Name: Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez une méthode économique pour le suivi des sources microbiennes par quantification d'adénovirus et de polyomavirus humains, porcins et bovins par qPCR dans l'eau.

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Ce travail a été partiellement financé par le gouvernement espagnol &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (projet AGL2008-05275-C01/ALI), par la Commission européenne cadre sur l&#39;union de recherche 7 projets financés VIROBATHE (contrat n ° 513648), VIROCLIME (contrat n ° 243923 ) et par l&#39;Agence Catalane de l&#39;Eau, Agencia Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament de contrôle i dels Millora Ecosistemes Aquatics. Au cours de l&#39;étude ont développé Marta Rusiñol était un membre de la Generalitat &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. La concentration des particules virales présentes dans les échantillons d'eau <ol><li> Collecte et conditionnement des échantillons d'eau <ol><li> Recueillir un minimum de 2 répétitions de 10 L par échantillon dans des contenants en plastique à fond plat et un échantillon supplémentaire comme un contrôle de processus. Ce dernier échantillon sera dopé avec une quantité connue de particules virales et utilisé comme contrôle. Note: Il est recommandé d'avoir du matériel spécial séparé (bouteilles, tubes, etc) pour les échantillons dopés. </li><li> Vérifiez l'étalonnage du conductimètre et recalibrer si nécessaire. Préparer un témoin négatif en utilisant l'eau du robinet préalablement ajusté à la conductivité adéquate (voir ci-dessous 1.6) dans un récipient en plastique 10 supplémentaires L. </li><li> Pour des échantillons enrichis: Ajouter le volume standard du virus de la commande (environ 10 5 copies du génome par 10 L d'eau) à l'échantillon. Mélanger en remuant éclaboussures éviter et les aérosols. Les contrôles positifs pourrait consister en une souche rare de l'adénovirus sUCH que HAdV-35 ou un bactériophage, comme MS2. </li><li> Si l'échantillon présente la quantité élevée de matières en suspension (sable ou autres matériaux), il laisse des sédiments pendant 15 minutes. Transfert de l'eau dans un nouveau récipient. </li><li> Ajuster le pH de l'échantillon d'eau à 3,5 (± 0,1) par l'ajout de HCl 1 N. Cette étape est importante pour la concentration des virus, alors assurez-vous que le pH a été ajusté correctement. Mélangez soigneusement l'eau par une agitation vigoureuse, tout en ajoutant de l'HCl. (Remarque: Si le pH est inférieur à 3,5 ajouter du NaOH 1 M). </li><li> Ajuster la conductivité. Si l'échantillon possède une conductivité de 1500 uS / cm ou plus, cette étape n'est pas nécessaire. Si la conductivité est inférieure à 1500 uS / cm la formation de matière floculée (flocs) n'est pas garanti pour ajuster la conductivité à 1500 uS / cm par l'ajout de sels de mer artificielle (Sigma). Mélanger vigoureusement par l'agitation tout en ajoutant le sel marin. </li><li> Notez le pH des échantillons avant et après le conditionnement ainsi unes le volume de HCl utilisé. La conductivité devrait également être enregistré après ajustement du pH. Toujours désinfecter les électrodes pH-mètre et conductimètre avec une solution fraîche HCl, avec une solution de sodium déchlorer tiosulphate 10% et enfin rincer à l'eau distillée. </li></ol></li><li> Préparation de la pré-floculées lait écrémé 1% (PSM) <ol><li> Vérifiez l'étalonnage du pH-mètre et le conductimètre et recalibrer si nécessaire. </li><li> Préparer pré-floculées solution de lait écrémé (1% du PSM, p / v) en dissolvant 10 g de poudre de lait écrémé (Difco) dans une eau de mer artificielle L (dissoudre 33,3 g de sels de mer artificielle dans 1 L d'eau du robinet déchlorée et autoclave) et soin d'ajuster le pH à 3,5 