Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Un protocole pour l’impression robotisée de sphéroïdes de cellules cancéreuses dans un format de plaque à 96 puits à haut débit à l’aide d’un système aqueux biphasé est présenté.

L’objectif global de cette procédure est de former le pH des cellules cancéreuses dans un format standard à haut débit afin de les utiliser dans les tests de médicaments anticancéreux. Ceci est accompli en dissolvant d’abord deux polymères, le polyéthylène glycol et le dextran dans un milieu de culture cellulaire à des concentrations prédéterminées pour former un système aqueux en deux phases réussi. La deuxième étape consiste à préparer les cellules d’intérêt à deux fois la densité cellulaire souhaitée et à mélanger la suspension cellulaire avec un volume égal de phase aqueuse de dextran.

Remplissez ensuite une plaque de 96 puits avec la phase aqueuse de polyéthylène glycol et distribuez des gouttelettes inférieures au microlitre de gouttes de cellule contenant de la phase dextran dans les puits à l’aide d’un robot de manipulation de liquides. L’étape suivante consiste à confirmer la formation de sphéroïdes dans les plaques de 96 puits après 24 heures d’incubation et à ajouter directement des médicaments anticancéreux d’intérêt dans les puits. Enfin, un test standard de viabilité compatible avec un lecteur de plaques est utilisé pour montrer le pourcentage de viabilité des stéroïdes traités par médicament normalisé par rapport aux sphères de contrôle non traitées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la méthode de la chute suspendue ou l’approche du puits micro-fabriqué est qu’elle ne nécessite pas de plaques ou de dispositifs personnalisés et permet la formation de sphères à haut débit et le test de drogues. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le cancer et à accélérer la découverte de chimiothérapies anticancéreuses. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie du cancer car elle permet un criblage à haut débit de composés chimiques avec des modèles tumoraux plus pertinents pour identifier de nouveaux médicaments anticancéreux.

Les personnes novices dans cette méthode formeront commodément des stéroïdes de cellules cancéreuses et des plaques de micro-puits et mèneront facilement des expériences de traitement médicamenteux en utilisant des vêtements de laboratoire standard et des outils robotiques. Pour commencer, pesez 0,5 gramme de polyéthylène glycol et ajoutez-le à 9,5 millilitres de milieu de croissance complet dans un tube conique stérile de 15 millilitres Vortex, le mélange pendant une minute pour préparer 10 millilitres d’une phase aqueuse de polyéthylène glycol de 5 % par volume. Pesez ensuite 0,128 gramme de dextran et ajoutez-le à 0,87.

Deux millilitres de milieu de croissance complet dans un microtube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre Vortex. Ce mélange pendant une minute pour préparer un millilitre d’une phase aqueuse de dextran de 12,8 % en poids par volume. Placez les solutions de polyéthylène glycol et de dextran dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pour aider à la dissolution complète. Assurez-vous que les bouchons restent au-dessus du niveau de l’eau pour éviter une éventuelle contamination après une heure. Retirez la solution de polyéthylène glycol pour le visage et chargez-la dans une seringue en plastique stérile de cinq millilitres.

Passez la solution à travers un filtre supérieur de seringue à pores de 0,2 micron pour éliminer toutes les impuretés. Conservez les solutions de polyéthylène glycol et de dextran à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures avant de les utiliser. Cultiver des cellules cancéreuses d’intérêt telles que la lignée cellulaire du cancer du sein M-D-A-M-B 1 57 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90 à 100 %.

Ensuite, récoltez les cellules à l’aide de techniques standard et comptez le rendement sur un hémocytomètre, remettez la pastille en suspension à une concentration de 50 millions de cellules par millilitre dans un mélange de solution moitié croissance, moitié brin, moitié brin. Cela garantit une densité d’environ 15 000 cellules par gouttelette de 0,3 microlitre distribuant 50 microlitres de la phase aqueuse de polyéthylène glycol filtrée à 5 % dans chaque puits d’une plaque non adhérente à 96 puits qui a été pré-codée avec onic comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. L’édition du polyéthylène glycol peut être réalisée manuellement avec la pipette multicanaux ou de manière robotisée avec un manipulateur de liquides à l’aide d’une pipette, mélangez la suspension cellulaire en pipetant doucement de haut en bas jusqu’à Resus.

