Name: Un protocole pour lanalyse de lhépatite C de réplication (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Apprenez à analyser le cycle de réplication du virus de l'hépatite C en générant de l'ARN génomique HCV et en transfectant des cellules. Cette méthode permet d'étudier l'entrée virale, l'assemblage et la sortie des virions.

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Nous remercions F. Chisari d’avoir fourni la lignée cellulaire Huh-7.5.1. Nous tenons à remercier Justine Ho pour l’édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award et le National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 à V.A.

Un schéma général du protocole est illustré sur la figure 1. Une. Cells <ol><li> Préparer un milieu de croissance complet qui contient 10 à 15% de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mM acides aminés non essentiels, Hepes 10 mM, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 mg / ml), et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Maintenir les cellules Huh-7.5.1 13 dans du milieu complet de croissance contenant les suppléments ci-dessus pour l&#39;analyse in vitro de l&#39;hépatite C du cycle de réplication virale. </li><li> Culture souches virales en Huh-7.5.1 cellules avec le milieu de croissance complété spécifiée à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 2. Virus et constructions plasmidiques <ol><li> Générer l&#39;ADN complémentaire (ADNc) de l&#39;ARN du VHC forme et le cloner dans un vecteur plasmidique pour la facilité de la manipulation génétique. Remarque: La découverte de l&#39;hépatite fulminante japonais 1, JFH-1 (génotype 2a du VHC), isolat a été critique pour la recherche sur le VHC et estprincipalement utilisé pour étudier le cycle de 11 à 13 de la replication du VHC. Virus chimériques inter et intragénotypiques sur la base de JFH-1 du VHC sont couramment utilisés dans la recherche de 14 à 18. Construction de synthèse intragenotype 2a virus chimérique, FNX-VHC, et une souche rapporteur chimérique monocistronique a été décrit précédemment 19 et détails de construction sont au-delà du champ d&#39;application de ce protocole. </li><li> Utilisez le virus pFNX-VHC intragenotype 2a, car il contient un 5&#39;NTR, les régions et p7 structurelles, et une partie des régions non structurales NS2 (nucléotides 1 à 2878) de la souche parentale J6CF (NCBI accession no. AF177036), comme ainsi que les éléments non structuraux du JFH-1 souche virale (NCBI de no. AB047639). Remarque: FNX-HCV a été synthétisé sur la base de la séquence de HCV 2a Jc1 intragenotype chimérique signalé précédemment 15. </li><li> Générer un reporter chimérique construction virale monocistronique, la pFNX-Rluc, sur la base de la souche HCV-pFNX (ci-dessus à l&#39;étape 2.2) par insertion d&#39;un Rgène de la luciférase enilla entre l&#39;extrémité 5 &#39;NTR et le gène de la partie centrale (entre les nt 388 et 389). Ensuite, branchez le gène de la luciférase et le gène de base de cette construction en utilisant un virus de la maladie 2A de la fièvre aphteuse (F2A) de la séquence peptidique, qui fonctionnerait comme un signal de clivage. </li><li> Ingénieur de l&#39;ARN polymérase nul (Pol-) construction virale en utilisant soit le pFNX-VHC ou le pFNX-Rluc fond virale. Remplacer les polymérase NS5B résidus catalytiques, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de l&#39;un de ces squelettes virales avec des résidus d&#39;acides aminés AAG. </li></ol> 3. L&#39;ARN du VHC in vitro de transcription <ol><li> Utiliser un virus chimérique intragenotype 2a FNX-VHC et FNX-VHC Pol null (Pol-) pour le VHC évaluation de la replication virale (Figure 2A). </li><li> Linéariser les plasmides viraux avec l&#39;enzyme de restriction XbaI, puis traiter avec la nucléase de haricot mungo à générer des extrémités franches. Purifier les plasmides digérés par chromatographie échangeuse d&#39;anions. Vérifier l&#39;intégrité of le plasmide linéarisé en soumettant l&#39;ADN à une électrophorèse sur gel d&#39;agarose (figure 2B). </li><li> Transcrire les