avec HCl 1N. Les flocs doit être visible. Préparer la solution juste avant d'être utilisés ou conserver à 4 ° C pendant 24 h. Pour déchloration utiliser 1 ml de solution tiosulphate 10% par 100 ml d'eau. </li></ol></li><li> La floculation des particules virales présentes dans les échantillons d'eau<ol><li> Ajouter 100 ml de PSM 1% à l'échantillon d'eau de 10 L. </li><li> Incorporer les échantillons pour les 8-10 h pour permettre à des virus à adsorber les flocs. Utilisez une minuterie pour arrêt de l'agitation après 8-10 h. </li><li> Arrêtez l'agitation et laisser les sédiments des flocs par gravité pour les 8-10 h. </li></ol></li><li> Collecte et re-dissoudre les flocs. Centrifugation <ol><li> Eliminer le surnageant à l'aide d'une pompe péristaltique et une pipette en plastique relié à un tube en plastique. Pour des échantillons dopés le surnageant doit être recueilli dans une bouteille et désinfectés conformément aux procédures internes. Dans tous les cas prendre soin de ne pas recueillir le culot. </li><li> Recueillir les sédiments avec les flocs (environ 500 ml) dans une bouteille centrifugeuse. </li><li> Équilibre les pots par l'ajout de 3,5 pH PSM. </li><li> Centrifuger les pots dans une centrifugeuse à grande vitesse à 8000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Dès que la centrifugeuse s'arrête, retirez soigneusement les pots à centrifuger de la centrifugeuse. </li><li> Très gently égoutter et jeter le surnageant. Suivez les mesures appropriées pour le matériel infectieux. </li><li> Ajouter 7 ml de tampon phosphate de dissoudre le culot dans chaque bouteille centrifugeuse. </li><li> Une fois les flocs ont été dissous, de mesurer et ajouter un tampon phosphate pour atteindre un volume total de 10 ml. </li><li> Homogénéiser le concentré virale par vortex et de distribuer les 10 ml dans des microtubes propres qui doivent être congelés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire dans l'analyse plus loin. </li></ol></li></ol> 2. Extraction des acides nucléiques <ol><li> Effectuer une extraction des acides nucléiques avec le kit QIAamp Viral RNA Mini en suivant les instructions du fabricant. Ce kit permet l'utilisation d'une plate-forme automatisée (comme QIAcube, Qiagen). </li></ol> 3. PCR quantitative des adénovirus humains (HAdV), polyomavirus JC (JCPyV), adénovirus porcins (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) <ol><li> Quantification des copies du génome dans les échantillons <ol><li> Préparerle mix de qPCR dans un endroit propre séparé en utilisant l'environnement TaqMan PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). La réaction a lieu dans une plaque de réaction de 96 puits recouverts de couvertures optiques colle optique. Les concentrations de l'Mix Master, les amorces et les sondes sont décrites dans le Tableau 1. </li><li> Une fois le mélange a été préparé, 15μl aliquotes dans chaque puits, y compris les contrôles (voir 3.2). Le volume total pour une réaction après addition de 25 pi cible sera (mélange 15μl d'échantillon + 10 ul ou standard). </li><li> Ajouter les extractions d'acides nucléiques à partir des échantillons (10 pi) dans une zone séparée. Exécuter direct et une dilution au dixième dans l'eau purifiée de chaque échantillon en double. Couvrir les puits contenant les échantillons avec une partie d'un couvercle adhésif, gardez l'autre partie de la couverture pour l'étape suivante. </li><li> Ajouter des dilutions de la suspension standard de l'ADN (10 ul) de 10 0 à 10 6 GC/10μl par trois exemplaires, et en utilisant une micropipette utilisée exclusivement pour le stanl'ADN standard. Il est conseillé d'ajouter des normes dans un secteur équipé de rayons UV pour détruire l'ADN plasmidique et de nettoyer la micropipette après chaque utilisation. Couvrir