Name: Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Découvrez comment activer les lymphocytes T avec un peptide-MHC photoactivable pour contrôler précisément le signal spatio-temporel. Cette méthode permet d'étudier la transduction rapide des signaux localisés et les réponses cellulaires polarisées.

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Nous remercions les membres du laboratoire Huse de conseils et d’assistance. Soutenu par les US National Institutes of Health (R01-AI087644 à M.H.) et P30-CA008748 au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. préparation des Surfaces vitrées stimulateur
<ol><li>Manteau huit puits chambré compartimentée avec biotinylé poly-L-lysine (Bio-PLL) dilué à 1/500 dans l’eau distillée, déminéralisée (ddH2O). Incuber 30 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Laver avec H2O.</li>
	<li>Sec pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Bloc Bio-PLL enduit les surfaces avec un tampon de blocage (HEPES salin [10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM], avec 2 % de BSA) pendant 30 min à température ambiante.<ol>
<li>Dissoudre 5 mg de bromhydrate de poly-L-lysine dans 1 mL de 10 mM NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Ajouter 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotine (provenant d’un stock de 100 mg/mL dans le DMSO) et vérifier le pH de la réaction. Si le pH est inférieur à 8,5, ajouter 2 μL de 4 N NaOH pour s’élever entre pH 8,5 et 9,5.</li>
		<li>Vortex pendant 30 min.</li>
		<li>Étancher la réaction avec 50 μL de glycine 100 mM dissous dans 20 mM Tris pH 8.0.</li>
		<li>Tourner à pleine puissance pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. NOTE : Qualité Bio-PLL est généralement comparée aux précédentes préparations par revêtement double dilutions successives du matériel sur une plaque de 96 puits ELISA et de quantifier la teneur en biotine après que incubation à la phosphatase alcaline couplé streptavidine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer le tampon de blocage. Ne laissez pas les puits à sec. Ajouter streptavidine (100 µg/mL dans un tampon de blocage). Incuber pendant 1 heure à 4 ° C.</li>
	<li>Laver à HBS. Remplir et inverser puits diapositive Chambre 4 - 5 fois, retirer les puits HBS. Ne laissez pas les puits à sec.</li>
	<li>Ajouter les biotinylé SPHL ligands et les molécules d’adhérence à la surface. NOTE : MCC et ovules peuvent être photocaged en ajoutant les ortho-nitrobenzyle basé des groupes protecteurs (p. ex. nitrophenylethyl (NPE) ou nitroveratryloxycarbonyl (CONV)) pour le groupement ε-aminé de lysines clés (K12 dans MCC, K7 en ovules). Photocaged MCC et ovules peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux. Après reconstitution dans un tampon aqueux, elles sont repliés dans exprimée par les bactéries j’ai-Ek et H2-Kb en utilisant des approches établies11,12.</li>
	<li>Validation du peptide de CMC ou ovules photoactivatable<ol>
<li>Decage protégé par CONV peptides par UV irradiation avec une poche lampe UV (voir Table des matières) pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Impulsion 1,0 x 105 TTB avec 1 µM du peptide nonstimulatory (témoin négatif, par exemple Hb), irradiés photoactivatable peptide, peptide photoactivatable irradiés et le peptide de l’agoniste (contrôle positif, par exemple, MCC) pendant 1 h à une nuit à 37 ° C.</li>
		<li>Pour stimuler les lymphocytes T exprimant le 5C. C7/2 b 4/et TCR, utiliser des cellules CH12 ou B C27. Pour stimuler les lymphocytes T OT1, utilisez RMA-s ou cellules de thymome EL4.</li>
		<li>Mélanger les TTB pulsés avec un nombre égal de lymphocytes T de 96 puits autour des plaques de fond à un volume final de 200 µL. Incuber à 37 ° C pendant 12 à 24 heures.</li>
		<li>Récupérer le surnageant de chaque puits et analyser IL-2 par ELISA avec détection colorimétrique de la Streptavidine-raifort peroxydase. NOTE : Confirmation de l’état de mise en cage des tous les peptides par spectrométrie de masse electrospray avant de replier en complexes MHC, est fortement recommandé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer le pliage et la purification du CMH afin de minimiser l’exposition à la lumière. Par exemple, envelopper le pliage des réactions dans le papier d’aluminium et réaliser la chromatographie par filtration sur gel avec la lampe UV. NOTE : Il a été constaté que photoactivatable MCC-je-Ek et OVA - H2-Kb induire l’activation de cellule indépendante de T UV à haute densité, probablement à cause d’une cage fonctionnelle incomplète. Par conséquent, la SPHL photoactivatable est diluée dans un excès de x 10-30 de nonstimulatory SPHL(par exemple j’ai-Ek contenant le peptide de64 à 76 de l’hémoglobine (Hb)) au cours de l’étape de l’immobilisation. Cela améliore le rapport signal sur bruit de l’expérience d’imagerie ultérieure.</li>