plasmides viraux linéarisées en utilisant la polymérase ARN-T7. </li><li> Purifier l&#39;ARN traité à la DNase nouvellement synthétisé en utilisant un kit de purification d&#39;ARN. </li><li> Vérifiez la production d&#39;ARN par électrophorèse sur gel d&#39;agarose (figure 2C). </li><li> Quantifier l&#39;ARN par spectrophotométrie. </li><li> Stocker l&#39;ARN généré en -80 ° C à 10 pg aliquotes de travail. Remarque: Pour réduire au minimum la variation de la qualité de l&#39;ARN à l&#39;intérieur de chaque plan d&#39;expérience en transcrivant tout l&#39;ARN de chaque échantillon et témoin viral dans le même temps. </li></ol> 4. L&#39;ARN du VHC transfection et prélèvement d&#39;échantillons <ol><li> Récolter les cellules Huh-7.5.1 en utilisant la trypsine. </li><li> Pour rincer les cellules, centrifugeuse et remettre la suspension à deux reprises avec les médias froid sérique bas. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de sérum faible à 1 x 10 7 cellules par ml. </li><li> Mélanger un total de 10 &amp; #956; g d&#39;ARN viral transcrit avec 400 ul de cellules remises en suspension (4 x 10 6 cellules) dans une cuvette d&#39;électroporation de 0,4 cm de large. Transfecter les cellules par électroporation à 270 V, 100 Ω, et 950 pF. </li><li> Remettre en suspension les cellules par électroporation dans 10 ml de milieux de culture avec 15% de FBS. Remarque: Augmentation de la capacité de survie des cellules par électroporation est observée lorsque les cellules Huh-7.5.1 ont été cultivées dans 15% de sérum bovin fœtal. </li><li> Plaquer les cellules dans les deux flacons T-25 (1,2 x 10 ~ 6 cellules par flacon) et des plaques de 48 puits (1 x 10 4 cellules par puits) pour chacun des points de temps suivants: 4, 48 et 96 h. </li><li> Remplacez le support à 4-8 heures après la transfection avec les médias frais de croissance supplémenté avec 10% de FBS pour enlever les débris de cellules mortes des flacons et des plaques de culture. </li><li> Les surnageants de culture de cellules de récolte à la 48, 96 points de temps d&#39;heure et éliminer les débris cellulaires à partir d&#39;échantillons recueillis par centrifugation des cellules à 1500 rpm pendant 10 min à 4 º C. </li><li> Conserver les surnageants acellulaires à -80 º C. Lyser les cellules pour la protéine et l&#39;analyse d&#39;ARN par transfert de Western et inverse-PCR quantitative transcription au niveau des points de temps indiqués. </li></ol> 5. Transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) pour l&#39;évaluation des copies VHC génomique <ol><li> Effectuer un deux-étape de RT-qPCR pour déterminer la génomique nombre de copies d&#39;ARN du VHC. </li><li> Transcrire inverse 1 pg d&#39;ARN cellulaire total en utilisant la transcriptase inverse et une amorce spécifique du VHC brin sens qui se lie à 5&#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) ou une amorce spécifique de gène de ménage peptidylprolyl isomérase G (R ppig : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). Inverser aussi transcrire FNX-ARN du VHC (généré à l&#39;étape 3) de copies du génome connus (10 janvier-10 septembre étalon) de VHC brin sens primaire. </li><li> Effectuer qPCR en utilisant 50 ng de l&#39;ADNc transcrit résultant en utilisant des amorces spécifiques du VHC (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) et liaison à l&#39;ADN colorant vert contenant qPCR superbe mélange. Effectuer qPCR pour le ménage gène ppig ainsi (amorces ppig F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; ppig R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Remarque: Pour le calcul du niveau de l&#39;ARN du VHC intracellulaire précise à travers des échantillons, utiliser gène de ménage cellulaire, ppig , le niveau d&#39;expression (le cycle Ct) pour la normalisation. Utilisez le nombre de copies du génome FNX-VHC comme la norme pour la détermination du nombre de copies. </li><li> Utiliser les conditions suivantes lors de l&#39;exécution qPCR pour déterminer le nombre de copies d&#39;ARN du VHC: 95 º C pendant 15 secondes et 60 &#160; º C pendant 30 secondes (40 cycles) en utilisant le système de PCR en temps réel. </li><li> Voir les figures 3A et 3B pour des résultats de réplication du génome. </li></ol> 6. Western Blot L&#39;analyse pour la détection du VHC Protein Expression (figure 3C) <ol><li> Utilisez lysats cellulaires frARN viral om transfectées à 96 heures après transfection de protéines analyse western blot. </li><li> Résoudre le lysat cellulaire en utilisant une SDS-PAGE et transfert de polyfluorure de vinylidène (PVDF). </li><li> Bloquer la membrane en utilisant une solution de blocage contenant 5% de lait écrémé, 0,2% de Tween 20 dans du tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps monoclonal de souris primaire NS3 (une dilution à 1 000) et de la bêta-actine (une dilution à 5000). </li><li> Ajouter IgG de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (1 en 5000 dilution) et de détecter par chimiluminescence. </li></ol> 7. Immunofluorescence (IFA) <ol><li> Fixer les cellules infectées par le VHC et transfectées avec du méthanol pendant 30 min à -20 ° C pour immunofluorescence. </li><li> Laver la cellule avec du PBS à trois reprises et bloquer avec IFA tampon de blocage. </li><li> Utilisez polyclonaux de lapin anti-NS5A principalement anticorps (aimablement fourni par le Dr Dasgupta, UCLA) ou monoclonal de souris anti-DSRNA J2 anticorps à une dilution de 1:200 (1 pg / ml) et incuber pendant 5 heures à une nuit à 4 º C. </li><li> Laver les cellules avec du PBS à trois reprises après l&#39;anticorps primaire. </li><li> Ajouter de chèvre anti-IgG de lapin-488 ou l&#39;anticorps de chèvre anti-IgG de souris-594 anticorps polyclonal secondaire à une dilution de 1:1000 (1 pg / ml) polyclonal secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec du PBS trois fois et les noyaux des taches à l&#39;aide de colorant Hoechst et vue en utilisant un microscope fluorescent (figure 3D). </li></ol> 8. Mesure Virus Titer <ol><li> Plate naïfs cellules Huh-7.5.1 à environ 3 x 10 3 cellules / puits en utilisant une plaque de 96 puits. Le lendemain, effectuer des dilutions en série de 10 fois de surnageant de culture sans cellules récoltées à partir de cellules transfectées avec de l&#39;ARN du VHC en utilisant des milieux de croissance et inoculer en triple sur les cellules Huh-7.5.1. </li><li> Fixer les cellules à 72 heures après l&#39;infection en utilisant du méthanol (pendant 30 min à -20 </sup&gt; º C) et immunomarquage pour le VHC protéine NS5A comme indiqué dans la section 7. </li><li> Utilisez la plus forte dilution de compter pour les foyers positif NS5A et calculer le nombre moyen de se concentrer unité de formation (FFU) par millilitre. Voir Figure 4 pour le VHC titre. </li></ol> 9. Renilla Reporter Essai de génome viral de réplication et de l&#39;infectiosité <ol><li> Pour l&#39;évaluation de la réplication du génome viral, l&#39;ARN du VHC-plaque électroporation des cellules Huh-7.5.1, en ​​triple exemplaire dans des plaques de 48 puits (1 x 10 4 cellules / puits). </li><li> Lyse des cellules avec 75 ul de tampon de lyse passive au 6 h, 48 h et 96 h post-transfection. </li><li> Basculez les plaques doucement pendant 15 min à température ambiante et conserver à -80 ° C. </li><li> Pour mesurer l&#39;activité enzymatique de la luciférase de Renilla, décongeler le lysat de protéine luciférase de Renilla et les réactifs de dosage à la température ambiante. </li><li> Ajouter 20 ul de lysat de protéine par puits d&#39;une 96-wel<html> l plaque de luminescence blanche et placer la plaque dans un luminomètre. </li><li> Distribuer 100 ul de Renilla réactif de dosage (coelentérazine substrat + tampon) par puits et après un délai pré-lire 2 sec; intégrer la lumière émise pendant 10 secondes. </li><li> Calculer la moyenne et l&#39;écart type pour chaque échantillon à partir des valeurs de luciférase de triplicats biologiques et soumettre les données à l&#39;analyse statistique (figure 5). </li><li> Pour évaluer l&#39;infectiosité, inoculer 500 pi de surnageant acellulaire obtenus à partir de cellules transfectées