Name: FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Découvrez l'imagerie FRET en hydrogels tridimensionnels pour étudier la signalisation intracellulaire en temps réel. Cette méthode utilise la microscopie épifluorescence conventionnelle pour analyser de nombreuses cellules dans des microenvironnements biomimétiques.

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Les auteurs reconnaissent le soutien financier de l&#39;École de médecine dentaire à l&#39;Université de Pittsburgh, les National Institutes of Health Award K01 AR062598 et subvention P30 DE030740. Les auteurs remercient également le Dr Jin Zhang pour le plasmide ICUE1, Wayne Rasband pour développer ImageJ et Michael Cammer pour la macro ImageJ.

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Signalisation cellulaire est à la fois complexe et en conséquence pour de nombreux domaines, y compris la pharmacologie, l&#39;ingénierie tissulaire et la médecine régénérative. outils d&#39;enquête utiles sont nécessaires pour approfondir notre compréhension de la biologie cellulaire et de développer des matériaux optimaux pour la régénération des tissus. Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) imagerie est un outil essentiel permettant l&#39; analyse de l&#39; activation du récepteur, conformation moléculaire, et les interactions supramoléculaires (par exemple., Protéines / ADN complexation) dans les cellules vivantes. FRET est un type de transfert d&#39;énergie non radiatif entre fluorophores 1. Il a une efficacité qui est inversement proportionnelle à la puissance six de la distance entre un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur. Ainsi, il peut fournir des informations sur la distance spatiale entre deux molécules différentes ou à travers des régions d&#39;une molécule à l&#39;échelle du nanomètre (typiquement 1 - 10 nm) 2. Les fluorophores donneur et accepteur peuvent être différents mles types olecule (hétéro-FRET), dans lequel le donneur a l&#39;émission d&#39;énergie plus élevée (plus courte longueur d&#39;onde), ou du même type (homo-FRET). FRET imagerie peut être effectuée sur des cellules fixées ou vivantes, mais en général, les cellules fixes sont utilisés pour l&#39;imagerie des interactions moléculaires à haute résolution spatiale lorsque les systèmes confocale à grande vitesse ne sont pas disponibles. Les cellules vivantes sont utilisées pour étudier les interactions et les processus qui sont inhibés ou modifiés par la fixation, tels que le temps réel intracellulaire de signalisation de réponse 3. Des études de cellules vivantes qui emploient FRET utilisation d&#39;imagerie en deux dimensions (2D) cultures cellulaires en partie à cause de la simplicité et de fond plus faible (pas d&#39;émission à partir de cellules d&#39;avion). Cependant, les cultures 2D modifient également de nombreux processus cellulaires par rapport au microenvironnement physiologique et en trois dimensions (3D) la culture 4,5. Par exemple, la cellule originaire de la cellule et la cellule à des interactions de la matrice extracellulaire sont radicalement modifiée dans la culture 2D menant aux easily a observé des changements dans la morphologie des cellules et la polarité 6. Microdomaines membranaires (par exemple., Cavéoles et radeaux lipidiques) et la signalisation du récepteur sont fortement réglementés par l&#39;environnement de la culture, en partie parce qu&#39;ils se lient les composants du cytosquelette 7,8 et la structure de la forme des cellules et du cytosquelette sont fortement réglementées par l&#39;environnement de la culture spatiale 9. Mécanotransduction est influencée non seulement par la matrice 3D, mais les conditions de charge secondaires plus complexes engendrés dans des environnements 3D en 2D par rapport à des cultures 10. Enfin, la perméabilité de la matrice 3D est inférieure au milieu de culture, en général à une diminution de la diffusion et une liaison accrue des molécules de signalisation cellulaire par rapport à des cultures 2D. Avec des cultures 3D on est en mesure de créer et d&#39;observer un microenvironnement plus semblable à la physiologique par rapport à l&#39;adhésif, chimique, et des signaux mécaniques. Cellule d&#39;interactions cellulaires peut être favorisée et les propriétés adhésives peut être