Intra-iliaque Artère injection pour la modélisation efficace et sélective des métastases osseuses Microscopique
26 septembre 2016
Ce manuscrit présente en détail la procédure d’injection intra-iliaque dans l’artère iliaque (AII), une technique permettant d’administrer des cellules cancéreuses spécifiquement aux tissus des membres postérieurs, y compris les os, afin d’établir des métastases osseuses expérimentales. Bien qu’initialement établi avec des modèles de tumeurs mammaires, ce protocole peut être facilement étendu à d’autres types de cancer.
L’objectif global de cette procédure est d’établir des métastases osseuses expérimentales en délivrant des cellules cancéreuses directement aux tissus des membres postérieurs, y compris les os, par injection intra-iliaque. Cette méthode peut donc nous aider à répondre aux questions clés sur la colonisation osseuse du cancer du sein, en particulier dans la phase précoce de ce processus, comment les cellules cancéreuses du sein interagissent avec les cellules du microenvironnement dans l’os. Nous avons fait une injection dans l’artère iliaque aujourd’hui.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’établir de manière efficace et sélective un modèle expérimental de métastase osseuse microscopique pour divers types de cancer sans causer de lésions tissulaires locales. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à trouver une injection précise, la position d’injection de l’artère iliaque sur le microscope, peut prendre de la pratique pour atteindre un taux de réussite d’injection supérieur à quatre-vingt-dix pour cent. Commencez par confirmer le niveau approprié de sédation par pincement des orteils d’une souris de vingt grammes âgée de cinq à six semaines.
Après avoir appliqué la pommade oculaire, essuyez plusieurs fois la zone rasée de l’aine droite avec des cotons-tiges séquentiels, stériles et imbibés d’éthanol isopropylique, suivis d’un gommage chirurgical à la bétadine. Ensuite, couvrez toute la souris avec un rideau stérile. Ensuite, utilisez une lame de scalpel stérile en acier au carbone numéro dix et un manche numéro trois pour faire une incision cutanée d’un à 1,2 centimètre entre le quatrième et le cinquième mamelon dans la partie inférieure droite de l’abdomen.
Et transférez l’animal sous un microscope de dissection de paillasse standard. Sous l’objectif 4X, insérez des pinces de séparation émoussées dans l’incision entre le tissu adipeux et le péritoine, et poussez les tissus vers l’extérieur des deux côtés pour révéler les vaisseaux iliaques et les nerfs. Ensuite, utilisez des pinces droites et fines pour percer le tissu conjonctif entre les vaisseaux et le nerf le plus proche des vaisseaux.
Ensuite, faites glisser la pince coudée à travers le tissu conjonctif et sous les vaisseaux iliaques, tout en insérant la pince droite dans les tissus conjonctifs de l’autre côté des vaisseaux pour guider la pince inclinée à travers le tissu. Nous vous recommandons de séparer et de soulever le rebord ilial et l’artère comme un faisceau pour cette étape. Bien que les cellules tumorales ne soient injectées que dans l’artère, l’isolement des deux vaisseaux ensemble permet d’économiser du temps et des efforts.
Une fois que la pince coudée est en place, séparez davantage la veine iliaque et l’artère des tissus environnants, en maintenant les vaisseaux au-dessus de la pince inclinée pendant la dissection. Lorsque les vaisseaux sont dégagés, utilisez la pince droite pour appliquer la pointe d’une suture en soie 4-0 à la pince coudée et tirez la suture lentement et doucement sous les vaisseaux. Les deux vaisseaux de la veine et de l’artère iliaques doivent alors être maintenus par la suture.
Lorsque les vaisseaux sont prêts, pipetez les cellules tumorales de haut en bas plusieurs fois pour les remettre en suspension dans une solution unicellulaire et briser les amas de pommeaux. Ensuite, aspirez 100 microlitres de cellules par souris dans une seringue à insuline de calibre 31. Maintenant, glissez la pince coudée sous les vaisseaux en utilisant la suture comme guide, et ouvrez la pince de manière à ce que les vaisseaux reposent doucement sur les pointes.
De l’autre main, insérez la pointe de l’aiguille côté biseau vers le haut dans la lumière de la section de l’artère entre les pointes des pinces. Appuyez lentement sur le piston pour injecter les cellules. La suspension cellulaire évacuera le sang à travers le vaisseau.