Suspendez toutes les cellules qui se sont stabilisées au fil du temps. Ajoutez 20 microlitres de suspension à chaque autre puits à partir d’une colonne d’une plaque de 384 puits. Allumez ensuite le manipulateur de liquide et installez la tête de pipetage.

Pour enregistrer les coordonnées, placez la plaque source, la plaque de destination et les boîtes d’embout de pipette à des endroits définis sur le poste de travail du manipulateur de liquides. À l’aide du manipulateur de liquide automatisé, sélectionnez un volume de mélange, soit environ un tiers du volume de suspension de la cellule, et chargez une colonne de barils à partir de la tête de pipetage du manipulateur de liquide avec des pointes de pipette de mélange depuis le poste de travail. Utilisez le manipulateur de liquide pour mélanger la suspension cellulaire dans la plaque source à 384 puits.

Ensuite, éjectez les pointes dans une boîte d’embouts vide. Ensuite, chargez une colonne de barils à partir de la tête de pipetage avec des pointes de pipette de distribution de 10 microlitres. À l’aide du manipulateur de liquide, aspirez 0,3 microlitre de suspension cellulaire de la plaque source dans chaque pointe de pipette.

Ensuite, distribuez la suspension cellulaire dans les puits d’une colonne de la plaque de destination contenant 50 microlitres de la phase de polyéthylène glycol à 5 %. Utilisez une hauteur de distribution de 0,5 millimètre et distribuez la goutte à un débit d’un microlitre par seconde ou plus lentement. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les colonnes de la plaque de destination soient recouvertes de cellules une fois terminé, retirez soigneusement la plaque de destination du poste de travail et incubez les cellules dans un environnement humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures avant tout traitement médicamenteux.

Confirme visuellement la formation de stéroïdes dans chaque puits de la plaque de 96 puits après 24 heures de culture. Utilisez la dilution en série pour préparer un médicament d’intérêt tel que le cisplatine pour les tests. Diluer la solution mère du médicament dans un milieu de culture de sorte que chaque dilution soit deux fois supérieure à la concentration finale souhaitée.

Jusqu’à cinq concentrations différentes peuvent être testées par 96. Versez 50 microlitres de la solution médicamenteuse dans la phase de polyéthylène glycol de chacun. Utiliser deux colonnes de huit puits par groupe de traitement, y compris un groupe témoin où le milieu seul est ajouté.

Incuber des stéroïdes avec le médicament pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à l’abri de la lumière. Après 48 heures, préparez des dilutions de médicament frais et renouvelez le médicament en ajoutant 50 microlitres supplémentaires de milieu contenant du médicament frais à la concentration souhaitée. Incuber le PHE pendant encore 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à l’abri de la lumière.

Ensuite, ajoutez un réactif de viabilité cellulaire à chaque puits comme décrit dans le protocole de texte ci-joint et incubez la plaque pendant six heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à l’abri de la lumière. Une fois le test terminé, placez la plaque dans un lecteur de microplaques et lisez le signal fluorescent à 560 et 590 nanomètres de longueurs d’onde d’excitation et d’émission respectivement. Le criblage à haut débit de médicaments anticancéreux nécessite une méthode reproductible pour former des centaines de stéroïdes de taille uniforme.

Le graphique présenté ici met l’accent sur la reproductibilité de cette méthode pour former des sphéroïdes. Dans une plaque standard de 96 puits d’un diamètre moyen de 332 microns avec un écart-type inférieur à 10 %, les variations de diamètres des stéroïdes se sont avérées typiques d’une distribution normale. Lorsque les sphéroïdes ont été exposés pendant quatre jours à des concentrations variables de cisplatine, un médicament chimiothérapeutique clinique, ils ont montré une réponse dose-dépendante aux traitements.

La concentration résultante de 50 % de médicament à la dose létale s’est avérée être de 4,67 Traitement médicamenteux micromolaire à des concentrations létales de cellules cancéreuses désintégrées Une fois maîtrisée, cette technique peut être achevée en environ deux heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier rapidement la formation aqueuse en deux phases avant de procéder aux expériences d’impression de stéroïdes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cryosection des stéroïdes, la coloration immunohistochimique des échantillons et d’autres tests biologiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les cibles moléculaires des médicaments dans les stéroïdes à cellules cancéreuses.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de former des cultures de cellules cancéreuses en 3D de manière pratique et d’effectuer des tests de médicaments à haut débit à l’aide de plaques et d’appareils standard.