les puits contenant les normes avec le couvercle adhésif pré-coupés. Remarque: Pour préparer des suspensions standard pour être utilisée dans la quantification de copies du génome, la région d'ADN cible doit être cloné dans un plasmide et linéarisé. Dans l'adresse suivante, vous trouverez une procédure détaillée sur la façon de créer des courbes standard avec les modèles d'ADN plasmidique à être utilisés dans qPCR: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li> Effectuez la qPCR dans un système adéquat sélectionnant les paramètres appropriés (en considérant l'utilisation de la couverture adhésif et le volume total dans chaque puits, etc.) Après activation de l'AmpliTaq Gold pendant 10 min à 95 ° C, 40 cycles d'amplification sont effectués comme suit: 15 s à 95 ° Cet 1 min à 60 ° C pour HAdV, JCPyV et BPYV, et 15 s à 95 ° C, 20s à 55 ° C et 20s à 60 ° C pour PADV. </li><li> Une fois les réactions terminées, stocker des données et des résultats tels que décrits dans le manuel de l'utilisateur de l'équipement utilisé. La quantité d'ADN va être définie comme la médiane des données obtenues après la correction du facteur de dilution si nécessaire. </li></ol></li><li> Contrôles <ol><li> Utiliser des contrôles positifs et négatifs. Le dosage doit inclure plus d'un non-modèle de contrôle (NTC) pour prouver mélange ne produit pas de fluorescence. Il est conseillé d'exécuter le contrôle des processus positifs en vue d'évaluer le potentiel d'inhibition enzymatique due aux inhibiteurs présents dans les échantillons étudiés. </li><li> Consigner les résultats des analyses qPCR de deux différentes dilutions de l'ADN standard et du contrôle de processus. Utiliser les résultats pour préparer les cartes de contrôle pour le contrôle qualité (CQ) des programmes liés à la sensibilité et l'efficacité des tests. </li></ol></li><li> Confirmation desles résultats <ol><li> Des résultats positifs peuvent être encore confirmés par séquençage PCR nichée et nucléotidiques des amplicons, la production de données supplémentaires sur les séquences nucléotidiques des souches détectées 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> Suite à la procédure décrite, les virus humains et animaux ont été détectés et quantifiés dans les eaux de baignade, l'eau de mer et des eaux fluviales 2,3. Comme un exemple représentatif, des échantillons d'eau souterraine des zones présentant des niveaux élevés de nitrates ont été évalués pour définir les sources de la contamination. Échantillons d'eau de dix litres ont été collectés à partir de 4 différents puits dans les zones rurales d'une région du nord de l'Espagne. Cinq répétitions ont été collectées dans chaque puits étant une répétition ensemencé avec deux adénovirus humain utilisé comme contrôle de processus. Les échantillons ont été traités selon le protocole représenté dans la figure 1. Les quatre répétitions analysé dans l'un des quatre sites étudiés ont montré des résultats positifs pour PADV (valeur moyenne 7,74x10 2 GC / L) qui serait lié à la présence de boues de porc dans les zones entourant le site d'échantillonnage et appuierait la contamination fécale porcine comme la source de nitrates dans les eaux souterraines (tableau 2). 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Procédure pour la détection et la quantification des virus dans l'eau. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Concentration des amorces et des sondes pour les tests qPCR. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="Tableau 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 3"> Tableau 2. Détection et quantification des adénovirus humains et animaux et les polyomavirus dans les échantillons d'eau souterraine. n nombre de répétitions analysées Pourcentage% de positifs se réplique (-) Non détecté