contrôlé wvec la structure, la composition et l&#39; architecture (motif) du matériau 3D 11-13. Les propriétés mécaniques du matériau peuvent également être adaptés par la composition et la structure 14,15. La culture de cellules en hydrogels donc permis FRET études sur des cellules primaires qui seraient autrement de-différencier les ou changement dans le phénotype en utilisant des techniques classiques, par exemple., Les cellules de cartilage articulaire. Ainsi, un procédé est nécessaire pour permettre des analyses FRET dans des cultures 3D en direct. échafauds hydrogels sont idéales pour des études basées FRET 3D, car ils peuvent être optiquement transparents et adaptés pour commander le micro-environnement et pour fournir des signaux cellulaires. Hydrogels à base de polymères naturels ont été utilisés dans la culture cellulaire pendant des décennies, y compris la gélatine et la fibrine 16. Meilleur contrôle sur le microenvironnement cellulaire peut être obtenue avec une modification chimique de ces polymères et avec l&#39;utilisation de polymères synthétiques , 17,18. hydrOGEL rigidité mécanique et de la perméabilité peut être contrôlée en modifiant leur composition polymère et la taille des mailles (polymère et la densité de réticulation) 19,20. De plus, les hydrogels peuvent être biologiquement active par l&#39;incorporation de facteurs de croissance et des ligands cellulaires. En raison de ces possibilités, le développement d&#39;hydrogels pour les biocapteurs, la délivrance de médicaments, et les applications d&#39;ingénierie tissulaire est un domaine de recherche très actif 21. L&#39; impression 3D d&#39;hydrogels est également en cours de développement pour la fabrication de micro-tissus et -organs 15. Ainsi, FRET imagerie des cellules dans les hydrogels est utile non seulement comme moyen de rapprocher le comportement cellulaire physiologique, mais aussi comme un outil pour étudier et optimiser la croissance de l&#39;ingénierie tissulaire. Les sondes FRET ratiométrique binaires sont très utiles pour étudier la signalisation cellulaire et peuvent être utilisés dans des cultures d&#39;hydrogel. Pour une liste partielle des fluorescente publiée et FRET sondes, voir le site web cellulaire Migration Consortium <sup&gt; 22. Le type de sonde la plus courante comporte deux fluorophores différents qui sont associés ou reliés par un élément de reconnaissance (s) (substance à analyser région sensible). Ces régions subissent un changement conformationnel, l&#39; association ou la dissociation lors de la détection de l&#39;analyte (par ex., La liaison d&#39;un ion ou d&#39;une molécule, le clivage enzymatique de la région) qui modifie la distance entre fluorophores et donc l&#39;amplitude de FRET (supérieure ou inférieure) 23. Un type de sonde moins commune mais utile repose sur un changement sensible de l&#39;analyte dans le chevauchement spectral des deux fluorophores, qui modifie FRET grandeur. &quot;Monocaténaires&quot; ratiométrique sondes utilisent une paire de fluorophore lié à une seule molécule. &quot;Double chaîne&quot; sondes utilisent des paires de fluorophores sur des molécules séparées, mais leur expression peut être couplé sous la même cassette d&#39;expression 24. Contrairement aux études avec une expression unique de fluorophore (par exemple., Des protéines de fusion fluorescentes), des études avec ratiométriqueLes sondes FRET ne nécessitent pas de double transfection pour contrôler l&#39;efficacité de la transfection ou la viabilité cellulaire. Sondes Ratiométrique FRET sont relativement insensibles à l&#39; efficacité de transfection lorsqu&#39;il est exprimé ci - dessus d&#39; un seuil minimal (concentration insensible) 23,25. Ils sont insensibles aux fluctuations de la source d&#39;excitation et d&#39; autres facteurs du milieu intracellulaire (par ex., Le pH, des ions) tant que les deux fluorophores sont sensibles de manière similaire. En outre, leur réponse est non soumis à un retard de la transcription, à la différence de fluorescence et bioluminescence promoteur-rapporteur construit des 26,27. sondes Ratiométrique FRET sont facilement et fréquemment utilisés dans les systèmes classiques de microscope Widefield à épifluorescence. microscopes grand champ sont préférés balayage de ligne des systèmes confocale