ARN VHC pour les points de temps indiqués (48 h et 96 h), en trois exemplaires sur naïfs cellules Huh-7.5.1 dans des plaques à 48 puits. </li><li> Remplacer l&#39;inoculum viral avec 500 pi de milieu frais par puits après 6 heures après l&#39;infection. </li><li> Lyse des cellules à 48 heures après l&#39;infection et sous réserve de Renilla dosage de la luciférase comme décrit dans les étapes 08.02 à 08.07 (figure 5). </li></ol>itre &quot;. Analyse statistique&gt; 10 <ol><li> Les barres d&#39;erreur dans les graphiques indiquent les écarts-types (SD). Les valeurs de p ont été calculées par le test t non apparié. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette illustration décrit un procédé d&#39;analyse du cycle de réplication du virus de l&#39;hépatite C. VHC est un agent pathogène humain et le protocole sur la biosécurité prescrit devra être strictement suivies. Les systèmes de culture de cellules de VHC infectieuses ont été décrites précédemment 11-13,16,17. Il ya quelques points essentiels nous mettons en œuvre en suivant le protocole illustré. Premièrement, il est d&#39;une grande importance d&#39;avoir une bonne qualité de l&#39;ARN intact pleine longu...

L&#39;hépatite C (VHC) provoque une cirrhose et un cancer du foie. Elle touche 170 millions de personnes dans le monde avec 350 000 personnes meurent chaque année 1-3. Le VHC est un virus à ARN à brin positif ayant une taille de génome de 9,6 kb. Le génome du VHC est traduit en une seule polyprotéine de ~ 3000 résidus d&#39;acides aminés qui est clivée de manière protéolytique par diverses proteases cellulaires et virales en 10 polypeptides. Le VHC est le virus prototype du genre Hepacivirus et appartient à la famille des Flaviviridae 4. Lors de l&#39;exposition, le VHC établit une infection chronique chez 80% des individus. L&#39;infection est souvent asymptomatique et en temps opportun diagnostic peut permettre une intervention thérapeutique pour prévenir la détérioration du foie. Le traitement actuel est sous-optimale et aucun vaccin n&#39;est disponible 5,6. L&#39;étiologie de l&#39;hépatite C a été décrite pour la première en 1989 7. Etudier la réplication du VHC est important pour l&#39;hépatite C vaccin et la recherche de traitement, mais il avait étélongue entravée par l&#39;absence d&#39;un système de culture virale efficace. Un clone moléculaire du VHC a été montré pour être infectieux chez les chimpanzés sur inoculation intrahépatique 8. Par la suite, des réplicons du VHC sub-génomiques ont été décrites, qui ont permis de disséquer l&#39;étape de réplication du génome viral dans un système de 9,10 de la culture cellulaire. Découverte d&#39;un VHC de génotype 2a isoler JFH-1 (hépatite fulminante-1 japonais), capable d&#39;infecter la culture cellulaire a ouvert de nouvelles voies pour la recherche de la réplication du VHC 11-13. Souche de génotype 2a JFH-1 des systèmes de culture à base infectieuses basé virus chimériques inter-et intra-génotypiques et VHC de génotype 1 sont disponibles ainsi 14-18. Nous avons utilisé avec succès JFH-1 et le VHC souche intragenotype 2a virus chimère pour obtenir la haute résolution profilage fonctionnelle carte de domaines protéiques et éléments agissant en cis d&#39;ARN 19,20. Selon cette étude, nous décrivons ici un système de culture efficace couramment utilisé qui permetl&#39;étude de différentes étapes du cycle de replication du VHC et de l&#39;interaction hôte-pathogène. Nous présentons des tests virologiques pour évaluer la réplication du génome viral et de l&#39;infectiosité de novo intragenotype 2a du VHC et un VHC de journaliste en Renilla.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s milieu (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Acide aminé non essentiel</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Sérum réduit, sans phénol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>L’Institut de recherche Scripps</td><td>La lignée cellulaire a été aimablement fournie par le Dr Francis Chisari au Dr Arumugaswami dans le cadre d’un MTA exécuté entre l’Institut de recherche Scripps et le Cedars-Sinai Medical Center</td>Plasmides (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc et pFNX-Rluc Pol null)&nbsp ;<td></td></tr><tr><td></td><td>Les</td><td></td><td>plasmides du VHC ont été synthétisés par le Dr Arumugaswami à l’aide d’oligonucléotides qui se chevauchent.