	<li>À photoactivate CD4+ T cellules, collectivement utilisent un mélange de biotinylé Hb-je-Ek (3 µg/mL), biotinylé photoactivatable MCC-je-Ek (0,1 µg/mL) et anticorps biotinylé contre la classe I de MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). les anticorps anti-H2-Kk encourage les 5 C. Cellules C7/2 b 4/AND T, qui expriment H2-Kk, à se répandre sur la surface du verre sans subir d’activation.</li>
	<li>Pour CD8+ T des cellules, utilisez un mélange de biotinylé H2-Db portant le peptide KAVYDFATL (1 µg/mL), photoactivatable biotinylé OVA-H2-Kb (0,1 µg/mL) et le domaine extracellulaire de la molécule d’adhésion ICAM-1 (2 µg/mL produit par insectes cell culture13). L’ICAM-1 encourage la formation serrée de contact en engageant l’intégrine LFA1 sur la surface des cellules T.</li>
	<li>S’applique à tous les mélanges de protéines dans un tampon bloquant, suivie d’une incubation de 1 h à RT ou au moins 2 h à 4 ° C. Remarque : La densité moléculaire sur les surfaces de ce type à être ~ 8000 par µm2 a été préalablement déterminée6. Étant donné que photoactivatable SPHL représente ~1/30th de la protéine biotinylé sur la surface, sa densité sera ~ 267 molécules par µm2, avant decaging.</li>
	<li>Lavez comme à l’étape 1.6 et laisser au HBS jusqu'à utilisation.</li>
	<li>Ajouter 200 000 CD4+ ou CD8+ T cellules exprimant le TCR approprié dans chaque puits et permettre aux cellules d’adhérer à 37 ° C pendant 15 min. Une fois que les cellules ont attaché à et répartis sur la surface, ils sont prêts pour la photoactivation et l’imagerie. Remarque : Retroviral transduction de cellules effectrices T avec imagerie sondes fluorescente est décrit en détail ailleurs6,7. Signalisation calcique peut également être étudiée en utilisant des cellules de T untransduced chargés avec le colorant photosensible calcium Fluo-4,6. Le colorant ratiométrique Fura-2 n’est pas recommandée car elle nécessite d’excitation dans l’ultraviolet, ce qui induit aussi une decaging de la SPHL photoactivatable.</li>
</ol>2. Acquisition d’images
<ol><li>Utiliser un microscope inversé de la FRBR équipé d’un objectif X UV 150 compatibles pour l’acquisition d’images. UV irradient les régions définies par l’utilisateur en utilisant un système de membrane numérique attaché à une lampe à mercure 100 W (HBO). Lumière de cette lampe sur l’échantillon à l’aide d’un miroir de longue passe 400 nm directe UV.</li>
	<li>Utiliser un logiciel analyse image photoactivation localisée et acquisition de Time-lapse. Dans la plupart des expériences, surveiller les sondes dans les canaux verts et rouges à l’aide de 488 nm et lasers à excitation 561 nm, respectivement. La lumière laser est dirigée sur l’échantillon à l’aide d’un miroir dichroïque dual-passe-bande qui transmet également dans la gamme UV (pour permettre à decaging). S’il vous plaît voir la Table des matières et la Figure 6 pour plus d’informations sur la configuration de microscope.</li>
	<li>Après avoir monté la diapositive chambre contenant les cellules T, ajuster les paramètres pour obtenir l’illumination FRBR ou épifluorescence, si nécessaire. En mode direct, sélectionnez un champ de cellules qui expriment les sondes fluorescentes d’intérêt. Établir des régions à l’échelle du micron pour photoactivation sous des cellules individuelles à l’aide du logiciel de contrôle.</li>
	<li>Commencer l’acquisition de Time-lapse. En règle générale, 80 points sont acquis, avec un intervalle de 5 s entre chaque point dans le temps. Ce qui laisse plus de suffisamment de temps pour séquentiel 488 nm et 563 expositions nm, dans le cas d’expériences bicolore.</li>
	<li>Après 10 h, photoactivate les régions sélectionnées en ouvrant le diaphragme numérique d’obturation de 1 à 1,5 s.</li>
	<li>Après que le laps de temps est terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répéter le processus.</li>