pour l&#39;imagerie des cellules vivantes en raison de préoccupations sur le coût du système, fluorophore blanchiment, et la capture de signaux change avec une résolution temporelle suffisante. En outre, anal cellulaire uniqueyse sur une grande population de cellules est possible avec une capture de la scène et de l&#39;image motorisé sur plusieurs champs de vision. La microscopie à champ large nécessite une analyse d&#39;intensité en fonction des signaux de sonde hétéro-FRET. Bien que l&#39; analyse de l&#39; intensité ne nécessite pas de matériel complexe comme d&#39; autres méthodes FRET, plus de travail post-acquisition est nécessaire pour corriger les effets des comportements fluorophores et configurations système microscope / d&#39;imagerie 28. L&#39;intensité d&#39;émission d&#39;un fluorophore capturé est une fonction de l&#39;énergie d&#39;excitation, un fluorophore rendement quantique, et le filtre combiné et un appareil photo / détecteur de sensibilité spectrale et la linéarité 2. Ceux-ci peuvent être différents pour le donneur et accepteur et nécessiteront l&#39;étalonnage pour l&#39;analyse quantitative. En outre, l&#39; imagerie de l&#39;émission de l&#39; accepteur est influencée par le chevauchement spectral des fluorophores (excitation de l&#39; accepteur par la lumière d&#39; excitation et de donneur transpercement d&#39;émission du donneur dans les spectres d&#39;émission de l&#39; accepteur) 2.4; à chaîne unique &quot;sondes sont normalisées à l&#39; intérieur parce que leurs fluorophores sont équimolaire à l&#39;échelle nanométrique, tandis que les fluorophores de&quot; double-chaîne &quot;sondes peuvent exister à différents stoechiométries à travers une cellule 25,28 Si les fluorophores de.&quot; Chaîne unique &quot; les sondes sont de même luminosité (fonction du coefficient d&#39;extinction et le rendement quantique), les effets de la sensibilité du détecteur non linéaire sont petites et que la correction pour la fluorescence de fond et le quantum de sensibilité / rendement détecteur couplé est nécessaire 23. Ainsi , &quot; à une seule chaîne&quot; sondes ratiométrique FRET sont plus facilement mises en œuvre en Widefield microscopie 24. Ce document décrit une technique simple pour effectuer FRET imagerie de cellules vivantes dans les cultures d&#39;hydrogel 3D à l&#39;aide d&#39;un microscope Widefield épifluorescent classique. Il peut être facilement adopté par les laboratoires effectuant des expériences déjà FRET en 2D, ainsi laboratoires intéressés par interla signalisation cellulaire dans microtissues. Ici, nous démontrons la méthode de mesure de l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc), les niveaux de chondrocytes vivants dans photoréticulation (PC-gel, le polyéthylène glycol diméthacrylate) et thermosensible (TR-gel, Matrigel) des hydrogels à base d&#39;imagerie FRET. Une sonde FRET ratiométrique est utilisé sur la base EPAC1 (ICUE1) afin de détecter les taux d&#39;AMPc en réponse à la forskoline, un agoniste chimique pour l&#39;adénylcyclase qui catalyse la conversion de l&#39;ATP en AMPc. AMPc est l&#39;un des principaux seconds messagers médiatrices G la signalisation des récepteurs couplés à la protéine et active de divers facteurs, y compris les protéines d&#39;échange en aval directement activés par l&#39;AMPc (EPAC). Les fluorophores se séparent lors de la liaison de l&#39;AMPc au domaine EPAC entraînant une diminution de FRET. Décrite ici est la préparation des matériaux d&#39;hydrogel, la transfection de cellules avec la sonde ICUE1, et l&#39;incorporation des cellules dans les hydrogels 3D. La procédure d&#39;expérimentation 3D FRET et l&#39;analyse d&#39;image nécessairepour évaluer l&#39;activité de la sonde par cellule sont expliquées. Nous discutons également des limites inhérentes à l&#39;analyse FRET en 2D et 3D en utilisant la microscopie à champ large. La technique présentée ici représente une amélioration par rapport aux méthodes existantes en 2D, car elle permet une analyse dans un contexte plus physiologique et nécessite moins de correction d&#39;image et d&#39;étalonnage. Une grande utilité réside dans le fait que beaucoup de matériaux transparents peuvent être utilisés tandis que les préférences de la cellule et la transfection peuvent être maintenues.