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase de haricot mungo</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Système de production d’ARN à grande échelle</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>anticorps monoclonal anti-ARNdb de souris J2&nbsp ;</td><td>Anglais & Conseil scientifique Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>IgG anti-lapin pour chèvre Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin pour chèvre Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Emballage de membrane PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueur de qualité buvard Lait écrémé en poudre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-virus de l’hépatite C NS3 [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-virus de l’hépatite C NS3 [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP)&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Réactifs de détection par transfert</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 système de PCR en temps réel</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi Detection System (luminomètre)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour l&#39;analyse de l&#39;hépatite c de réplication

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

L&#39;hépatite C (VHC) affecte 3% de la population du monde et provoque des maladies graves du foie comme l&#39;hépatite chronique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le VHC est un virus à ARN enveloppé de la famille des Flaviviridae. Le traitement actuel n&#39;est pas pleinement efficace et provoque des effets secondaires indésirables. Il n&#39;ya pas de vaccin disponible VHC. Ainsi, la poursuite des efforts est nécessaire pour développer un vaccin et une meilleure thérapie. Un système de culture cellulaire du VHC est essentielle pour l&#39;étude des diverses étapes de la croissance de VHC, y compris l&#39;entrée virale, la réplication du génome, à l&#39;emballage, et la sortie. Dans la procédure actuelle présentée, nous avons utilisé un virus de type sauvage intragenotype 2a chimérique, FNX-VHC, et un virus recombinant FNX-Rluc portant un gène rapporteur de la luciférase Renilla pour étudier la réplication du virus. Une lignée cellulaire d&#39;hépatome humain (Huh-7 repose) a été utilisé pour la transfection in vitro de transcrits ARN génomiques du VHC. Surnageants de culture sans cellules, des lysats de protéines et total ARN ont été récoltés à divers moments post-transfection pour évaluer la croissance du VHC. Génome HCV état de réplication a été évaluée par RT-PCR quantitative et la visualisation de la présence de HCV ARN double brin. L&#39;expression de la protéine du VHC a été vérifiée par blot et immunofluorescence dosages Western en utilisant des anticorps spécifiques des protéines du VHC NS3 et NS5A. les cellules transfectées de l&#39;ARN du VHC libérés des particules infectieuses dans le surnageant de culture et le titre viral a été mesuré. dosages de la luciférase ont été utilisées pour évaluer le niveau de réplication et l&#39;infectiosité de reporter le VHC. En conclusion, nous présentons diverses analyses virologiques pour caractériser les différentes étapes du cycle de réplication du VHC.

Virus de l&#39;hépatite C est un virus à ARN. Ainsi, à des fins de manipulation génétique, l&#39;ADNc génomique du VHC a été cloné dans un vecteur plasmidique bactérien. Une séquence de promoteur de l&#39;ARN polymerase T7 a été introduit juste avant l&#39;extrémité 5 &#39;du génome de HCV. Un schéma général de l&#39;analyse du HCV flux de travail est présentée en figure 1. Pour générer l&#39;ARN génomique du VHC avec précision l&#39;extrémité 3 &#39;, le génome du VHC contenant le plasmide est coupé av...

