FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

L'objectif général de cette méthode expérimentale est de permettre l'étude en temps réel des voies de signalisation intracellulaire à l'aide d'imagerie FRET sur des cellules intégrées dans des hydrogels tridimensionnels qui imitent les tissus naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement, de la pharmacologie et de la médecine régénérative, telles que l'élaboration de biomatériaux optimaux ou le criblage à haut débit de médicaments sur des microtissus tridimensionnels conçus. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la FRET peut être appliquée à un grand nombre de cellules dans divers types d'hydrogels, en utilisant des systèmes microscopiques conventionnels à grand champ.

Après avoir fabriqué des moules pour le moulage des hydrogels et suspendu des cellules cultivées dans une solution d'hydrogel, conformément au protocole décrit, ajoutez dans une hotte de culture tissulaire le précurseur contenant les cellules dans les moules de moulage en utilisant une technique stérile. Avant la réticulation, centrifugez les cellules suspendues dans le précurseur d'hydrogel afin d'optimiser l'imagerie en confinant les cellules à un seul plan focal et en minimisant le signal hors plan. Ensuite, pour réticuler les hydrogels en PC, utilisez une source de lumière UVA pendant un temps d'exposition équivalent à 3,2 joules par centimètre carré par millimètre d'épaisseur afin d'irradier le précurseur contenant les cellules.

Alternativement, utilisez une lampe dentaire manuelle moins coûteuse. Évitez une surexposition de l'hydrogel, car cela réduirait la viabilité cellulaire. Les hydrogels réticulés physiquement sont quant à eux placés à 37 degrés Celsius.

Après la réticulation, retirez le moule de moulage en hydrogel de PDMS et remplacez-le par la boîte en PDMS préparée précédemment. Utilisez une spatule stérile pour appuyer le PDMS contre le verre afin de l’adhérer. Ajoutez un milieu sans sérum et sans phénol rouge ou un milieu chimiquement défini dans la cavité créée dans la boîte en PDMS avec un couvre-objet, afin de maintenir l’hydrogel immergé.

Incuber la boîte à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la boîte en PDMS contenant l'hydrogel fixée sur la platine du microscope et l'huile appliquée sur l'objectif, utiliser la lumière transmise pour localiser au moins 15 cellules destinées à l'acquisition d'images, puis vérifier la transfection par imagerie de fluorescence. Dans le logiciel du microscope, configurer les paramètres de la caméra pour les canaux d'images FRET en sélectionnant quelques cellules proches du centre du champ, puis optimiser le temps de pose et le gain pour chaque canal d'image conformément au protocole écrit.

Choisissez des cellules situées près du centre de l'hydrogel, dans un champ d'illumination relativement plat, ni trop brillant ni trop faible, et dont le rapport FRET est compris entre 0,00 et 1,0. Ensuite, sélectionnez plusieurs champs pour acquérir des images d'au moins 15 cellules transfectées. Éteignez la lumière une fois terminé afin de limiter l'exposition.

Pour configurer la fréquence de capture pour l'acquisition d'images en lapse de temps, saisissez la périodicité des prises de vue. Utilisez une fréquence rapide pour la capture du signal de base, par exemple toutes les cinq secondes par champ d'observation, et une fréquence plus lente pour l'analyse ultérieure des cinétiques de signalisation à long terme. Sélectionnez Exécuter maintenant pour démarrer l'acquisition d'images et capturer des images pendant cinq minutes afin d'établir une référence pour la réponse de la sonde dans le champ d'observation désigné.

Après cinq minutes d'acquisition d'images, ajoutez à la pipette l'agoniste ou l'antagoniste souhaité, mélangez à l'aide de la pipette et poursuivez l'acquisition d'images. Après avoir effectué l'étalonnage FRET conformément au protocole décrit, sélectionnez dans le logiciel du microscope la flèche située sur l'icône de la région d'intérêt du fond et choisissez « Dessiner une région d'intérêt elliptique pour le fond ». Dessinez et désignez une région d'intérêt, ou ROI, par champ proche des cellules afin de définir le niveau du fond.