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

Deux demandes de brevet ont été déposées en 2009 pour protéger la propriété intellectuelle de protocoles de quantification des PADV et BPYV.

<html> La procédure décrite remplirait les conditions pour une méthode d&#39;ajustement de routine des laboratoires de santé publique et d&#39;environnement: reproductible, fiable, simple et rentable. Le protocole est simple, mais elle doit être suivie attentivement. Faible conductivité dans les échantillons sans ajout de la concentration de sels demandé l&#39;eau de mer artificielle réduirait considérablement la récupération des virus comme ce serait le cas si le temps d&#39;agitation pour la floculation est significati...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Centrifugeuse à vitesse élevée (8000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-mètre, thermomètre et conductimètre </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Plastique Longueur des tubes cm 100-200 </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile pipettes graduées jetables </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile tubes en plastique de 1,5 et 10-15 ml (Eppendorf, faucons, etc) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Des pots à centrifuger (500 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Agitateurs magnétiques et aimants (un parl&#39;échantillon) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> Les récipients en verre ou en plastique ayant un fond plat pour permettre l&#39;utilisation d&#39;agitateurs magnétiques </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Une pompe péristaltique pour enlever le surnageant (ou une pompe à vide au jet d&#39;eau) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Timer pour arrêt de l&#39;agitation après 8-10 heures </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (1N et 0,1) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Artificial sels de mer eau de mer </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> Lait écrémé (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 01:02 v / v de stériles Na 2 HPO 4 0,2 M et NaH 2 PO 4 0,2 M à pH 7,5 </td></tr><tr><td> Thiosulfate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Faire une solution à 10% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits de réaction optique (500 unités) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Optique couvre adhésives (100 unités) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan environnement PCR Master Mix 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

La contamination microbienne de l&#39;environnement représente un risque significatif pour la santé. Classique bactérienne indicateurs fécaux ont montré pour avoir des limites importantes, les virus sont plus résistants aux procédés d&#39;inactivation de nombreux standards et indicateurs fécaux n&#39;informent pas sur la source de contamination. Le développement de méthodes rentables pour la concentration de virus dans l&#39;eau et des dosages moléculaires facilite l&#39;applicabilité de virus comme indicateurs de contamination fécale et en tant que sources de pollution microbienne de suivi (MST) des outils. Les adénovirus sont des virus et des polyomavirus ADN infectant les espèces de vertébrés spécifiques, y compris les humains et sont excrétés dans les selles persistante et / ou d&#39;urine dans toutes les zones géographiques étudiées. Dans des études précédentes, nous avons suggéré la quantification des adénovirus humains (HAdV) et polyomavirus JC (JCPyV) par PCR quantitative (qPCR) comme un indice de contamination fécale humaine. Récemment, nous avons développé des tests qPCR pour la quantification spécifique du poradénovirus ciné (PADV) et polyomavirus bovin (BPYV) comme marqueurs fécaux des animaux de la contamination avec des sensibilités de 10 à 10 copies de génome par tube d&#39;essai. Dans cette étude, nous présentons la procédure à suivre pour identifier la source de contamination dans les échantillons d&#39;eau à l&#39;aide de ces outils. Comme exemple de résultats représentatifs, l&#39;analyse des virus dans les eaux souterraines présentant des niveaux élevés de nitrates est affiché. Détection des virus à faible ou modérée des eaux polluées requiert de la concentration du virus dans au moins plusieurs litres d&#39;eau dans un volume beaucoup plus petit, une procédure qui comporte généralement deux étapes de concentration en série. Cette procédure un peu lourde et la variabilité observée dans les recouvrements virale entravent de manière significative le traitement simultané d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons d&#39;eau. Afin d&#39;éliminer le goulot d&#39;étranglement causés par les procédures en deux étapes, nous avons appliqué un protocole en une seule étape développé dans Studie précédentes et applicables à une diversité de matrices d&#39;eau. La procédure comprend: l&#39;acidification des échantillons d&#39;eau de dix litres, floculation par du lait écrémé, de la sédimentation par gravité des matériaux floculées, la collecte du précipité et la centrifugation, resuspension du précipité dans un tampon phosphate 10 ml. Le concentré viral est utilisé pour l&#39;extraction d&#39;acides nucléiques viraux et les adénovirus et les polyomavirus spécifiques d&#39;intérêt sont quantifiés par qPCR. Nombre élevé d&#39;échantillons peuvent être analysés simultanément en utilisant cette méthode de concentration à faible coût. La procédure a été appliquée à l&#39;analyse des eaux de baignade, l&#39;eau de mer et d&#39;eau de la rivière et dans cette étude, nous présentons l&#39;analyse des résultats des échantillons d&#39;eau souterraine. Cette méthode quantitative à haut débit est fiable, simple et rentable.

