Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

L’objectif global de cette expérience est de quantifier la dynamique de l’actine corticale par spectroscopie de corrélation d’images après acquisition par réflexion interne totale, imagerie par éclairage structuré ou simulation de gazon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biophysique, telles que le rôle du flux d’actine corticale dans la régulation des interactions au niveau de la synapse immunologique. Le principal avantage de la technique est qu’elle combine une résolution à l’échelle nanométrique avec une compatibilité avec le mode de vie, ce qui permet d’observer et d’analyser des processus à plus petite échelle par rapport aux techniques de microscopie conventionnelles.

La démonstration de cette technique sera faite par George Ashdown, un doctorant de mon laboratoire. Pour un échantillon d’essai, ajoutez cinq microlitres d’une solution mère de microsphères fluorescentes de 100 nanomètres de diamètre à la surface d’une lamelle fraîche non traitée. Étalez ensuite la solution de microsphères sur la lamelle à l’aide d’une pointe de pipette et laissez-la sécher.

Ajoutez 200 microlitres de support de montage à la cale de test pour préparer le début de l’imagerie, allumez l’incubateur pour le chauffage de scène du système SIM de gazon et remplissez le réservoir d’eau distillée pour couvrir entièrement la base de l’élément chauffant. Laissez l’eau s’équilibrer à 37 degrés Celsius. Connectez le collier chauffant à la lentille de l’objectif et réglez-le à 37 degrés Celsius.

Fixez ensuite le bloc gradueur compatible Turf 4 88 dans le trajet lumineux du microscope pour vous assurer que le bon chemin optique est engagé. Basculez le mode de canal sur le lit laser sur la position unique. Répétez cette action pour le câble à fibre optique sur la platine du microscope.

Attendez-vous à voir une erreur dans la fenêtre du logiciel si ces étapes ne sont pas effectuées. Après avoir réglé le mode, abaissez l’objectif au plan Z le plus bas et placez une goutte d’huile dessus. Placez la lamelle de l’échantillon de test avec les microsphères fluorescentes sur la platine du microscope.

Sélectionnez ensuite le système de mise au point ou la fonction PFS parfait sur le corps du microscope. Déplacez progressivement l’objectif vers le haut à travers le plan Z et arrêtez-vous lorsque le bouton PFS cesse de clignoter, ce qui indique que le plan focal a été atteint sur le logiciel de contrôle. Passez en mode en direct pour imager les microsphères à l’écran.

Effectuez des réglages précis de la mise au point à l’aide de la molette micromanipulatrice PFS. Observez un éclairage uniforme sans soumission fluorescente floue au-dessus de l’onde olfactive de 75 nanomètres. Enfin, confirmez que l’éclairage structuré est obtenu en observant un modèle d’éclairage fluctuant à partir de l’échantillon de microsphère fluorescente pour la stimulation des cellules T dans les chambres d’un huit.

Puits de couverture avec 200 microlitres de mélange d’anticorps anti CD trois et anti CD 28 et incubez la lame de couverture pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé la lamelle comme décrit dans le protocole de texte, placez-la sur la platine du microscope, puis trouvez le plan focal du gazon. Ensuite, pipetez doucement 200 microlitres de lymphocytes T transfectés dans l’un des puits de la lamelle.

Utilisez l’épifluorescence pour suivre les cellules transfectées de l’actine GFP lorsqu’elles atterrissent sur la lamelle. Une fois les cellules installées, passez en mode direct à l’aide du N SimPad et vérifiez que les cellules du moniteur sont actives. Pour enregistrer un parcours temporel, ouvrez la fenêtre d’acquisition ND et sélectionnez l’onglet temps.

Cliquez ensuite sur Ajouter et définissez l’intervalle sur aucun délai. Réglez la durée sur 10 minutes. Enfin, lancez l’enregistrement des données en sélectionnant Exécuter maintenant dans la fenêtre d’acquisition ND.

Pour reconstruire les images, ouvrez d’abord le logiciel d’analyse contenant le module d’analyse approprié. Cliquez sur applications, puis sélectionnez la fenêtre afficher la fin de la simulation. Réglez la modulation d’éclairage, le contraste et la suppression du bruit haute résolution sur un et reconstruisez l’ensemble des données SIM pour produire une image SIM complète à partir de la barre d’état de l’image.

Vérifiez que la taille de pixel est de 30 nanomètres, puis exportez les données sous forme de fichiers TIF pour l’analyse du bâton. Après avoir téléchargé et extrait le progiciel sticks MATLAB, ouvrez le script. Définissez ensuite les paramètres d’entrée comme indiqué dans le protocole texte pour le filtre de suppression immobile.

À la ligne 23, définissez le paramètre de filtrage sur la moyenne mobile et à la ligne 24, utilisez 21 comme paramètre de moyenne de déplacement pour générer une carte vectorielle. Définissez la sous-région temporelle de la ligne 31 sur le nombre maximum d’images, dans ce cas 63. Ensuite, à la ligne 32, définissez le décalage temporel sur un dans les lignes 33 à 35.

Entrez les noms des fichiers de sortie, les titres des cartes vectorielles de sortie et le chemin d’accès au répertoire de sortie. Définissez ensuite le format dans lequel les images de la carte vectorielle doivent être enregistrées. Dans ce cas, png.

Dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB, ouvrez le script. Exécutez un stick de canal et chargez la série d’images en parcourant les lignes un à 23 du script. Ensuite, les lignes 29 à 35 de la série d’un canal sont bloquées.

Pour démarrer l’analyse du bâton, suivez l’invite et sélectionnez un polygone pour définir une région d’intérêt ou un retour sur investissement si vous le souhaitez. Pour afficher les cartes vectorielles, exécutez les lignes 38 à 52. Ensuite, exécutez les lignes 53 à 72 pour tracer l’histogramme de magnitude de vitesse montré ici est une cellule T OT exprimant la GFP marquée F actine, qui a été imagée avec le protocole turf sim.

Discuté dans le texte cinq minutes après que cette cellule ait été introduite sur une lamelle recouverte d’anticorps anti CD trois et anti CD 28 destinés à stimuler la formation de synapses immunologiques. Un cours temporel a été pris pour que le flux moléculaire de l’actine f puisse être visualisé. L’analyse ultérieure de ces données à l’aide de ce programme de bâtonnets a permis de quantifier le flux moléculaire d’actine F tel que représenté par cette carte vectorielle correspondant à la région encadrée de la cellule de gauche, qui représente une partie de la périphérie de la synapse.

Un grossissement supplémentaire de cette carte et de la sous-région des cellules T clarifie la directionnalité et la vitesse du flux d’actine, qui peuvent être déterminées à partir de la longueur du vecteur ainsi que du code couleur. Les données de vitesse peuvent également être tracées dans un histogramme, ce qui permet une analyse statistique. Collectivement, ces résultats montrent que dans la synapse immunologique F, l’actine s’écoule de manière symétrique de la périphérie vers le centre cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’acquérir des données et d’analyser la dynamique de l’actine corticale à l’aide de la spectroscopie de corrélation d’images.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour mieux comprendre le flux d’actine pendant la migration des lymphocytes T, elle peut également être utilisée dans d’autres systèmes où le flux moléculaire est considéré comme important, comme la migration cellulaire.