</ol>3. analyse des données
NOTE : Localisée photoactivation de ligands immobilisés crée une zone de stimulateur bien définie et fixe qui peut être utilisée pour l’analyse quantitative de la signalisation des réponses et des événements de remodelage du cytosquelette. Analyse des protocoles consistent généralement en quantifier l’intensité de la fluorescence au sein de la région irradiée ou à l’aide de la région irradiée, pour les mesures de distance comme un paramètre positionnel (e.g. pour évaluer la polarisation du centrosome à la région irradiée). Les deux protocoles d’analyse sont décrites ci-dessous. Divers programmes d’analyse interactive image peuvent servir à rendre l’intensité et les mesures de distance, qui peuvent ensuite être sortie pour un traitement supplémentaire et l’analyse.
<ol><li>
Intensité de la fluorescence
	<ol>
<li>Déterminer l’intensité de fluorescence (FI) d’une région de fond à l’extérieur de la cellule (FIb). Cela sera utilisé pour la correction de fond.<ol>
<li>Dessiner une zone carrée taille micron à l’extérieur de la cellule et faire un masque. Pour déterminer l’intensité de la fluorescence, cliquez sur Analyze | Masquer les statistiques. Sélectionnez Moyenne intensité de Fluorescence et d’exporter les valeurs. Remarque : Les détails de procédure (p. ex. 3.1.1.1) reportez-vous au logiciel Slidebook (voir la Table des matières). Mise en œuvre du présent protocole à l’aide d’autres logiciels (par ex.., Fidji) sera légèrement différente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Déterminer la FI dans cette région de photoactivation pour chaque point dans le temps.<ol>
<li>Sélectionnez le masque pour mettre en évidence la région qui a été photoactivées. Pour déterminer l’intensité de la fluorescence, cliquez sur Analyze | Masquer les statistiques. Sélectionnez Moyenne intensité de Fluorescence et d’exporter les valeurs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Soustraire l’arrière-plan FI partir des valeurs mesurées des FI au sein de la région. Puis, de normaliser les mesures FI corrigées en divisant par la moyenne, FI des 9 premiers cadres avant de photoactivation de référence corrigée. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). NOTE : Le graphique ΔF/F comme une fonction du temps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distance
	<ol>
<li>Obtenir le x et y coordonnées du centre de la région de photoactivation.<ol>
<li>Pour déterminer x et y coordonnées du centre de la région de photoactivation, sélectionnez masque pour mettre en évidence la région qui a été photoactivées. Une fois que la région de photoactivation est mis en surbrillance, sélectionnez Analyze | Masquer les statistiques | Centre de la zone et exporter les valeurs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Déterminer x et y les coordonnées pour la sonde fluorescente d’intérêt pour chaque point dans le temps. Ceci est généralement réalisé par suivi de particules manuel ou automatisé.<ol>
<li>Pour déterminer x et y coordonnées de la sonde fluorescente d’intérêt, sélectionnez Manuel Particle Tracking et cliquez sur la sonde fluorescente d’intérêt au fil du temps. Une fois que tous les points dans le temps ont été l’objet d’un suivi, sélectionnez Analyze | Masquer les statistiques | Centre de la zone et exporter les valeurs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calculer la distance entre la protéine fluorescente d’intérêt et le centre de la région de photoactivation pour chaque point de temps à l’aide de l’équation : Distance = √ ((x2- x1)2+ (y2an -1)2), où x2 et y2 représentent les coordonnées de la protéine fluorescente d’intérêt et x1 et y1 sont les coordonnées du centre de la région de photoactivation.</li>
		<li>Le graphique de la distance en fonction du temps.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces dernières années, la lumière a émergé comme un excellent outil pour activation spatio-temporelle contrôlée des processus cellulaires. Diverses méthodes ont été développées, chacune avec les inconvénients et les avantages associés. Le système décrit ici, qui repose sur la decaging des ligands immobilisés, extracellulaires, est parfaitement adapté pour l’analyse des réponses de signalisation rapides, subcellulaires, polarisées. Cette approche a été appliquée afin d’examiner la formation IS dans les cellules de T comme ...

