisant des virus humains et animaux spécifiques. Cette étude décrit une méthode économique permettant d'identifier la source de contamination fécale ou urinaire, ou encore de contamination par des nitrates dans l'eau, grâce à la PCR quantitative pour la quantification spécifique de virus ADN porcins, bovins et humains, d'adénovirus et de polyomavirus proposés comme outils de traçage de la source microbienne. Nous avons mis au point un protocole de concentration des virus à partir d'échantillons d'eau de 10 litres par floculation organique, d'extraction des acides nucléiques viraux à partir du sédiment au moyen de lait écrémé, et de quantification des virus ADN humains, bovins ou porcins par PCR quantitative.

Il est bien connu que la contamination microbienne de la vitamine représente un risque sanitaire important et nous devons connaître les sources de cette contamination. Nous avons proposé l'utilisation de virus à ADN hautement prévalents comme outils de traçage des sources microbiennes. Les virus sélectionnés sont les adénovirus et les polyomavirus.

Ces virus sont excrétés de manière persistante tout au long de l'année et dans toutes les régions géographiques, comme cela a été étudié dans des travaux antérieurs. Nous avons mis au point des méthodes de concentration robustes et peu coûteuses pour les virus présents dans l'eau, et nous avons consacré nos efforts au développement de tests de PCR quantitative pour la quantification des adénovirus urinaires et des polyomavirus bovins.

En outre, nous utilisons des adénovirus humains et des polyomavirus NGC, détectés par QPCR, comme marqueurs de contamination humaine dans l'eau, lors du prélèvement d'échantillons d'eau. Dans cette étude, quatre réplicats de 10 litres par échantillon d'eau sont recueillis dans des récipients en plastique à fond plat, ainsi qu'un échantillon supplémentaire servant de témoin de procédure. Ce dernier échantillon sera inoculé avec une quantité connue de particules virales utilisées comme contrôle.

Un témoin négatif est préparé en laboratoire en utilisant de l'eau du robinet dans un récipient plastique supplémentaire de 10 litres. Si l'échantillon contient une grande quantité de matières en suspension, de sable et d'autres matériaux, laissez-le sédimenter pendant 15 minutes, puis transférez l'eau dans un nouveau récipient. Concentration virale par floculation organique.

La détection des virus dans des échantillons d'eau faiblement ou modérément pollués nécessite la concentration des virus à partir d'au moins plusieurs litres d'eau vers un volume beaucoup plus petit. La procédure de concentration comprend l'acidification d'échantillons d'eau de 10 litres, la floculation à l'aide de lait écrémé, la sédimentation gravitationnelle des flocons et la collecte du précipité dans 10 millilitres de tampon phosphate pour démarrer le processus. Une solution de lait écrémé dans de l'eau de mer artificielle est préparée en dissolvant 10 grammes de poudre de lait écrémé dans un litre d'eau de mer artificielle et en ajustant soigneusement le pH à 3,5 à l'aide d'acide chlorhydrique. Les flocons doivent être visibles.

Préparez la solution juste avant utilisation ou conservez-la à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Les échantillons d'eau sont agités et la conductivité dans les échantillons est mesurée. Si elle est inférieure à 1,5 millisiemens, des sels marins seront ajoutés.

Régler le pH de l'échantillon d'eau à 3,5 en ajoutant de l'acide chlorhydrique. Noter le pH des échantillons avant et après conditionnement, ainsi que le volume d'acide chlorhydrique utilisé. La conductivité doit également être notée.

Après avoir ajusté le pH, ajoutez 100 millilitres de lait écrémé en poudre, à 1 %, à l'échantillon d'eau de 10 litres, et mélangez les échantillons pendant huit à dix heures afin de permettre aux virus de s'adsorber sur les flocs. Pour l'échantillon de contrôle par ajout utilisé comme témoin de traitement, ajoutez le volume standard du virus témoin, par exemple un millilitre, à l'échantillon. Arrêtez le mélange et laissez les flocs sédimenter par gravité pendant huit à dix heures.

Après 16 heures, généralement le lendemain, nous pourrons recueillir les sédiments. Pour ce faire, retirez le surnageant à l’aide d’une pompe péristaltique. Recueillez le sédiment avec les flocs, soit environ 500 millilitres, dans un flacon d’ultracentrifugation.