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent pathogène humain majeur qui provoque des troubles hépatiques, notamment la cirrhose et le cancer. Un système de culture cellulaire infectieuse du VHC est essentiel pour comprendre le mécanisme moléculaire de la réplication du VHC et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous décrivons ici un protocole permettant d’étudier les différentes étapes du cycle de réplication du VHC.

Un protocole pour l&#39;analyse de l&#39;hépatite C de réplication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier différentes étapes du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. Cette approche repose tout d'abord sur la génération de transcrits d'ARN génomique du VHC à partir de constructions plasmidiques du VHC linéarisées. La deuxième étape consiste à transfecter les cellules avec l'ARN du VHC. Ensuite, les cellules sont mises en culture à différents points de temps et soumises à divers tests. La dernière étape consiste à recueillir le surnageant de culture cellulaire afin de mesurer le titre viral, ainsi qu'à récolter les cellules transfectées pour l'extraction de protéines et d'ARN. Finalement, des analyses par RT-PCR, immunobuvardage (Western blot), test d'immunofluorescence et dosage du titre du VHC sont réalisées, démontrant ainsi un système de culture cellulaire infectieuse robuste pour le VHC.L'avantage principal de ce système de culture cellulaire du virus de l'hépatite C infectieux par rapport au système de réplicon du VHC est qu'il permet d'étudier l'entrée virale, l'assemblage des virions et les étapes d'égersion. Ce protocole peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la virologie de l'hépatite C, telles que la morphogenèse des virions et l'interaction hôte-pathogène. Les implications de cette technique s'étendent vers le développement de vaccins, car elle permet la caractérisation de souches virales atténuées pouvant être évaluées comme candidats vaccins potentiels.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le virus de l'hépatite C, elle peut également être appliquée à d'autres virus à ARN de la famille des Flaviviridae. En général, les personnes novices dans cette méthode seront confrontées au défi de produire un ARN génomique de haute qualité du VHC. L'étude du cycle de réplication complet du VHC est devenue possible en culture cellulaire suite à la découverte d'un isolat japonais de l'hépatite fulminante à VHC de génotype 2A. La démonstration visuelle des tests virologiques est essentielle, car ces tests exigent une expertise tant en techniques moléculaires qu'en techniques cellulaires. En utilisant un virus chimérique intragénotype 2A, F-N-X-H-C-V et F-N-X-H-C-V dépourvu de polymérase pour l'évaluation de la réplication virale, linéariser les plasmides viraux précédemment générés par digestion avec l'enzyme de restriction XBA-un dans un tube de deux millilitres. Ensuite, traiter les plasmides avec la nuclease de haricot mungo pour générer des extrémités franches.Purifiez les plasmides digérés par chromatographie d'échange d'anions. Vérifiez l'intégrité du plasmide linéarisé en soumettant l'ADN à une électrophorèse sur gel d'agarose. Ensuite, ajoutez le modèle d'ADN plasmidique linéarisé dans un tube de 0,2 millilitre contenant les composants de la réaction de la polymérase ARN T-sept pour synthétiser les transcrits d'ARN génomique du VHC.Purifiez l'ARN nouvellement synthétisé traité par la DNase à l'aide d'un kit de purification de l'ARN. Ensuite, vérifiez la production d'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose. Après cela, quantifiez l'ARN par spectrophotométrie.Détacher les cellules adhérentes de type Huh-7 à l’aide d’un traitement enzymatique à la trypsine et recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Après deux centrifugations successives, resuspendre le culot cellulaire dans un milieu pauvre en sérum, refroidi. Après répétition de la centrifugation, resuspendre les cellules dans un milieu pauvre en sérum à une concentration de 1 × 10⁷ cellules par millilitre.Ensuite, mélanger un total de 10 microgrammes d'ARN viral transcrit avec 400 microlitres de cellules resuspendues dans une cuvette d'électroporation prérefroidie de 0,4 centimètre. Introduire l'ARN viral dans les cellules par électroporation à 270 volts, 100 ohms et 950 microfarads. Une fois terminé, resuspendre les cellules électroporées dans 10 millilitres de milieu de croissance complet contenant 15 % de FBS. À ce stade, ensemencer les cellules dans des flacons T25 à environ 1,2 × 10⁶ cellules par flacon et dans des plaques de 48 puits à 1 × 10⁴ cellules par puits pour des points temporels de 4, 48 et 96 heures. Remplacer le milieu entre quatre et huit heures après la transfection par un milieu de croissance frais supplémenté contenant 10 % de FBS afin d'éliminer les débris cellulaires morts des flacons et des plaques en culture.