Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

L’objectif global de cette procédure est de développer un modèle hépatique tridimensionnel pour étudier les virus et les vecteurs viraux. Cette méthode permet d’étudier les processus biologiques dans un système tridimensionnel vascularisé avec des cellules humaines dont la physiologie diffère de celle des cellules de rongeurs dans un modèle de souris ou de rat. De plus, il s’agit d’une étape visant à améliorer le bien-être animal car il évite les expériences sur des animaux vivants et est, à long terme, destiné à remplacer entièrement les composants animaux.

Bien que nous ayons développé cette méthode pour étudier les vecteurs viraux pour le transfert de gènes, elle peut également être appliquée à l’étude des virus vitaux infectieux et à d’autres domaines de recherche tels que la recherche sur le cancer. La démonstration de la procédure sera faite par Viola Rohrs, une technicienne de mon laboratoire. Pour le bien-être des animaux, seuls les animaux excédentaires ont été utilisés pour la présente étude et ont été sacrifiés pour d’autres expériences sur les animaux, c’est-à-dire

qu’aucun animal supplémentaire n’a été nécessaire pour obtenir les échafaudages hépatiques. Pour commencer, il faut d’abord développer la lignée de cellules hépatiques Hep G2. Ensemencez 15 millions de cellules dans des bouteilles T175 dans 30 millilitres de milieu contenant 10 % de sérum de veau fœtal et deux millimoles de gulatmine, de pénicilline et de streptomycine. Après quatre jours de culture, utilisez cinq minutes d’exposition à la solution de trypsine dans des conditions de culture pour détacher les cellules, puis récoltez-les.

Ensuite, faites tourner les cellules à 300 G pendant trois minutes. Ensuite, mettez-les en suspension dans quatre millilitres de PBS et obtenez un comptage cellulaire. Chaque bouteille devrait produire environ 45 millions de cellules.

600 millions de cellules sont nécessaires pour recellulariser la MEC du foie d’un rat. Pour recellulariser l’ECM, il faut d’abord mettre en place le système de bioréacteur contenant une chambre de profusion hépatique, un système de profusion, un réservoir de milieu et un piège à bulles. La procédure de recellularisation comporte deux étapes critiques.

L’une d’entre elles consiste à éviter de piéger des bulles d’air dans le système de profusion. La seconde est que l’ensemble du système doit être maintenu stérile. Tout d’abord, stérilisez ces composants du système de bioréacteur à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Deuxièmement, remplissez les tubes et la chambre de profusion stérilisée avec du fluide. Placez ensuite l’échafaudage hépatique de rat décellularisé dans la chambre de profusion hépatique. L’étape suivante consiste à utiliser des clips tubulaires pour connecter la veine porte canulée au système de profusion.

Placez maintenant le système de bioréacteur dans l’incubateur et connectez-le à une pompe péristaltique. Ensuite, équilibrez l’échafaudage avec 150 millilitres de milieu supplémenté sur cinq jours. Réglez le débit à 1,25 millilitre par minute.

Après cinq jours, débranchez le système de bioréacteur de la pompe et transférez-le dans une hotte stérile. Débranchez l’échafaudage hépatique du circuit de fluide. Ensuite, chargez une seringue de cinq millilitres de milieu contenant 300 millions de cellules Hep G2 et injectez les cellules via la veine porte, en évitant la formation de bulles d’air.

Laissez ensuite les cellules repeupler l’ECM pendant une heure sans faire fonctionner la pompe. Au bout d’une heure, démarrez la pompe à 1,25 millilitres par minute. Après 10 minutes, augmentez la pression à 2,5 millilitres par minute.

Après 20 minutes de plus, réglez la pompe à la vitesse de fonctionnement de 3,75 millilitres par minute. Après 30 minutes à pleine vitesse de la pompe, éteignez la pompe, ajoutez 300 millions de cellules supplémentaires et laissez les cellules remplir l’ECM pendant une heure. Au bout d’une heure, augmentez progressivement la circulation en ajustant progressivement la vitesse de la pompe comme auparavant.

