Cutaneous dénervation chirurgicale: une méthode pour tester l'exigence de nerfs dans les modèles murins de la maladie de la peau

L’objectif général de cette procédure est d’examiner l’influence des nerfs sur la peau normale et pathologique. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés en biologie normale de la peau, telles que si les nerfs cutanés affectent l’homéostasie et la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de comparer des échantillons de peau intacte et dénervée d’un même animal.

La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car les nerfs peuvent être difficiles à reconnaître et à enlever avec des dommages minimes aux tissus environnants. Tout d’abord, anesthésie la souris et vérifie qu’elle a atteint le bon plan de sédation à l’aide d’un pincement des orteils. Vérifiez également que la souris présente une respiration et un rythme cardiaque normaux.

Placez maintenant l’animal sur un coussin chauffant dans une zone chirurgicale aseptique. À l’aide d’une tondeuse électrique, retirez soigneusement les poils du côté dorsal où la biopsie sera effectuée. Essuyez ensuite la zone rasée à l’aide de Betadyne et de lingettes imbibées d’alcool.

Assurez-vous que toutes les coupures de cheveux sont retirées du site. Délimitez maintenant le site de la biopsie à l’aide d’un marqueur noir. Pour obtenir des coupes longitudinales des follicules pileux, le bord le plus long de la biopsie doit aller dans une direction avant-arrière parasetidal à la ligne médiane dorsale.

À l’aide d’un scalpel, faites une excision de pleine épaisseur sans endommager le fascia musculaire sous-jacent. Les saignements sont généralement minimes. L’échantillon de biopsie doit inclure l’épiderme, le derme, la graisse sous-cutanée et le pannicule carneux.

Aplatissez l’échantillon de peau excisée sur une serviette en papier sèche, derme vers le bas. Coupez l’excès d’essuie-tout et conservez l’échantillon sur du TBS froid jusqu’à une heure si d’autres échantillons doivent être prélevés. Pour en revenir à la souris, suturez le site de biopsie à l’aide de 60 sutures en nylon espacées d’environ trois millimètres.

Ensuite, surveillez la souris dans une cage de récupération jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Utilisez des analgésiques conformément aux soins appropriés aux animaux de l’établissement et suivez leurs directives si la souris semble en détresse. Dans les sept à 10 jours suivant l’opération, retirez les sutures.

Procéder au traitement des biopsies pour l’histologie ou la coloration complète. Anesthésie l’animal, rase toute la peau dorsale et nettoie la zone de la même manière que lors de la procédure de biopsie. Maintenant, faites une incision à l’aide d’un scalpel stérile le long de la ligne médiane dorsale de la base du cou jusqu’à environ un demi-centimètre au-dessus de la queue.

À l’aide d’une pince émoussée stérile, rétractez doucement la peau du côté gauche en l’éloignant du flanc pour visualiser le tissu sous-jacent des coussinets adipeux scapulaires près du cou jusqu’à juste au-dessus du membre postérieur. Identifiez maintenant le nerf cutané dorsal à l’aide d’un microscope optique disséquant. Ceux-ci se présentent sous la forme de brins blancs qui se déplacent caudalement à travers le fascia translucide de la paroi du tronc avant de faire des courbures brusques et de pénétrer dans le tissu conjonctif lâche sous la peau.

Ensuite, à l’aide d’une pince ultrafine, retirez le nerf exclusivement du côté gauche de l’animal situé aux sites anatomiques T3 à T12 en les arrachant de l’endroit où leurs segments se plient au niveau de la paroi du tronc jusqu’à leurs points d’entrée dans la peau. Orientez la pince verticalement et saisissez les nerfs à environ un demi-centimètre sous leurs sites de courbure. Une fois saisi, tirez vers le haut pour étirer les nerfs et séparez-vous des tissus environnants pour les retirer.

Évitez d’endommager les vaisseaux sanguins adjacents. Assurez-vous de garder le tissu humide tout au long de la procédure en appliquant périodiquement des gouttes de solution saline à 0,9 %. Continuez à enlever tous les nerfs qui s’étendent de la paroi du tronc à la peau, mais ne perturbez pas les nerfs à l’intérieur du fascia dense de la paroi du tronc.

Ensuite, retirez tous les nerfs du lambeau de peau exposé. Ces fibres comprennent les branches distales du nerf cutané dorsal et apparaissent comme des brins de ramification blancs situés sporadiquement dans le tissu conjonctif du côté dermique du lambeau de peau. Pour retirer ces fines branches, positionnez la pince à peu près parallèlement à la surface dermique, saisissez le nerf et pincez vers le haut.

Retirez tous les nerfs visibles de cette façon. Ne percez pas les vaisseaux sanguins et la peau. Au cours de cette étape, il est important d’éviter la rupture des vaisseaux sanguins voisins.

Si vous trouvez un nerf avec un vaisseau sanguin adjacent, suivez-le éventuellement jusqu’à une zone où il n’y a pas de vaisseau adjacent et retirez-le en l’épilant. Maintenant, desserrez la peau du côté droit de l’incision médiane dorsale, mais n’enlevez aucun nerf. Cela servira de contrôle opérationnel simulé controlatéral.

Enfin, suturez l’animal et surveillez postopératoirement comme auparavant. Plus tard, pour confirmer la perte stable des nerfs, des semaines après l’opération, piquez doucement la zone dénervée à l’aide d’une aiguille hypodermique stérile. Notez si l’animal réagit, généralement en frissonnant ou en tournant la tête.

Si la zone de la peau a été dénervée de manière stable, l’animal ne présentera que peu ou pas de réponse. Prélever des biopsies cutanées dans la zone d’absence de réponse et du côté simulé controlatéral pour des échantillons expérimentaux et de contrôle appariés. À partir des biopsies, il est important d’échantillonner plusieurs coupes histologiques pour identifier les différences potentielles d’abondance ou de morphologie du dôme tactile entre les échantillons simulés et les échantillons dénervés.

La souche de souris ERT2 de Glebe one Cree permet de cibler la recombinaison génétique induite par le tamoxifène dans les zones de la peau qui présentent une activité élevée de la voie du hérisson, comme les épithéliums du dôme tactile. Ces souris ont été croisées pour inciter les souris rapporteures abolaxi à visualiser les épithéliums du dôme tactile. Les nœuds sont cruciaux pour maintenir à la fois les dômes tactiles normaux ainsi que leurs cellules de Merkel associées.

Ceci est démontré expérimentalement par la perte progressive de la morphologie normale du dôme tactile ainsi que par la perte de huit cellules de kératine déposées après dénervation. Les nerfs sont également cruciaux pour favoriser la signalisation du hérisson dans le dôme tactile, comme surveillé par les expressions ERE2 de Glebe one cree et la coloration latérale collective bêta à domicile de la peau factice et dénervée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’ablater chirurgicalement les nerfs cutanés dorsaux afin de tester si ces nerfs sont impliqués dans le fonctionnement normal de la peau ou s’ils modulent la maladie.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée régulièrement et de manière fiable avec un minimum de stress pour l’animal. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que la coloration par fluorescence aminée peuvent être utilisées pour confirmer si les nerfs sont complètement ablatés de la peau et si l’expression des gènes est affectée.