FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

L’objectif global de cette méthode expérimentale est de permettre l’étude en temps réel de la signalisation intracellulaire à l’aide de l’imagerie FRET de cellules intégrées dans des hydrogels tridimensionnels qui imitent les tissus naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, de la pharmacologie et de la médecine régénérative, telles que le développement de biomatériaux optimaux et le criblage de médicaments à haut débit dans des microtissus 3D modifiés. Le principal avantage de cette technique est que la FRET peut être utilisée sur un grand nombre de cellules dans de nombreux types d’hydrogels à l’aide de systèmes de microscope à grand champ conventionnels.

Après avoir fabriqué des moules pour la coulée d’hydrogel et suspendu des cellules cultivées dans une solution d’hydrogel, conformément au protocole de texte, dans une hotte de culture de tissus, ajoutez la cellule contenant le précurseur dans les moules de coulée en utilisant la technique stérile. Avant la réticulation, centralisez les cellules en suspension dans le précurseur d’hydrogel pour optimiser l’imagerie en confinant les cellules à un seul plan focal et en minimisant le signal hors plan. Ensuite, pour réticuler les hydrogels PC, utilisez une source de lumière UVA pendant un temps d’exposition égal à 3,2 joules par centimètre carré par millimètre d’épaisseur pour irradier la cellule contenant le précurseur.

Vous pouvez également utiliser une lampe dentaire à main moins coûteuse. Évitez de surexposer l’hydrogel, car cela diminuerait la viabilité cellulaire. Les hydrogels de réticulation physique sont plutôt placés à 37 degrés Celsius.

Après la réticulation, retirez le moule de coulée d’hydrogel PDMS et remplacez-le par le plat PDMS préalablement préparé. Utilisez une spatule stérile pour appuyer le PDMS sur le verre pour le faire adhérer. Ajoutez un milieu sans phénol, sans sérum ou un milieu chimiquement défini dans le puits créé dans la boîte PDMS avec une lamelle pour maintenir l’hydrogel immergé.

Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois que la boîte PDMS avec l’hydrogel a été fixée sur la platine du microscope et que de l’huile a été appliquée sur l’objectif, utilisez la lumière transmise pour trouver au moins 15 cellules pour l’imagerie et vérifiez la transfection avec l’imagerie par fluorescence. Dans le logiciel du microscope, configurez les paramètres de la caméra pour les canaux d’image FRET en choisissant parmi quelques cellules proches du centre du champ de vision, et optimisez l’exposition et le gain par canal d’image conformément au protocole texte.

Choisissez des cellules proches du centre de l’hydrogel, dans le champ d’éclairage relativement plat, ni trop lumineuses ni trop faibles, et avec un rapport FRET compris entre 00 et 1,0. Ensuite, sélectionnez plusieurs champs de vision pour acquérir des images pour au moins 15 cellules transfectées. Éteignez la lumière lorsque vous avez terminé pour limiter l’exposition.

Pour configurer la fréquence de capture pour l’acquisition d’images en accéléré, entrez la périodicité des captures. Utilisez une fréquence rapide pour la capture du signal de base, par exemple toutes les cinq secondes par champ de vision, et une fréquence plus lente pour la cinétique de signalisation à long terme ultérieure. Sélectionnez Exécuter maintenant pour lancer l’acquisition d’images et capturer des images pendant cinq minutes afin d’établir une référence pour la réponse de la sonde dans le champ de vision désigné.

Après les cinq minutes d’acquisition de l’image, pipeter l’agoniste ou l’antagoniste souhaité, mélanger par pipetage et poursuivre l’imagerie. Après avoir effectué l’étalonnage FRET conformément au protocole de texte, dans le logiciel du microscope, sélectionnez la flèche sur l’icône de la région d’arrière-plan d’intérêt et choisissez Dessiner une région d’arrière-plan elliptique d’intérêt. Dessinez et désignez une zone d’intérêt, ou ROI, par champ de vision près des cellules pour définir le niveau d’arrière-plan.