Laissez maintenant la culture recellulariser le foie pendant deux semaines. Tous les deux jours, remplacez 50 millilitres de milieu et mesurez les paramètres physiologiques à partir d’un échantillon du milieu utilisé. La production de vecteurs AAV est une procédure compliquée impliquant de nombreuses étapes qui sont résumées dans le protocole texte.

Dans cette section de la vidéo, certaines des étapes cruciales sont démontrées. Tout d’abord, produire, purifier et quantifier les vecteurs AAV. Produire brièvement les vecteurs AAV dans des flacons roulants et les purifier par centrifugation à gradient d’iodixanol.

Éliminer l’iodixanol résiduel par filtration sur des colonnes de filtration sur gel PD10. Déterminez ensuite la concentration du vecteur AAV par QPCR en utilisant l’ADN génomique AAV comme norme. Au total, 27 trillions de vecteurs AAV sont nécessaires par modèle.

Transduisons maintenant le modèle du foie. Tout d’abord, chargez dans une seringue 27 billions de vecteurs dans cinq millilitres de PBS. Le rouge de phénol peut être ajouté à 5 microgrammes par millilitre.

Ensuite, débranchez le foie du circuit de média et injectez les vecteurs dans le système. Une fois injecté, incubez le système pendant une heure sans pomper. Augmentez ensuite progressivement le débit comme décrit précédemment.

Plus tard, au fur et à mesure que le foie transduit est incubé pendant six jours, changez 50 millilitres du milieu tous les deux jours. À l’aide d’un scalpel, coupez des échantillons de chaque lobe du foie d’environ un demi-centimètre d’épaisseur et de 1,5 à deux centimètres de long. Incuber les tranches dans 4 % de paraformaldéhyde avec 4 % de saccharose pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant une minute par lavage. Après les lavages, les échantillons ont été incubés pendant la nuit dans du saccharose à 8 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, chargez les échantillons dans des cryomoules contenant un support de fixation.

Évitez d’introduire des bulles d’air. Une fois chargés, couvrez entièrement les échantillons avec un support de fixation et placez-les à moins 80 degrés Celsius. Une fois congelés, préparez des cryosections de 10 microns à partir des échantillons à l’aide d’un cryotome.

Colorez les échantillons au besoin pour confirmer la recellularisation. Pour l’analyse de l’expression génétique, prélevez des échantillons à l’aide d’un poinçon de biopsie de quatre millimètres. Pour évaluer la recellularisation, des cryosections ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine.

Les lobes de deux foies transduits et d’un foie témoin qui a été recellularisé, mais non transduit, ont tous été repeuplés avec des cellules de l’hépatite G2. L’expression de l’ARN et le titre du vecteur ont été quantifiés à partir de 28 biopsies à l’emporte-pièce de chaque modèle hépatique. Dans les deux modèles hépatiques transduits, 55 et 90 génomes de vecteurs par cellule ont été mesurés, ce qui est suffisant pour induire le silençage génique.

Aucun génome n’a été mesuré dans le témoin, comme prévu. L’expression d’EmGFP a été analysée par RT-PCR et western blot. La plupart des biopsies ont montré l’expression de l’ARNm de l’EmGFP et l’expression protéique de l’EmGFP.

L’immunodétermination des cryosections a montré que, partout où le modèle a été recellularisé avec succès, l’expression d’EmGFP pouvait également être observée. Ceci est indicatif d’une bonne expression du gène AAV. Ensuite, l’inactivation de la cyclophiline B humaine par AAV a été analysée par RT-PCR quantitative.

L’inactivation moyenne de la cyclophiline B humaine se situait entre 70 et 90 % sur tous les lobes des deux foies transduits. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier la distribution des virus et des vecteurs viraux dans le système d’organes tridimensionnel vascularisé. De telles études contribueront à améliorer les techniques actuelles de transfert de gènes et à développer de nouvelles stratégies antivirales.