Les lymphocytes T (cellules T) jouent un rôle central dans l’immunité cellulaire en reconnaissant les peptides antigéniques affichées dans le contexte de la surface de la cellule MHC. Reconnaissance de l’antigène, qui est véhiculée par le TCR, entraîne la différenciation des cellules naïves T et fait la promotion de la fourniture de réponses cytolytiques et communicatifs par les populations de l’effecteur. Engagement de TCR induit également des changements dramatiques dans l’architecture cellulaire. En quelques minutes, les cellules T gloms sur le côté de la cellules présentatrices d’antigène (APC), formant une interface polarisée appelée la synapse immunologique (IS)1,2. L’IS potentialise les réponses effectrices des lymphocytes T en permettant la sortie directionnelle des cytokines ou, dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques (CTL), des protéines lytiques qui détruisent l’APC.
Engagement de TCR par SPHL induit la phosphorylation rapide de plusieurs molécules d’adaptateur en aval, y compris l’éditeur de liens pour l’Activation des cellules T (LAT), qui favorise en fin de compte robuste remodelage du cytosquelette synaptique2. Filaments d’actine cortical (actine-F) pousse les lymphocytes T s’étendant sur la surface de l’APC et puis il résout en une structure annulaire caractérisée par l’accumulation de F-actine à la périphérie de l’IS et l’appauvrissement de la couche du centre. Formation d’actine F anneau est étroitement couplée à une réorientation du centre organisateur de microtubules (MTOC, également appelée centrosome dans les lymphocytes T) à un poste juste en dessous du centre de l’interface. Les deux événements se produisent dans les minutes suivant la reconnaissance de l’antigène initial et établissent le contexte architectural dans lequel les événements d’activation ultérieure et effectrices réponses se produisent.
Pour étudier la formation IS, différents laboratoires ont mis au point des approches dont l’APC est remplacé par une surface de verre qui contient immobilisée TCR ligands ou prend en charge une bicouche lipidique que lui-même contienne les ligands3,4. Les lymphocytes T forment IS-comme contacts sur ces surfaces qui peuvent être photographiées par microscope à fluorescence réflexion totale interne (FRBR) ou microscopie confocale, permettant des études à haute résolution d’activation des cellules T et formation IS.
Bien que ces approches ont permis pour l’excellente visualisation de l’IS entièrement assemblé, une grande partie de la signalisation de la ligature TCR:pMHC suivante se produit quelques secondes, ce qui complique les efforts pour déterminer la séquence des événements après l’activation de la TCR avec précision . Pour contourner ce problème, une approche de photoactivation a élaboré, dans lequel photoactivatable SPHL est utilisé pour obtenir un contrôle spatio-temporelle du TCR activation5,6,7. Dans ce système, les cellules T sont attachés aux surfaces de verre contenant la SPHL photoactivatable qui est non-stimulateur pour le TCR jusqu'à irradié par la lumière ultraviolette (UV). L’irradiation UV d’une région de microns de taille de la surface sous la cellule T supprime la photocage création d’une zone de stimulation qui peut être reconnue par les lymphocytes T. Les événements ultérieurs de signalisation et le remodelage du cytosquelette sont contrôlés puis à l’aide de reporters fluorescents génétiquement encodés. Deux versions de photoactivatable de peptides antigéniques, lépidoptère du cytochrome c88-103 (MCC) et l’ovalbumine257-264 (OVA), qui sont présentés dans le contexte de la classe II de MHC I-Ek et de la classe I de MHC H2-Kb, respectivement, ont été développés (Figure 1). Cela permet l’analyse des deux CD4+ T des cellules spécifiques pour MCC-je-Ek (exprimant la 5C. C7, 2 b 4, ou AND TCRs) et CD8+ T des cellules spécifiques d’ovules-H2-Kb (exprimant le TCR OT1).
Ces dix dernières années, l’approche de photoactivation et imagerie de TCR a été utilisé pour établir la cinétique précise TCR premières étapes de la signalisation et aussi d’identifier les voies moléculaires qui régissent le remodelage du cytosquelette polarisée5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. par exemple, le test a joué un rôle important dans la détermination de cette centrosome réorientation vers l’APC est médiée par un gradient localisé de lipides deuxième messager diacylglycérol centré à l’IS. Il est prévu que cette méthodologie continueront d’être précieux pour des applications exigeant une analyse d’imagerie à haute résolution de la fonction des cellules T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Coverglass chambré</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Devra fabriquer du Poly-L-Lysine biotinylé</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Devra fabriquer du Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>biotinylé Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500 : Kit de réaction standard biotine-protéine ligase BirA</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Sera utilisé pour biotinyler les protéines</td></tr><tr><td>biotinylées Hb I-EK&nbsp ; </td><td></td><td></td><td>Pour le repliement des protéines, voir référence 6. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA</td></tr><tr><td>Biotinylé NPE-MCC I-EK&nbsp ; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) peut être acheté auprès d’Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha ; Anticorps H2-Kk</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>NPE-OVA biotinylé H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) peut être acheté auprès d’Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp ;</td><td>Les</td><td>protéines synthétisées personnalisées Anaspec (KAVYDFATL) peuvent être achetées auprès d’Anaspec</td>Biotinylated ICAM1.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Pour le repliement des protéines, voir la référence dans le protocole. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA</td></tr><tr><td>Lampe UV portative</td><td>La</td> lampe <td>UVP UVGL-25</td><td>est maintenue à 1 cm de l’échantillon.&nbsp ; 30 s de lumière 365 suffisent pour un décageage détectable, 20 min pour un décageage quantitatif.</td></tr><tr><td>Système TIRF Olympus IX-81 OMAC.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Vous trouverez des informations supplémentaires sur le système d’imagerie dans Figure 6</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>software Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