<table><tbody><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS) [Kit d’élastomère Sylgard 184]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Diméthacrylate de polyéthylène glycol (PEGDM)</td><td>Préparé selon Lin-Gibson avec PEG de Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)méthacrylate de propyle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>3</td></tr><tr><td>- glycidoxypropyltriméthoxysilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>440167 Réactifs</td></tr><tr><td>Diméthylphénylphosphonite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs Chlorure de 2,4,6-triméthylbenzoyle Fisher</td><td>Scientific</td><td>AC244280100</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>2-Butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Réactifs Bromure</td></tr><tr><td>de lithium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs Sigmacote (réactif siliconant)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Toluene&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs Opti-MEM Milieu sérique réduit, sans rouge de phénol (milieu sans phénol ni sérum)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>FuGENE HD Réactif de transfection (réactif de transfection)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Cellstripper (cellule solution de dissociation)</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Facteur de croissance réduit Matrigel, Sans phénol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>réactifs</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (10,200,1,000 &mu ; l)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Gants d’examen non poudrés</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Poinçon à biopsie (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Lamelles de protection en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Lamelles en verre pré-enduit (époxysilane)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Lame en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Flacons stériles (15 ml, 50 ml coniques)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (6- bien)</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>Matériel de laboratoire jetable</td></tr><tr><td>Microscope épifluorescent avec platine motorisée</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Matériel de laboratoire grand/non jetable</td></tr><tr><td>Porte-échantillon réglable pour platine XY</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Équipement de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Objectif 60X (1,3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Porte-filtres de source lumineuse CFP/YFP et d’excitation/émission (source lumineuse et roue Lambda, système de filtre d’émission Lambda)</td><td>Nikon (revendeur Sutter Instrument)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Jeu de filtres CYF/YFP Nikon</td><td>(Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Appareil photo (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu revendeur)</td><td>77054076</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 logiciel de microscope)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp ;</td><td>Équipement de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Prism (tableur et logiciel graphique)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Version 6</td><td>Équipement de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 Système de lampe à polymérisation UV avec filtre 365 nm ou autre source lumineuse (&lambda ; = 365 ou 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Équipement de laboratoire grand/non jetable</td></tr><tr><td>Aide à la pipette&nbsp ;</td><td>Drummond Scientific Co.&nbsp ;</td><td>DP-100</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Matériel de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Chambre de dessiccateur sous vide/dégazeur&nbsp ;</td><td>Tout</td><td></td><td>Équipement de laboratoire volumineux/non jetable</td></tr><tr><td>Capot de culture tissulaire&nbsp ;</td><td>Tout</td><td></td><td>équipement de laboratoire volumineux/non jetable</td></tr><tr><td>Hotte chimique&nbsp ;</td><td>Tout</td><td></td><td>Équipement de laboratoire grand/non jetable</td></tr><tr><td>Four</td><td>Tout</td><td></td><td>Équipement de laboratoire grand/non jetable</td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Tout</td><td></td><td>équipement de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Bécher</td><td>Tout</td><td></td><td>équipement de laboratoire non jetable</td></tr><tr><td>Incubateur&nbsp ;</td><td>Tout</td><td></td><td>équipement de laboratoire volumineux/non jetable</td></tr></tbody></table>

fret imaging en hydrogels en trois dimensions

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

L&#39;imagerie du Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) est un outil puissant pour l&#39;examen de la biologie cellulaire en temps réel. Des études utilisant FRET emploient couramment (2D) la culture en deux dimensions, ce qui ne reproduit pas les trois dimensions (3D) microenvironnement cellulaire. Procédé pour effectuer l&#39;émission trempée FRET imagerie par microscopie à épifluorescence Widefield conventionnelle des cellules dans un environnement d&#39;hydrogel 3D est présenté. Voici une méthode d&#39;analyse pour les sondes FRET ratiométrique qui donne des rapports linéaire sur la gamme d&#39;activation de la sonde est décrite. Mesure intracellulaire d&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc) niveaux est démontrée dans les chondrocytes sous stimulation par la forskoline en utilisant une sonde pour EPAC1 activation (ICUE1) et la capacité de détecter les différences de AMPc de signalisation en fonction du type de matériau d&#39;hydrogel, ici un hydrogel de photoréticulation (PC-gel, diméthacrylate de polyéthylène glycol) et un hydrogel thermosensible (TR-gel). Par rapport aux méthodes 2D FRET,cette méthode nécessite peu de travail supplémentaire. Les laboratoires utilisant déjà l&#39;imagerie FRET en 2D peuvent facilement adopter cette méthode pour effectuer des études cellulaires dans un microenvironnement 3D. Il peut en outre être appliquée au dépistage de drogues à haut débit dans microtissues 3D d&#39;ingénierie. En outre, il est compatible avec d&#39;autres formes d&#39;imagerie FRET, comme mesure de l&#39;anisotropie et de l&#39;imagerie de fluorescence à vie (FLIM), et avec des plates-formes avancées de microscopie confocale en utilisant, pulsée ou illumination modulée.