À l’aide d’une pipette sérologique, récolter les surnageants de culture cellulaire aux points temporels de 48 et 96 heures dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, éliminer les débris cellulaires des échantillons recueillis par centrifugation à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, conserver les surnageants acellulaires à moins 80 degrés Celsius.Lysis des cellules pour l'analyse des protéines et de l'ARN par immunotransfert et PCR quantitative en temps réel avec transcriptase inverse ou RT-qPCR aux points temporels indiqués. Réaliser la transcription inverse d'un microgramme d'ARN cellulaire total à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse et d'un amorce spécifique de la chaîne sens du VHC qui se fixe à la région non traduite en 5'. Effectuer également la transcription inverse de F-N-X-H-C-V-R-N-A contenant un nombre connu de copies génomiques à l'aide d'un amorce de la chaîne sens du VHC. À l’aide d’un système de PCR en temps réel, réaliser la qPCR en utilisant 50 nanogrammes de l’ADNc transcrit résultant, avec des amorces spécifiques du VHC et un mélange super-qPCR contenant un colorant vert se liant à l’ADN. Utiliser les conditions suivantes lors de l’exécution de la qPCR afin de déterminer le nombre de copies de R-N-A du V-H-C. Après la qPCR, séparer le lysat cellulaire provenant de l’ARN viral transfecté à 96 heures post-transfection par électrophorèse SDS-PAGE. Puis transférer les protéines séparées dans le gel vers une membrane de difluorure de polyvinylidène selon la méthode trans-blot turbo. Bloquer la membrane à l’aide d’une solution de blocage contenant 5 % de lait écrémé et 0,2 % de Tween-20 dans le PBS, puis la placer dans un récipient.Incuber la membrane avec l'anticorps primaire monoclonal de souris NS3 à une dilution de un sur 1 000 et avec la bêta-actine à une dilution de un sur 5 000 dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, ajouter l'immunoglobuline G de chèvre anti-souris conjuguée à la peroxydase de raifort à une dilution de un sur 5 000 et détecter par chimiluminescence.À ce stade, fixez les cellules transfectées par le H-C-V-R-N-A à l’aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius pour le test d’immunofluorescence. Une fois terminé, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Après blocage avec le tampon de blocage pour le test d’immunofluorescence, utilisez l’anticorps primaire polyclonal de lapin anti-NS5A et l’anticorps monoclonal de souris anti-ARNsd J2 à une dilution de un à 200, puis incubez de cinq heures à toute la nuit dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS après l’ajout de l’anticorps primaire. Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire polyclonal IgG de chèvre anti-lapin 488 et l’anticorps secondaire polyclonal Ig de chèvre anti-souris 594 à une dilution de un sur 1000, puis incubez pendant une heure à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, coloriez les noyaux à l’aide du colorant Hoechst et observez au microscope à fluorescence. Ensuite, ensemencez des cellules Huh7.5.1 naïves à environ trois fois 10 à la puissance trois cellules par puits en utilisant une plaque de 96 puits. Le jour suivant, effectuez une dilution sérielle décimale du surnageant de culture dépourvu de cellules, récolté à partir de cellules transfectées par ARN du VHC, en utilisant le milieu de croissance, puis inoculez-le en triple exemplaire sur des cellules Huh7.5.1. Fixez les cellules 72 heures après l'infection à l'aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius. Après avoir retiré les cellules du congélateur, effectuez une