contrôle spatial et temporel de l’activation des cellules t à l’aide d’un agoniste photoactivatable

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Lymphocytes T engagent rapide, polarisée de signalisation, survenant dans les minutes suivant l’activation de TCR. Cela induit la formation de la synapse immunologique, une jonction cellule-cellule stéréotypés qui régule l’activation des cellules T et les cibles directionnellement réponses effectrices. Pour étudier efficacement ces processus, il faut une approche d’imagerie adaptée afin de pouvoir saisir les réponses rapides, polarisées. Ce protocole décrit un tel système, qui repose sur une photoactivatable peptide-major complexe d’histocompatibilité (SPHL) qui est non-stimulateur jusqu'à ce qu’elle est exposée aux rayons ultraviolets. Decaging ciblée de ce réactif au cours d’expériences de vidéomicroscopie permet un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation de TCR et surveillance haute résolution des réponses cellulaires ultérieures par réflexion totale interne (FRBR) d’imagerie. Cette approche est également compatible avec les stratégies de perturbations génétiques et pharmacologiques. Cela permet l’assemblage des voies moléculaires bien définis qui relient le TCR de signalisation à la formation des structures du cytosquelette polarisées qui sous-tendent la synapse immunologique.

L’approche de photoactivation et imagerie permet d’observation et quantification facile des réponses signalisation rapides, polarisées. Pour illustrer ses capacités, reproduites ici est une expérience examinant la corrélation spatio-temporelle entre l’accumulation induite par le TCR DAG et réorientation du centrosome. 5 C. Explosions de cellule C7 T ont été retrovirally transduites avec deux reporters fluorescents : un biocapteur DAG contenant les domaines de C1 en tandem de la protéine k...

Ce protocole décrit une méthode basée sur l’imagerie pour activer les lymphocytes T à l’aide de photoactivatable peptide-MHC, permettant un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation des cellules T.

Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

L’objectif général de ce protocole est de décrire l’utilisation du CMH peptidique photoactivable pour induire une signalisation polarisée dans les lymphocytes T. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la transduction des signaux des cellules immunitaires, telles que la façon dont les lymphocytes transduisent des signaux localisés rapides, puis montent des réponses cellulaires polarisées à ces signaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un contrôle spatio-temporel de la signalisation des lymphocytes T.Pour ce faire, il fixe le moment et l’emplacement précis de l’activation des récepteurs des lymphocytes T. La démonstration de la procédure sera faite par Elisa Sanchez, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Commencez par ajouter de la poly-L-lysine biotinylée, ou bio-PLL, diluée de un à 500 dans de l’eau distillée déminéralisée dans un verre de couverture à huit compartiments.Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, laver à l’eau distillée déminéralisée, puis sécher pendant deux heures à température ambiante. Bloquez les surfaces revêtues de bio-PLL avec un tampon de blocage composé d’une solution saline tamponnée HEPES avec 2 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante.Après l’incubation, retirer le tampon de blocage des surfaces revêtues de bio-PLL sans laisser les puits sécher. Ajoutez ensuite la streptavidine et incubez à quatre degrés Celsius. Au bout d’une heure, lavez les surfaces revêtues de HBS.Remplissez et retournez les puits de la chambre quatre à cinq fois, en retirant le HBS des puits. Ne laissez pas les puits sécher. Ajoutez le peptide photoactivable biotinylé spécifique, les ligands du complexe majeur d’histocompatibilité et les molécules d’adhésion pour les lymphocytes T CD4 positifs ou les cellules CD8 positives aux surfaces revêtues de bio-PLL.Protéger de la lumière et incuber pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver comme avant et laisser dans HBS jusqu’au moment de semer. Enfin, ajoutez 200 000 lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs exprimant le TCR approprié dans les puits appropriés et laissez les cellules adhérer à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Une fois que les cellules se sont fixées et se sont répandues à la surface, elles sont prêtes pour la photoactivation et l’imagerie. Utilisez un microscope à fluorescence à réflexion interne totale inversée équipé d’un objectif 150X compatible UV pour l’acquisition d’images. Surveillez les sondes dans les canaux vert et rouge à l’aide de lasers d’excitation de 488 nanomètres et 561 nanomètres, respectivement.Après avoir monté la lame de chambre contenant les lymphocytes T, ajustez les paramètres du microscope pour obtenir un éclairage TIRF ou d’épifluorescence, si nécessaire. En mode Live, sélectionnez un champ de cellules qui expriment les sondes fluorescentes d’intérêt. Établissez des régions à l’échelle du micron pour la photoactivation sous les cellules individuelles à l’aide d’un contrôle logiciel.Ensuite, lancez l’acquisition. En règle générale, 80 points de temps sont nécessaires avec un intervalle de cinq secondes entre chacun. Cela laisse du temps pour des expositions séquentielles de 488 nanomètres et de 563 nanomètres dans le cas d’expériences bicolores.Ensuite, après avoir acquis 10 points de temps, photoactivez les régions sélectionnées en ouvrant l’obturateur à diaphragme numérique pendant une à 1,5 seconde. Une fois le laps de temps terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répétez le processus. Commencez par déterminer l’intensité de fluorescence d’une région d’arrière-plan à l’extérieur de la cellule à utiliser pour la correction d’arrière-plan.Dessinez une région carrée de la taille d’un micron à l’extérieur de la cellule et créez un masque. Pour déterminer l’intensité de fluorescence, cliquez sur Analyser, Statistiques du masque. Sélectionnez Intensité moyenne de fluorescence et exportez les valeurs.Déterminez l’intensité de fluorescence dans la région photoactivée pour chaque point temporel. Sélectionnez Masque pour mettre en surbrillance la région qui a été photoactivée. Pour déterminer l’intensité de fluorescence, cliquez sur Analyser, Statistiques du masque.Sélectionnez Intensité moyenne de fluorescence et Exporter les valeurs. Obtenez les coordonnées X et Y du centre de la région photoactivée en sélectionnant Masque pour mettre en surbrillance la région photoactivée. Une fois la région de photoactivation mise en surbrillance, sélectionnez Analyser, Masquer les statistiques, Centre de la zone et Exporter les valeurs.Déterminez les coordonnées X et Y de la sonde fluorescente d’intérêt. Sélectionnez Suivi manuel des particules et cliquez sur la sonde fluorescente qui vous intéresse au fil du temps. Une fois que tous les points temporels ont été suivis, sélectionnez Analyser, Masquer les statistiques, Centre de la zone et Exporter les valeurs.Les lymphocytes T ont été fixés à un verre de couverture chambré contenant du MCC-IEFK photoactivable. C1-GFP, une sonde pour le second messager lipidique DAG, a été imagé à l’aide de la microscopie TIRF et de la tubuline RFP en mode épifluorescence. La photoactivation localisée de la surface sous le lymphocyte T induit l’accumulation de DAG dans la zone irradiée.S’ensuit en quelques secondes la réorientation du centrosome vers la même région. L’accumulation de C1-GFP peut être quantifiée en calculant l’intensité de fluorescence normalisée après correction du bruit de fond au centre de la région photoactivée au fil du temps. La réorientation du centrosome en réponse à la photoactivation peut être quantifiée en calculant la distance entre le centrosome et le centre de la région photoactivée en fonction du temps.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une journée si elle est exécutée correctement. Nous générons généralement 15 à 20 films en accéléré pour l’analyse dans ce laps de temps. Cette approche a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la cinétique et la polarisation précises de la signalisation d’activation dans les lymphocytes T.Il a également été adapté pour étudier la signalisation inhibitrice dans les cellules tueuses naturelles. En conséquence, nous avons maintenant une meilleure compréhension de la façon dont les interactions cellulaires immunitaires communicatives sont assemblées et dissoutes.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Procédé pour spatio-temporel de commande de l'activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l'irradiation permet l'activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Cette vidéo présente une méthode de décageage d’un complexe photoactivable d’histocompatibilité peptide-majeur à l’aide de l’irradiation UV. Le processus de décaging expose la séquence peptidique native, permettant une activation précise des lymphocytes T.