Tous les précurseurs, des cellules et des moules de coulée d&#39;hydrogel ont été préparées comme décrit ci-dessus. Les solutions de précurseurs de cellules ont été chargées coulés dans des moules PDMS, puis centrifugés avant gélification / photoréticulation pour immobiliser des cellules à proximité de la lamelle couvre -objet et à faciliter l&#39; analyse FRET d&#39;imagerie (figure 1). Les hydrogels avec des lamelles couvre - joints ont été placés dans des puits préparés PDMS d&#39;imagerie pour l&#39; imagerie microscopique (figure 2). Les configurations optiques et des paramètres d&#39;acquisition d&#39;image ont ensuite été fixées comme représenté sur la figure 3A. La capture de tous les quatre FRET liés à l&#39; image des canaux pour CFP-YFP paires de fluorophores est démontrée (voir la rubrique «Conf optique.» Dans la figure 3), comme il est nécessaire pour les sondes non-binaires. Cependant, dans ce travail que deux images sont nécessaires pour la sonde à une seule chaîne de ICUE1 binaire, QE = &quot;CFP CFP&quot; et Aem = &quot;YFP YFP&quot; (excitation émission). FOV multiples (position xys) ont été sélectionnés au cours duquel plusieurs cellules ont résidé dans la zone d&#39;illumination homogène (figure 3B). Après l&#39;acquisition de laps de temps, les données de signal pour la sonde a été exporté. ROI pour la correction des signaux de canal d&#39;arrière - plan et pour l&#39; analyse des cellules ont été désignées en utilisant des images Aem seuillés à partir du début des expériences (figure 4). Les cellules ont été choisis parmi le pool de cellules comme celles exprimant suffisante (pas trop faible), mais pas trop élevé (trop clair) sonde (figure 4B). Les QE et SE FRET ratios par pixel à chaque acquisition ont été calculées en utilisant la division à virgule flottante de l&#39;arrière-plan soustrait canaux d&#39;image. Le ratio de FRET moyenne par cellule (ie, par ROI) a été calculé, normalisé au signal de référence avant la stimulation (ie, une régression sur la base soustraite de tous les points de temps), et comploté avec des barres d&#39;erreur que l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). Tant le QE et sur la base des ratios cse FRET detect l&#39;augmentation de l&#39; activité de l&#39; AMPc dans les chondrocytes sous stimulation par la forskoline (100 nM, figure 5). Le ratio QE FRET était plus sensible à la correction de fond que le ratio cse FRET parce que le signal de QE a été plus faible en raison du faible niveau de base de l&#39;activité de l&#39;AMPc dans les chondrocytes incorporés dans les hydrogels. Les deux types d&#39; hydrogel (TR-gel et PC-gel) a montré une augmentation du ratio FRET au cours du temps (figure 6), ce qui indique une augmentation de la réponse de signalisation de l&#39; AMPc à l&#39;addition de forskoline. Comme indiqué par le rapport QE FRET, chondrocytes dans hydrogels PC-gel montrent un plus grand changement dans l&#39; AMPc (montré) et un niveau de base supérieur de l&#39; AMPc (E QE = 0,19 en PC-gel vs E QE = 0,09 dans TR-gel, non représenté sur la base soustraite figure). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> Figure 1: Cellule Distribution en photoréticulé Hydrogel (PC-gel) </strong&gt; A: Le précurseur de la cellule d&#39;hydrogel chargé a été centrifugée pour maximiser le nombre de cellules au niveau d&#39;un plan focal près de la lamelle couvre-objet. B: Ceci augmente le nombre de cellules dans le champ de vision et de minimiser le signal de fond provenant de cellules planes. (Barre d&#39; échelle = 200 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> Figure 2: Hydrogel en PDMS Dish L&#39;hydrogel a été placé à l&#39;intérieur d&#39;une grande hauteur PDMS bien (10x volumes d&#39;hydrogel) avec une base de lamelle pour l&#39;imagerie microscopique et la stimulation de l&#39;analyte. Les hydrogels PC-gel sont transparentes et collé sur la lamelle couvre-objet de sorte qu&#39;ils restent en place tout au long de