Assurez-vous que l’option Continuer à mettre à jour le décalage d’arrière-plan est sélectionnée, puis activez l’affichage de la région d’arrière-plan qui vous intéresse en cliquant sur l’icône Région d’arrière-plan d’intérêt. Vous pouvez également choisir l’icône de la région d’intérêt et définir les propriétés de la région d’intérêt comme Utiliser comme région d’intérêt d’arrière-plan et Les régions d’intérêt sont différentes dans chaque multipoint. À l’aide de l’icône d’arrière-plan de la région d’intérêt, sélectionnez Soustraire l’arrière-plan à l’aide de la région d’intérêt.

Dans la fenêtre contextuelle, sous Soustraire la région d’arrière-plan qui vous intéresse, sélectionnez Chaque image et sous Appliquer à, sélectionnez Tous les cadres. Pour chaque champ de vision, pour définir une région d’intérêt autour de la cellule à l’aide du canal d’émission de l’accepteur et d’un masque binaire, utilisez le menu Binaire, Définir le seuil, puis sélectionnez Appliquer à l’image actuelle. Ensuite, ajustez le seuil inférieur pour sélectionner les cellules.

Ensuite, utilisez la fonction Binary Close pour remplir les trous dans le masque binaire, si nécessaire. Ensuite, utilisez l’icône Région d’intérêt pour sélectionner Copier le fichier binaire dans la région d’intérêt afin d’enregistrer le masque binaire en tant que régions d’intérêt. Ajouter les régions d’intérêt des champs de vision suivants au pool existant de régions d’intérêt.

Supprimez toutes les régions parasites d’intérêt. Ensuite, faites un clic droit sur les régions d’intérêt et vérifiez que leurs propriétés sont Utiliser comme région d’intérêt standard et que les régions d’intérêt sont différentes dans chaque multipoint. La région cellulaire d’intérêt peut être dessinée à la main, mais il faut prendre soin d’éliminer les valeurs parasites.

Le protocole contient des procédures pour les cellules qui se trouvent à l’extérieur du champ d’éclairage plat et pour les microscopes qui n’ont pas de champ plat. La centrifugation des précurseurs de l’hydrogel avant la gélification a permis de maximiser le nombre de cellules dans un plan focal près de la lamelle. Cela a permis de minimiser le bruit de fond et d’augmenter le débit d’imagerie.

Dans cette expérience FRET, pour le calcul du rapport FRET d’émission éteinte, ou QE, seules deux images ont été nécessaires pour la sonde binaire ICUE1 à chaîne unique, y compris QE est égal à CFP CFP pour l’excitation et l’émission, et l’émission de l’accepteur est égale à YFP YFP pour l’excitation et l’émission. Plusieurs champs de vision ont été sélectionnés, dans lesquels plusieurs cellules résidaient dans la zone d’éclairage homogène, comme indiqué ici. Les zones d’intérêt pour la correction de l’arrière-plan des signaux de canal et pour l’analyse des cellules ont été désignées à l’aide d’images d’émission d’accepteur seuillées dès le début des expériences.

De plus, comme le montre ici, des cellules ont été sélectionnées pour exprimer suffisamment de sonde. Les rapports FRET QE et d’émission sensibilisée par pixel et le rapport FRET moyen par cellule ont été calculés. L’inverse du rapport ET a été calculé et les deux rapports ont été normalisés.

Sous la stimulation à la forskoline, les rapports de Fret basés sur QE et SE détectent l’augmentation de l’activité cyclique de l’AMP dans les chondrocytes. Les gels réticulés physiquement et chimiquement réticulés ont montré une augmentation du rapport FRET QE au fil du temps, indiquant une augmentation de la réponse de signalisation AMP cyclique à l’ajout de forskoline. Cette procédure peut être utilisée avec d’autres techniques de microscopie telles que FRAP, flim fret et mesure de frette et d’anisotropie, pour répondre à des questions telles que : quelles sont les différences de perméabilité et de distinction cellulaire entre les différents types de microtissus.

Étant donné que la réticulation est trempée près du PDMS, il est important de se rappeler de concevoir les moules pour les hydrogels de photoréticulation légèrement plus grands en diamètre que les hydrogels eux-mêmes.