Lorsque toutes les cellules ont été distribuées, retirez doucement l’aiguille, en gardant les vaisseaux surélevés sur la pince pour éviter les saignements. Ensuite, retirez la suture. Enfin, retirez rapidement la pince et appuyez un coton-tige sur l’incision pendant cinq à 10 minutes pour arrêter le saignement.
Ici, une image bioluminescente représentative de l’animal entier après injection intra-artérielle iliaque de cinq fois 10 à la cinquième cellule cancéreuse du sein MCF-7 marquée à la luciférine GFP suivie d’une administration de d-luciférine par injection rétro-orbitaire dans le sinus est présentée. Au 14e jour après l’injection, un fort signal de bioluminescence a été obtenu à partir de l’os postérieur injecté dans l’artère intra-iliaque, mais pas à partir de l’os témoin controlatéral, confirmant la localisation spécifique des cellules injectées. La coupe d’une coloration H&E des os porteurs de tumeurs a également mis en évidence une population cellulaire compacte, semblable à des pavés, avec de gros noyaux indiquant des lésions métastatiques microscopiques de MCF-7 dans le tissu osseux 14 jours après l’injection intra-iliaque dans l’artère iliaque.
De plus, la coloration immunofluorescente des sections osseuses a également révélé un mélange des cellules MCF-7 avec des ostéoblastes et des préostéoblastes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en dix à quinze minutes. En suivant ces procédures, vous pouvez utiliser d’autres méthodes pour répondre à des questions supplémentaires.
Par exemple, nous pouvons utiliser RNA-Seq pour profiler les cellules du microenvironnement dans la niche des métastases et les comparer aux cellules normales. Cette technique permet aux chercheurs sur le cancer du sein et sur le cancer de la prostate d’étudier les micrométastases osseuses chez les animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un modèle de métastases osseuses du cancer du sein par injection intra-iliaque.
Veuillez prendre les précautions appropriées, car travailler avec de la kétamine et de la xylazine peut être extrêmement dangereux.
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Aperçu
Ce manuscrit décrit la technique d'injection intra-artérielle iliaque (IIA) pour délivrer des cellules cancéreuses dans les tissus des membres postérieurs, y compris les os, afin d'induire des métastases osseuses expérimentales. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les interactions des cellules cancéreuses du sein avec le microenvironnement osseux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Techniques expérimentales
Contexte
- Les métastases osseuses sont une complication fréquente chez les patients atteints de cancer.
- Comprendre les mécanismes de colonisation osseuse par les cellules cancéreuses est essentiel pour le développement de thérapies.
- La méthode d'injection dans l'artère iliaque permet une administration ciblée des cellules cancéreuses.
- Cette technique minimise les lésions tissulaires locales par rapport aux autres méthodes.
Objectif de l'étude
- Établir un modèle pour l'étude des métastases osseuses.
- Étudier les interactions entre les cellules cancéreuses du sein et les cellules de l'environnement osseux.
- Améliorer la précision et le taux de réussite de la technique d'injection.
Méthodes utilisées
- Injection intra-artérielle iliaque de cellules cancéreuses.
- Utilisation d'un modèle de souris âgée de cinq à six semaines.
- Surveillance du niveau de sédation par pincement des orteils.
- Pratique des techniques d'injection pour obtenir des taux de réussite élevés.
Résultats principaux
- La technique permet une mise en place efficace de modèles de métastases osseuses.
- Des taux de réussite élevés peuvent être obtenus avec de la pratique.
- Peu de dommages tissulaires locaux sont observés avec cette méthode.
- Des informations sur les phases précoces de la colonisation par les cellules cancéreuses du sein sont obtenues.
Conclusions
- L'injection intra-artérielle iliaque est un outil précieux pour la recherche sur le cancer.
- Cette méthode peut être adaptée à divers types de cancer autres que le cancer du sein.
- Des études supplémentaires peuvent améliorer la compréhension des interactions entre le cancer et l'os.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mise en place de modèles fiables de métastases osseuses au stade précoce demeure un défi critique dans la découverte de médicaments en oncologie, en particulier pour évaluer les interventions thérapeutiques ciblant la colonisation micrométastatique. La technique d'injection dans l'artère iliaque permet une dissémination synchronisée dans l'espace et dans le temps de cellules cancéreuses vers les os des membres postérieurs, facilitant ainsi une quantification robuste des cellules tumorales disséminées et réduisant les réponses inflammatoires perturbatrices dues aux lésions tissulaires provoquées par la procédure. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des études précliniques en permettant une surveillance continue de lésions osseuses indolentes en l'absence de métastases systémiques dans d'autres organes, améliorant par là-même la pertinence translationnelle des modèles de métastases osseuses pour la validation de cibles et l'identification de candidats thérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses thérapeutiques en modélisant les interactions précoces entre cellules cancéreuses et composants du microenvironnement osseux, tels que les ostéoblastes et les pré-ostéoblastes.