l&#39;essai. Les PDMS peuvent bien être plus grand pour contenir 10 fois plus que le volume moyen d&#39;hydrogel à l&#39;aide d&#39;un poinçon de biopsie plus en plus d&#39;auFiche hicker PDMS. (Barre d&#39; échelle = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> Figure 3: Configuration d&#39; acquisition pour FRET Imaging A: L&#39;acquisition a été configuré pour la capture d&#39;image toutes les 7 secondes à plusieurs endroits. Pour le calcul du ratio QE FRET, seuls deux canaux d&#39;image sont nécessaires pour la sonde ICUE1 utilisé ici (sonde à une seule chaîne binaire), QE = &quot;CFP CFP&quot; et Aem = &quot;YFP YFP&quot; (excitation émission) en vertu de la &quot;Conf optique.&quot; la colonne dans l&#39;onglet λ du logiciel de microscope. B: FOV (positions «XY») ont été sélectionnés au cours duquel plusieurs cellules ont résidé dans la zone d&#39;illumination homogène. L&#39;intrigue ci-dessous l&#39;image montre l&#39;intensité d&#39;éclairage le long de la ligne bleue fléchéequi traverse à travers le centre de la FOV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> Figure 4: Choix des ROIs pour l&#39; analyse FRET Imaging A: Une région d&#39;intérêt (ROI) libre de cellules a été sélectionné pour corriger le signal de fond sur chaque canal. Une image d&#39;un hydrogel sans cellule peut plutôt être utilisé pour la soustraction de fond si la densité cellulaire ou la migration est élevé, ou si un masque d&#39;ombrage ne sont pas utilisés lorsque les cellules ne se trouvent pas dans un champ d&#39;éclairage homogène. B: Les ROIs cellulaires ont été sélectionnées en utilisant l&#39;image seuillage et masquage binaire du canal Aem. Sélection d&#39;un retour sur investissement plus grand que les cellules nuira calcul du ratio de FRET moyenne par cellule en raison de l&#39;inclusion des rapports extracellulaires générés à partir de fond noise. Calcul du ratio de FRET cellulaire en utilisant la moyenne de chaque canal par cellule est déconseillée car cela sous-estime le rapport. (Barre d&#39; échelle = 50 pm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> Figure 5: Comparaison des rapports FRET dans thermosensible Hydrogel (TR-gel) Les deux QE et des ratios de FRET à base SE détectent l&#39;activité accrue d&#39;AMPc dans les chondrocytes sous stimulation forskoline. La forskoline est un agoniste de l&#39;adényl-cyclase, qui induit la production d&#39;AMPc. FRET diminue lorsque la sonde se lie ICUE1 AMPc, et donc le ratio QE FRET (E QE = SQE / (SAEM x QS)) augmente. A l&#39; inverse, le ratio SE FRET diminue et est ainsi tracée E SE = 1 - Cse / SAEM. Dans un hydrogel incorporé chondrocytes, QE Frapport RET est plus sensible à la correction de fond que le ratio FRET SE parce que le signal QE est faible en raison de l&#39;activité de l&#39;AMPc de base faible. Les barres d&#39;erreur = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> Figure 6: Comparaison du ratio FRET dans différents hydrogels Les chondrocytes dans les deux types d&#39;hydrogel ont répondu à la stimulation de la forskoline avec une augmentation de l&#39;activité de l&#39;AMPc comme le démontre le rapport accru QE FRET au fil du temps. Les effets de type hydrogel , la réponse cellulaire par plusieurs effets secondaires , y compris des différences de perméabilité à la forskoline et l&#39;activité de l&#39; AMPc cellulaire basai (E QE = 0.19 PC-gel par rapport à E QE = 0,09 dans le TR-gel, non représenté). Les barres d&#39;erreur = SEM, n pour TR-gel= 25, n pour PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) imagerie est un outil puissant pour les études de biologie cellulaire en temps réel. Ici, un procédé pour les cellules d&#39;imagerie FRET dans physiologiques microenvironnements en trois dimensions (3D) d&#39;hydrogel en utilisant la microscopie à épifluorescence classique est présenté. Une analyse pour les sondes FRET ratiométrique qui donne des rapports linéaire sur la gamme d&#39;activation est décrite.

FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

L'objectif général de cette méthode expérimentale est de permettre l'étude en temps réel des voies de signalisation intracellulaire à l'aide d'imagerie FRET sur des cellules intégrées dans des hydrogels tridimensionnels qui imitent les tissus naturels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement, de la pharmacologie et de la médecine régénérative, telles que l'élaboration de biomatériaux optimaux ou le criblage à haut débit de médicaments sur des microtissus tridimensionnels conçus. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la FRET peut être appliquée à un grand nombre de cellules dans divers types d'hydrogels, en utilisant des systèmes microscopiques conventionnels à grand champ.Après avoir fabriqué des moules pour le moulage des hydrogels et suspendu des cellules cultivées dans une solution d'hydrogel, conformément au protocole décrit, ajoutez dans une hotte de culture tissulaire le précurseur contenant les cellules dans les moules de moulage en utilisant une technique stérile. Avant la réticulation, centrifugez les cellules suspendues dans le précurseur d'hydrogel afin d'optimiser l'imagerie en confinant les cellules à un seul plan focal et en minimisant le signal hors plan. Ensuite, pour réticuler les hydrogels en PC, utilisez une source de lumière UVA pendant un temps d'exposition équivalent à 3,2 joules par centimètre carré par millimètre d'épaisseur afin d'irradier le précurseur contenant les cellules.Alternativement, utilisez une lampe dentaire manuelle moins coûteuse. Évitez une surexposition de l'hydrogel, car cela réduirait la viabilité cellulaire. Les hydrogels réticulés physiquement sont quant à eux placés à 37 degrés Celsius.Après la réticulation, retirez le moule de moulage en hydrogel de PDMS et remplacez-le par la boîte en PDMS préparée précédemment. Utilisez une spatule stérile pour appuyer le PDMS contre le verre afin de l’adhérer. Ajoutez un milieu sans sérum et sans phénol rouge ou un milieu chimiquement défini dans la cavité créée dans la boîte en PDMS avec un couvre-objet, afin de maintenir l’hydrogel immergé.Incuber la boîte à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois la boîte en PDMS contenant l'hydrogel fixée sur la platine du microscope et l'huile appliquée sur l'objectif, utiliser la lumière transmise pour localiser au moins 15 cellules destinées à l'acquisition d'images, puis vérifier la transfection par imagerie de fluorescence. Dans le logiciel du microscope, configurer les paramètres de la caméra pour les canaux d'images FRET en sélectionnant quelques cellules proches du centre du champ, puis optimiser le temps de pose et le gain pour chaque canal d'image conformément au protocole écrit.Choisissez des cellules situées près du centre de l'hydrogel, dans un champ d'illumination relativement plat, ni trop brillant ni trop faible, et dont le rapport FRET est compris entre 0,00 et 1,0. Ensuite, sélectionnez plusieurs champs pour acquérir des images d'au moins 15 cellules transfectées. Éteignez la lumière une fois terminé afin de limiter l'exposition.Pour configurer la fréquence de capture pour l'acquisition d'images en lapse de temps, saisissez la périodicité des prises de vue. Utilisez une fréquence rapide pour la capture du signal de base, par exemple toutes les cinq secondes par champ d'observation, et une fréquence plus lente pour l'analyse ultérieure des cinétiques de signalisation à long terme. Sélectionnez Exécuter maintenant pour démarrer l'acquisition d'images et capturer des images pendant cinq minutes afin d'établir une référence pour la réponse de la sonde dans le champ d'observation désigné.Après cinq minutes d'acquisition d'images, ajoutez à la pipette l'agoniste ou l'antagoniste souhaité, mélangez à l'aide de la pipette et poursuivez l'acquisition d'images. Après avoir effectué l'étalonnage FRET conformément au protocole décrit, sélectionnez dans le logiciel du microscope la flèche située sur l'icône de la région d'intérêt du fond et choisissez « Dessiner une région d'intérêt elliptique pour le fond ». Dessinez et désignez une région d'intérêt, ou ROI, par champ proche des cellules afin de définir le niveau du fond.Veillez à ce que l'option « Maintenir la mise à jour du décalage du fond » soit sélectionnée, puis activez