Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.

Notre protocole aide à l’oxygénation des sphéroïdes multicellulaires à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel. En utilisant cette méthode, on peut produire des milliers de microtissus sphéroïdes colorés par sonde d’oxygène et les utiliser ensuite dans des applications d’impression 3D. Par exemple, les greffes de tissu osseux vascularisé.

La sonde à oxygène proche infrarouge est compatible avec l’utilisation d’autres colorants tels que la coloration par fluorescence verte de Finalement, cela permet une analyse à long terme en direct et multi-paramètres. Transférez les tampons PDMS à micro-motifs d’un flacon de stockage vers une boîte de Petri stérile et séchez à l’air avec la surface lisse dans les conditions de flux d’air laminaire stérile pendant 10 minutes. Placez chaque tampon au milieu du puits d’une plaque de culture de tissu stérile de 12 puits.

Sécher à l’air libre pendant une à deux minutes avec un couvercle ouvert. Préparer 50 millilitres de solution d’agarose homogène à 3 % et ajouter immédiatement environ deux millilitres de solution d’agarose chaude à chaque puits des plaques à 12 puits pour recouvrir le tampon PDMS inséré. Solidifiez l’agarose pendant 20 minutes en l’incubant sous un flux d’air stérile.

À l’aide d’une spatule stérile, tournez l’agarose avec le tampon PDMS intégré à l’envers dans chaque puits. Ajouter environ 200 microlitres d’eau stérile sur la face supérieure lisse du timbre. Détachez-le de l’agarose avec une spatule et retirez-le du puits.

Ajouter un millilitre de milieu de culture cellulaire stérile correspondant aux timbres d’agarose pour une utilisation directe. Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Avant utilisation, réchauffer les plaques à micro-motifs d’agarose pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone.

Rincer la culture cellulaire de confluence de 70 % à 90 % avec du PBS préchauffé. Ajouter la solution enzymatique dissociante et incuber pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Plus tard, neutralisez la trypsine avec un milieu de culture cellulaire complet contenant 10% de FBS.

Pour obtenir une suspension à cellule unique, dissocier les agrégats cellulaires à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres sur le dessus de la pipette sérologique. À l’aide d’une chambre de comptage, comptez le nombre de cellules par millilitre de la suspension cellulaire. Diluer la suspension cellulaire à 500 000 cellules par millilitre et y ajouter une solution de sonde d’oxygène concentrée.

Retirer les vieux milieux des puits à micromoules de la plaque de culture cellulaire recouverte d’agarose à 12 puits et ajouter un millilitre de la suspension cellulaire préparée aux puits. Cultivez les sphéroïdes dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant deux à cinq jours en présence continue de la sonde à oxygène pour assurer sa charge pendant la formation et le compactage des sphéroïdes. Fermez l’extrémité d’une cartouche stérile de trois centimètres cubes avec un capuchon et remplissez-la d’encre bio par pipetage.

Insérez un piston dans la cartouche et maintenez-le à l’envers. Retirez le capuchon de la pointe et poussez le piston vers l’encre bio jusqu’à ce que tout l’air de la cartouche soit retiré. Refroidir l’encre bio dans le manteau chauffant de la bioimprimante à 23 degrés Celsius.

Vaporisez la bioimprimante avec de l’éthanol à 70% et séchez-la avec du papier absorbant. Vissez un adaptateur de pression sur le dessus de la cartouche. Montez une aiguille conique en polyéthylène de calibre 22 sur la cartouche.

Installez la cartouche dans le manteau chauffant sur la tête d’impression à base d’extrusion. Branchez l’entrée de pression et ouvrez le clip sur l’entrée. Chargez le fichier G-code de votre conception dans le logiciel d’impression.

Commencez la mesure de la longueur de l’aiguille. Régulez la pression d’impression en distribuant un peu d’encre bio dans une boîte de Petri stérile. Installez une plaque à six puits, ouvrez la plaque de puits, fermez la hotte et imprimez.

Après l’impression, laissez les échafaudages être physiquement réticulés pendant 10 minutes à cinq degrés Celsius. Irradiez les échafaudages imprimés pendant 60 secondes avec une lampe LED ultraviolette. Ajouter immédiatement le milieu de croissance correspondant contenant une solution antibiotique double à tous les puits avec des grilles bioimprimées.

Cultivez les échafaudages à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone. Pour l’observation microscopique, transférez une grille de gaufres imprimée dans un couvercle de boîte de microscopie avec un support d’imagerie. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, lavez doucement les sphéroïdes pré-colorés de la sonde à oxygène des micro-puits d’agarose et transférez-les dans un tube inférieur conique de 15 millilitres.

Pour assurer la collecte de tous les sphéroïdes d’un puits à micro-motifs, rincez le puits une à trois fois avec le millilitre supplémentaire de milieu de culture et combinez toutes les suspensions sphéroïdes dans un seul flacon. Laissez le flacon vertical jusqu’à 10 minutes pour laisser les sphéroïdes s’installer sur le fond. Retirez soigneusement le support du tube en laissant les sphéroïdes intacts.

Ajouter un milieu de culture frais qui sera suffisant pour au moins 20 sphéroïdes par plat d’échantillon et remettre doucement les sphéroïdes en pipetage. Ajoutez immédiatement un volume égal de suspension sphéroïde à chaque puits de microscopie pré-enduit. Laissez les sphéroïdes pendant une heure à 37 degrés Celsius pour bien se fixer à la surface de la microscopie.