L&#39;étude décrit une méthode rentable pour l&#39;identification de la source de contamination fécale / urinaire ou de la contamination par les nitrates dans l&#39;eau en utilisant qPCR pour la quantification spécifique du virus de l&#39;ADN humain / porcin / bovin, les adénovirus et les polyomavirus, a proposé que les outils MST.

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

La contamination microbienne de l'environnement représente un risque sanitaire important. Il a été démontré que les indicateurs fécaux bactériens classiques présentent des...

Méthode économique pour le traçage de la source microbienne en utilisant des virus humains et animaux spécifiques. Cette étude décrit une méthode économique permettant d'identifier la source de contamination fécale ou urinaire, ou encore de contamination par des nitrates dans l'eau, grâce à la PCR quantitative pour la quantification spécifique de virus ADN porcins, bovins et humains, d'adénovirus et de polyomavirus proposés comme outils de traçage de la source microbienne. Nous avons mis au point un protocole de concentration des virus à partir d'échantillons d'eau de 10 litres par floculation organique, d'extraction des acides nucléiques viraux à partir du sédiment au moyen de lait écrémé, et de quantification des virus ADN humains, bovins ou porcins par PCR quantitative.Il est bien connu que la contamination microbienne de la vitamine représente un risque sanitaire important et nous devons connaître les sources de cette contamination. Nous avons proposé l'utilisation de virus à ADN hautement prévalents comme outils de traçage des sources microbiennes. Les virus sélectionnés sont les adénovirus et les polyomavirus.Ces virus sont excrétés de manière persistante tout au long de l'an

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Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d'ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

test à haut débit d'agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN par PCR à l'échelle nanométrique est décrit en utilisant un chien syndromique et le panneau PCR respiratoire équine.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Un anion exchange résines méthode, adaptée au liquide impingement base bioaérosols prélèvement d’échantillons de virus est démontrée. Lorsqu’il est couplé avec la détection moléculaire en aval, la méthode permet une détection facile et sensible des virus de bioaérosols.

Détection des virus de bioaérosols à l’aide de résine échangeuse d’anions

Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.

Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

Nous présentons un protocole qui combine l’amplification de la polymérase recombinase avec un système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN et construisons une microscopie portable pour smartphone avec une classification assistée par l’intelligence artificielle pour la détection des virus à ADN au point de service.

Système de détection de virus à ADN basé sur RPA-CRISPR/Cas12a-SPM et Deep Learning

Nous présentons ici un flux de travail rapide et rentable pour caractériser les génomes du virus de la rage (RABV) à l’aide de la technologie nanopore. Le flux de travail vise à soutenir la surveillance fondée sur la génomique à l’échelle locale, en fournissant des informations sur les lignées de RABV en circulation et leur placement dans les phylogénies régionales afin d’orienter les mesures de lutte contre la rage.

Séquençage du génome entier pour la caractérisation rapide du virus de la rage à l’aide de la technologie des nanopores

Ici, nous décrivons un immunodosage fluorescent multiplex nouvellement développé qui utilise un système de cytométrie en flux à double rapporteur pour détecter simultanément deux épitopes uniques de protéine de pointe sur des particules virales intactes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère sévère (SRAS-CoV-2) qui avaient été capturées par des microsphères magnétiques couplées à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2.

Profilage d’épitopes de protéines de surface sur des particules virales par stratégie de double rapporteur multiplex

Découvrez une méthode économique pour le suivi des sources microbiennes par quantification d'adénovirus et de polyomavirus humains, porcins et bovins par qPCR dans l'eau.

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

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