Veillez à ce que l'option « Maintenir la mise à jour du décalage du fond » soit sélectionnée, puis activez l'affichage de la région d'intérêt du fond en cliquant sur l'icône « Région d'intérêt du fond ». Sinon, sélectionnez l'icône de région d'intérêt et définissez les propriétés de la région d'intérêt comme suit : « Utiliser comme région d'intérêt du fond » et « Les régions d'intérêt sont différentes pour chaque point multiple ». À l’aide de l’icône de fond de la région d’intérêt, choisissez « Soustraire le fond à l’aide de la région d’intérêt ».

Dans la fenêtre contextuelle, sous « Subtract Background Region of Interest », sélectionnez « Every Image » et, sous « Apply To », sélectionnez « All Frames ». Pour chaque champ de vision, afin de définir une région d'intérêt autour de la cellule en utilisant le canal d'émission de l'accepteur et un masque binaire, utilisez le menu « Binary », « Define Threshold », puis sélectionnez « Apply To Current Frame ». Ensuite, ajustez le seuil inférieur pour sélectionner les cellules.

Ensuite, utilisez la fonction Fermeture binaire pour remplir les trous dans le masque binaire, si nécessaire. Puis, utilisez l'icône Zone d'intérêt pour sélectionner Copier le binaire vers la zone d'intérêt afin d'enregistrer le masque binaire sous forme de zones d'intérêt. Ajoutez les zones d'intérêt des champs de vision suivants au groupe existant de zones d'intérêt.

Supprimez toutes les régions d’intérêt parasites. Ensuite, cliquez avec le bouton droit sur les régions d’intérêt et vérifiez que leurs propriétés sont « Utiliser comme région d’intérêt standard » et que les régions d’intérêt sont différentes pour chaque point multiple. Les régions d’intérêt cellulaires peuvent être dessinées manuellement, mais il convient de veiller à supprimer les valeurs parasites.

Le protocole comprend des procédures pour les cellules situées en dehors du champ d'illumination plat et pour les microscopes qui n'ont pas de champ plat. La centrifugation des précurseurs d'hydrogel avant la gélification a permis de maximiser le nombre de cellules sur un plan focal proche de la lame. Cela a minimisé le bruit de fond et augmenté le débit d'acquisition d'images.

Dans cette expérience de FRET, pour le calcul du rapport de FRET correspondant à l'émission éteinte (QE), deux images seulement étaient nécessaires pour la sonde binaire ICUE1 à chaîne unique, incluant QE égal à CFP CFP pour l'excitation et l'émission, et l'émission de l'accepteur égale à YFP YFP pour l'excitation et l'émission. Plusieurs champs ont été sélectionnés où plusieurs cellules se trouvaient à l'intérieur de la zone d'illumination homogène, comme indiqué ici. Les régions d'intérêt (ROIs) destinées à la correction du fond pour les signaux des canaux et à l'analyse cellulaire ont été définies à l'aide d'images seuil de l'émission de l'accepteur prises au début des expériences.

En outre, comme illustré ici, les cellules exprimant une sonde en quantité suffisante ont été sélectionnées. Les rapports FRET QE et par émission sensibilisée par pixel, ainsi que le rapport FRET moyen par cellule, ont été calculés. L'inverse du rapport d'émission sensibilisée a été calculé et les deux rapports ont été normalisés.

Sous la stimulation par la forskoline, les rapports FRET basés sur QE et SE détectent une activité accrue de l'AMP cyclique dans les chondrocytes. Les gels réticulés physiquement et les gels réticulés chimiquement ont montré une augmentation du rapport FRET QE au fil du temps, indiquant une réponse accrue de la signalisation de l'AMP cyclique à l'ajout de forskoline. Cette procédure peut être utilisée avec d'autres techniques de microscopie telles que la FRAP, le FRET en temps de vie (FLIM-FRET) et la mesure de l'anisotropie, afin de répondre à des questions telles que : quelles sont les différences de perméabilité et de signalisation cellulaire entre différents types de microtissus ?

Étant donné que la réticulation est arrêtée près du PDMS, il est important de concevoir les moules pour les hydrogels réticulés par voie photochimique légèrement plus grands en diamètre que les hydrogels eux-mêmes.