- Valeur opérationnelle : Offre une méthode sélective et efficace pour délivrer des cellules cancéreuses aux os des membres postérieurs, facilitant une génération reproductible du modèle dans différentes cohortes expérimentales.
- Valeur stratégique : Permet une détection mécanistique des voies de métastases osseuses en visualisant la progression des micrométastases, depuis des cellules uniques jusqu'à des lésions multicellulaires, grâce à des lectures bioluminescentes et histologiques.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des données quantifiables telles que l'intensité du signal bioluminescent et la densité lésionnelle histologique, permettant une évaluation standardisée de la charge métastatique.
- Valeur opérationnelle : Évite les lésions tissulaires locales et les facteurs de confusion associés à la cicatrisation, améliorant ainsi la reproductibilité des tests et réduisant la variabilité des analyses ultérieures.
- Valeur stratégique : Produit des systèmes pertinents sur le plan pathologique avec un minimum de métastases dans des organes hors cible, permettant des fenêtres d'observation prolongées pour les études de réponse-dose et de cinétique dans le cadre de campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur les systèmes pertinents pour la maladie en capturant la progression des cellules tumorales disséminées vers les micrométastases osseuses, un goulot d'étranglement clinique clé.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en soutenant l'imagerie longitudinale et les analyses finales telles que la coloration H&E et l'immunofluorescence.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des signaux précoces d'efficacité pour les composés qui perturbent la co-localisation cancer-stroma ou la formation de niches dans le microenvironnement osseux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode d'injection intra-artérielle iliaque s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, en particulier pour les thérapeutiques osseuses, où la modélisation précoce des métastases éclaire la compréhension mécanistique et les fenêtres thérapeutiques.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les interactions entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement osseux en assurant une livraison contrôlée de cellules tumorales vers des sites squelettiques.
- Criblage : Fournit des systèmes biologiques prêts à l'essai, dotés de lectures quantitatives bioluminescentes et histopathologiques compatibles avec des plates-formes de criblage à haut contenu.
- Analytique : Génère des variables dépendantes mesurables, notamment le flux de photons issu de la bioluminescence, la surface des lésions dans les coupes histologiques et les indices de co-localisation des cellules tumorales et stromales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en modélisant la phase micrométastatique avasculaire, qui précède la progression ostéolytique ou ostéoblastique observée cliniquement dans les métastases osseuses.
- Réutilisation en milieu professionnel : Représente une technique chirurgicale standardisée, adaptable à différents types de cancer et de laboratoires, favorisant une cohérence inter-projets dans la génération de modèles de métastases osseuses.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant le bruit lié à l'inflammation procédurale et en permettant d'attribuer clairement les modifications phénotypiques aux mécanismes d'action du médicament.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité grâce à des repères anatomiques définis et à l'isolement des vaisseaux guidé par points de suture, réduisant ainsi la variabilité dépendante de l'opérateur.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité des décisions d'aller/arrêt en fournissant dès le départ des lectures spécifiques à l'organe concernant les métastases, réduisant ainsi les échecs en phase avancée dus à une tropisme osseux imprévu.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des candidats ciblant l'os en permettant une comparaison directe de la charge métastatique entre les différents groupes thérapeutiques dans des modèles syngéniques ou de xénogreffe.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Exige une maîtrise des techniques de microchirurgie, notamment l'isolement des vaisseaux et la ligature par suture au microscope chirurgical.
- Suppose l'accès à des microscopes de dissection stériles, à des pinces fines, à des seringues à insuline et à du matériel pour la préparation de suspensions cellulaires isotoniques.
- Nécessite une standardisation inter-équipe des protocoles d'anesthésie (par exemple, kétamine/xylazine) et du suivi postopératoire afin d'assurer le bien-être animal et la reproductibilité du modèle.
- Les ajustements à prévoir incluent le volume d'injection et la concentration cellulaire, en fonction de l'agressivité de la lignée cellulaire cancéreuse et de la variabilité entre souches murines.
- Les limites pratiques comprennent une courbe d'apprentissage pour atteindre un taux de réussite d'injection supérieur à 90 %, ainsi que la nécessité d'une technique aseptique pour éviter toute contamination péritonéale lors de l'incision inguinale.