l'affichage de la région d'intérêt du fond en cliquant sur l'icône « Région d'intérêt du fond ». Sinon, sélectionnez l'icône de région d'intérêt et définissez les propriétés de la région d'intérêt comme suit : « Utiliser comme région d'intérêt du fond » et « Les régions d'intérêt sont différentes pour chaque point multiple ». À l’aide de l’icône de fond de la région d’intérêt, choisissez « Soustraire le fond à l’aide de la région d’intérêt ».Dans la fenêtre contextuelle, sous « Subtract Background Region of Interest », sélectionnez « Every Image » et, sous « Apply To », sélectionnez « All Frames ». Pour chaque champ de vision, afin de définir une région d'intérêt autour de la cellule en utilisant le canal d'émission de l'accepteur et un masque binaire, utilisez le menu « Binary », « Define Threshold », puis sélectionnez « Apply To Current Frame ». Ensuite, ajustez le seuil inférieur pour sélectionner les cellules.Ensuite, utilisez la fonction Fermeture binaire pour remplir les trous dans le masque binaire, si nécessaire. Puis, utilisez l'icône Zone d'intérêt pour sélectionner Copier le binaire vers la zone d'intérêt afin d'enregistrer le masque binaire sous forme de zones d'intérêt. Ajoutez les zones d'intérêt des champs de vision suivants au groupe existant de zones d'intérêt.Supprimez toutes les régions d’intérêt parasites. Ensuite, cliquez avec le bouton droit sur les régions d’intérêt et vérifiez que leurs propriétés sont « Utiliser comme région d’intérêt standard » et que les régions d’intérêt sont différentes pour chaque point multiple. Les régions d’intérêt cellulaires peuvent être dessinées manuellement, mais il convient de veiller à supprimer les valeurs parasites.Le protocole comprend des procédures pour les cellules situées en dehors du champ d'illumination plat et pour les microscopes qui n'ont pas de champ plat. La centrifugation des précurseurs d'hydrogel avant la gélification a permis de maximiser le nombre de cellules sur un plan focal proche de la lame. Cela a minimisé le bruit de fond et augmenté le débit d'acquisition d'images.Dans cette expérience de FRET, pour le calcul du rapport de FRET correspondant à l'émission éteinte (QE), deux images seulement étaient nécessaires pour la sonde binaire ICUE1 à chaîne unique, incluant QE égal à CFP CFP pour l'excitation et l'émission, et l'émission de l'accepteur égale à YFP YFP pour l'excitation et l'émission. Plusieurs champs ont été sélectionnés où plusieurs cellules se trouvaient à l'intérieur de la zone d'illumination homogène, comme indiqué ici. Les régions d'intérêt (ROIs) destinées à la correction du fond pour les signaux des canaux et à l'analyse cellulaire ont été définies à l'aide d'images seuil de l'émission de l'accepteur prises au début des expériences.En outre, comme illustré ici, les cellules exprimant une sonde en quantité suffisante ont été sélectionnées. Les rapports FRET QE et par émission sensibilisée par pixel, ainsi que le rapport FRET moyen par cellule, ont été calculés. L'inverse du rapport d'émission sensibilisée a été calculé et les deux rapports ont été normalisés.Sous la stimulation par la forskoline, les rapports FRET basés sur QE et SE détectent une activité accrue de l'AMP cyclique dans les chondrocytes. Les gels réticulés physiquement et les gels réticulés chimiquement ont montré une augmentation du rapport FRET QE au fil du temps, indiquant une réponse accrue de la signalisation de l'AMP cyclique à l'ajout de forskoline. Cette procédure peut être utilisée avec d'autres techniques de microscopie telles que la FRAP, le FRET en temps de vie (FLIM-FRET) et la mesure de l'anisotropie, afin de répondre à des questions telles que : quelles sont les différences de perméabilité et de signalisation cellulaire entre différents types de microtissus ?Étant donné que la réticulation est arrêtée près du PDMS, il est important de concevoir les moules pour les hydrogels réticulés par voie photochimique légèrement plus grands en diamètre que les hydrogels eux-mêmes.

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JoVE Journal

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, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

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FRET Imaging en hydrogels en trois dimensions

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