Équilibrez les pots en ajoutant du lait écrémé préf. flod à pH 3,5, centrifugez les pots dans une centrifugeuse à grande vitesse, à 8 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Dès que la centrifugeuse s'arrête, retirez soigneusement les pots de la centrifugeuse. Versez très délicatement et jetez le surnageant.

Resuspendre le culot dans chaque flacon de centrifugation jusqu'à un volume final de 10 millilitres de phosphate, extraction des acides nucléiques et quantification des virus. Le concentré viral est utilisé pour l'extraction des acides nucléiques viraux et les adénovirus spécifiques ainsi que les polyomavirus d'intérêt seront quantifiés par A-Q-P-C-R. Réaliser une extraction des acides nucléiques à l'aide du kit Key Amp Viral RNA Mini.

La lyse des virus présents dans 140 microlitres de concentrés viraux est effectuée manuellement, et les acides nucléiques totaux sont extraits en 80 microlitres. Ce kit permet l'utilisation d'une plateforme automatisée telle que Key cube.

L'étape suivante consiste en la quantification du génome viral. Les copies présentes dans les échantillons peuvent être quantifiées à l'aide d'une PCR quantitative avec des sondes TaqMan, permettant de détecter simultanément les adénovirus humains, les polyomavirus JC et les polyomavirus bovins sur la même plaque de 96 puits. Étant donné que tous utilisent les mêmes cycles d'amplification, les adénovirus porcins doivent être testés séparément sur une plaque indépendante afin de quantifier le virus cible.

Préparez le mélange de PCR quantitative dans un espace propre et séparé. Une fois le mélange préparé, répartissez 15 microlitres dans chaque puits, y compris les témoins. Ajoutez les extractions d'acides nucléiques des échantillons — 10 microlitres — dans un autre espace distinct, en effectuant une analyse directe et une dilution au dixième dans de l'eau purifiée pour chaque échantillon, en double. Le volume total pour une réaction après ajout de la cible sera de 25 microlitres, soit 15 de mélange plus 10 d'échantillon ou d'étalon. Recouvrez les puits contenant les échantillons avec une partie d'un couvercle adhésif.

Gardez l'autre partie du couvercle pour l'étape suivante. Dilution AB des suspensions standards d'ADN. Prélevez 10 microlitres allant de 10 à zéro à 10 à six copies génomiques, en triplicata, en utilisant exclusivement une micropipette dédiée au couvercle d'ADN standard.

Les puits contenant les étalons avec le couvercle adhésif préalablement découpé. Cette figure montre la répartition des échantillons de suspension d'étalons et des contrôles. Dans la plaque de 96 puits.

Réalisez la PCR quantitative dans un système adapté, en sélectionnant les paramètres appropriés après l'activation de l'amplification or pendant 10 minutes. À 95 degrés Celsius, 40 cycles d'amplification sont effectués une fois les réactions terminées. Conservez les données et les résultats comme indiqué dans le manuel d'utilisation de l'équipement utilisé.

La quantité d'ADN sera définie comme la médiane des données obtenues après correction du facteur de dilution, si nécessaire. Le tracé d'amplification et la courbe standard obtenus pour la quantification des adénovirus porcins ont montré un coefficient de corrélation de 0,999. Les valeurs de pente acceptables varient de -3,1 à -3,6 selon la procédure.

Des virus humains et animaux décrits ont été testés dans des échantillons d'eau souterraine provenant d'une zone présentant de forts taux de nitrates afin de déterminer les sources de contamination. Les quatre réplicats analysés ont donné des résultats positifs pour les adénovirus porcins (valeur moyenne : 7,74 × 10² copies génomiques par litre), ce qui serait lié à la présence de lisiers porcins dans la zone entourant le site d'échantillonnage et prouverait ainsi la contamination fécale porcine des eaux souterraines. Aucune contamination humaine n'était présente dans les échantillons testés.

Les données virologiques ont été confirmées par une analyse en PCR nichée et par séquençage. Conclusion. Dans cette étude, nous avons présenté des résultats analysant des échantillons d'eau souterraine, révélant une contamination d'origine porcine en l'absence de contamination humaine ou bovine. La procédure a également été appliquée à l'analyse des eaux de baignade, de l'eau de mer et de l'eau de rivière.

Nous présentons ici la procédure permettant d'appliquer ces outils à l'identification de la source de contamination dans les eaux souterraines, en prenant un taux élevé de nitrates comme exemple d'application des méthodes développées pour détecter la source de contamination dans l'environnement.