Évaluation de l’activation contrôlée des lymphocytes T avec un CMH peptidique photoactivable

Nous décrivons une méthode d'imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d'activation des lymphocytes T. Nous démontrons l'utilisation combinée de la cellule T test d'épandage, microscopie confocale et analyse d'imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l'activation des lymphocytes T.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Ici, une procédure permettant d’activer sélectivement une protéine neuronale avec une courte impulsion de lumière en codant génétiquement un acide aminé non naturel photo-réactif dans une protéine neuronale cible exprimée dans les neurones en culture ou in vivo est présentée.

Contrôle optique d&#39;une protéine Neuronal L&#39;utilisation d&#39;un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

Dans ce protocole, "cage" protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.

Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle

Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Ce protocole décrit l’utilisation de la seule chaîne CMH de classe I complexes pour étudier les interactions moléculaires dans l’activation des lymphocytes T CD8 + humaine : des constructions de génération d’ingénierie antigène présentant des cellules exprimant la seule chaîne, culture de clone humain de cellules T CD8 + et les expériences d’activation des cellules T.

Utilisation de la technologie MHC seule chaîne d’enquêter sur les Co-agonisme dans l’Activation des cellules T humaines CD8 +

Ce protocole décrit la génération des chimères de moelle épinière murine mixte avec spontanée centres germinaux auto-immune, dans laquelle autoréactifs lymphocytes portent un reporter de la protéine fluorescente verte (GFP-PA) photoactivatable. Cela offre la possibilité de lier la localisation cellulaire dans les tissus avec des analyses moléculaires et fonctionnelles en aval.

Interroger les centres germinatifs autoréactifs individuels par Photoactivation dans un modèle mixte chimérique de l’auto-immunité

Ce protocole décrit l’application d’un domaine d’interrupteur allostérique activé par la lumière bleue (LightR) pour un contrôle spatio-temporel réversible de l’activité protéique. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, cette étude propose un protocole élaboré pour développer et caractériser la Src régulée par la lumière (LightR-Src). Il démontre la polyvalence de cette approche dans toutes les classes d’enzymes.

Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Ce protocole décrit les étapes essentielles pour la culture des lymphocytes T primaires, y compris leur isolement, leur activation, leur expansion et leur transfection transitoire par électroporation d’ARNm. De plus, un flux de travail et un panel d’anticorps pour l’analyse cytométrique en flux du phénotype, des marqueurs d’activation, de la viabilité et de l’expression du récepteur antigénique chimérique (CAR) sont proposés.

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR)

Découvrez comment activer les lymphocytes T avec un peptide-MHC photoactivable pour contrôler précisément le signal spatio-temporel. Cette méthode permet d'étudier la transduction rapide des signaux localisés et les réponses cellulaires polarisées.

Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

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