Retirez bien le milieu de la microscopie et rincez une fois avec un support d’imagerie. Ajoutez la quantité exacte de support d’imagerie à l’échantillon. Installez bien la microscopie avec des sphéroïdes colorés au stade de la microscopie.

À l’aide de l’objectif de grossissement 10X, prévisualisez l’échantillon en lumière de transmission. Faites une mise au point préliminaire sur les sphéroïdes, localisez-les au centre de l’image et amenez l’objectif avec le grossissement élevé requis à la position de travail. Concentrez-vous sur le mode de lumière de transmission dans la section transversale équatoriale du sphéroïde.

Ajustez les paramètres de collecte des signaux de fluorescence ou de phosphorescence des canaux spectraux de référence et sensibles de la sonde à oxygène et démarrez le processus d’imagerie. Ouvrez le fichier vsi avec les données d’intensité de la sonde d’oxygène provenant des canaux spectraux de référence et sensibles en mode fusionné. Ouvrez la fenêtre de la fonction d’analyse de rapport dans le menu de mesure.

Choisissez l’intensité du canal de référence comme numérateur et l’intensité du canal sensible comme dénominateur pour le calcul R. Dans la fenêtre d’analyse des rapports, appliquez les paramètres de seuil d’intensité correspondants à chaque canal spectral pour soustraire l’arrière-plan de l’image d’intensité fusionnée. Les masques ROI appliqués aux images sphéroïdes déterminent les bordures sphéroïdes.

Augmentez les valeurs de seuil jusqu’à ce que l’arrière-plan de l’image soit uniformément noir. Dans la fenêtre d’analyse des ratios, ajustez le facteur de mise à l’échelle de l’image de ratio jusqu’à ce que l’image d’aperçu fournisse la résolution souhaitée du dégradé R. L’image de la distribution du rapport d’intensité est ajoutée en tant que calque à l’image multicanal d’origine.

Dans la fenêtre de l’image multicanal, activez le calque avec une barre de fausses couleurs. Déterminez manuellement les limites de liaison et de dissociation d’un histogramme de distribution de rapport à l’aide de l’option de mise à l’échelle fixe de la fenêtre d’affichage ajuster. Ouvrez l’image de lumière de transmission correspondante des sphéroïdes.

Choisissez la fonction de règle linéaire et mesurez le diamètre des sphéroïdes. Exportez les données sous forme de fichier de table de feuille de calcul. Choisissez le retour sur investissement de la taille et de la forme requises et appliquez-le à la périphérie et au noyau hypoxique du sphéroïde.

Transformez le ROI en objet de mesure pour analyser le R moyen à l’intérieur du ROI choisi. Exportez les données dans un format de tableau compatible avec les feuilles de calcul. Appliquez des mesures à chaque section microscopique des sphéroïdes pour obtenir l’ensemble de données des diamètres de sphéroïdes RC et RP afin d’effectuer d’autres calculs et comparaisons statistiques.

Combinez toutes les données dans un seul fichier de feuille de calcul. La sonde MMIR1 a un faible photoblanchiment et convient à l’étude en temps réel de la réponse respiratoire rapide dans les sphéroïdes hDPSC à différents stimuli mitochondriaux. Le FCCP n’a montré qu’un léger effet de découplage dans certaines zones, puis une légère diminution de la respiration cellulaire.

D’autre part, la roténone a fortement inhibé la respiration, ce qui a entraîné une réoxygénation sphéroïde et une dissipation des gradients d’oxygène de la périphérie au noyau dans environ 80 secondes après la stimulation. En utilisant le protocole automatisé de calcul du rapport d’intensité pixel par pixel fourni par le logiciel d’imagerie, les gradients d’oxygène périphérique-noyau détectés en temps réel dans tous les types de sphéroïdes sont visualisés avec la périphérie oxygénée et les niches hypoxiques au centre. Les graphiques ci-dessous représentent les profils de rapport des sections transversales des sphéroïdes équatoriaux pour différents types de sphéroïdes.

Par rapport aux sphéroïdes hDPSC homocellulaires, les sphéroïdes hDPSC à HUVEC hétérocellulaires avaient des gradients significativement plus raides. Le gradient d’oxygène de la périphérie au noyau dans les sphéroïdes hétérocellulaires est probablement généré par hDPSC dans leur composition selon l’oxygénation des sphéroïdes hDPSC ayant une forte activité respiratoire. Les graphiques montrent que les sphéroïdes hDPSC bioimprimés avaient une périphérie significativement oxygénée que les sphéroïdes mesurés avant la bioimpression, tandis que leur oxygénation du noyau avait des valeurs similaires.

Si des précipitations occasionnelles de la sonde perturbent la formation uniforme de sphéroïdes, filtrer ou centrifuger la solution de la sonde à grande vitesse avant utilisation. La correction de la mesure de la longueur de l’aiguille et de la régulation de la pression sont des étapes essentielles pour faire correspondre le taux de bio-impression et le diamètre de la jambe de force et les microagréglés de bio-impression dans un échafaudage poreux. Choisissez les paramètres de microscopie pour l’imagerie de sonde sensible à l’oxygène, en tenant compte de leur effet sur la photostabilité de la sonde.

L’imagerie de l’oxygène est compatible avec de nombreux types de mesures de microscopie en direct. Après l’imagerie, on peut également effectuer une immunofluorescence, extraire des protéines pour le Transfert Western ou effectuer une analyse de l’expression génique.