immunomarquage pour la protéine NS5A du VHC dans les conditions précédemment décrites. À l’aide d’un microscope à fluorescence, comptez les foyers cellulaires positifs pour NS5A dans le puits présentant la dilution virale la plus élevée, puis calculez le nombre moyen d’unités formant des foyers par millilitre. La qualité du plasmide VHC linéarisé a été évaluée par électrophorèse sur gel. L'ADN VHC a été soumis à une transcription in vitro médiée par la polymérase ARN T7, produisant un unique produit ARN de 9,6 kilobases. Les résultats de RT-qPCR ont indiqué que le virus de type sauvage répliquait efficacement le génome. Le type sauvage présentait un niveau de réplication du génome supérieur d'un à trois logarithmes par rapport au virus pol-nul.Le virus sauvage produit la protéine NS3 impliquée dans le clivage des protéines virales et la réplication du génome. Le virus sauvage exprime également la protéine NS5A, et la protéine NS5A ainsi que l'ARN double brin co-localisent dans le cytoplasme cellulaire des cellules transfectées avec le virus sauvage, suggérant une réplication virale active. Les mesures de titrage viral ont indiqué que le virus sauvage est infectieux et produit plus de 10 000 unités formant des foyers par millilitre de particules infectieuses. Six heures après la transfection, les virus sauvage et pol-null présentaient des activités luciférase similaires, indiquant un niveau comparable de traduction de l'ARN transfecté. Cependant, 48 et 96 heures après la transfection, le virus sauvage présentait des niveaux accrus de réplication du génome par rapport au virus pol-null. Le virus sauvage produisait également la protéine virale NS3. Le virus poll null présentait une activité luciférase de base, tandis que le virus sauvage affichait un niveau de réplication deux à trois fois supérieur en logarithme par rapport au virus rapporteur pol-null. Une fois maîtrisées, les analyses virologiques de l'hépatite C peuvent être réalisées en deux semaines si elles sont effectuées correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est essentiel de disposer de cellules robustes et de transcrits d'ARN génomique de VHC de haute qualité. Après cette procédure, des souches de VHC caractérisées peuvent être testées dans des modèles animaux afin d'étudier leur aptitude in vivo et leurs interactions hôte-pathogène.Le développement d'un système de culture cellulaire infectieuse pour le VHC a permis aux chercheurs d'explorer les étapes de la morphogenèse des virions et de l'égrenage viral dans le cycle de réplication du VHC. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer divers dosages virologiques afin de caractériser différentes étapes du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. N'oubliez pas que le travail avec le virus de l'hépatite C peut être extrêmement dangereux et que des précautions de sécurité, telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Deux méthodes de formation hétérocaryons à découvrir les facteurs de restriction du VHC

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Cette vidéo présente un test d’attachement viral pour le criblage de composés antiviraux. À l’aide du virus de l’hépatite C génétiquement modifié et de la luciférase, il évalue les effets inhibiteurs sur l’attachement viral, comme l’indique l’intensité lumineuse plus faible dans les puits cotraités par rapport aux puits traités avec le virus seul.

Un test d’attachement viral pour le criblage de composés antiviraux

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer des agents antiviraux qui ciblent des étapes spécifiques de l’entrée virale dans les cellules hôtes et de la fusion avec l’endosome. Les cellules sont incubées à basse température, puis infectées par le VHC. La basse température permet la liaison virale aux cellules hôtes mais inhibe l’internalisation par endocytose. Le composé antiviral testé est ajouté et les cellules sont incubées à température physiologique. Ce passage à une température plus...

Un test pour évaluer l’effet des composés testés sur l’entrée virale et la fusion dans les cellules hôtes

Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.

Développement d&#39;un système de virus de l&#39;hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Isolation Lipid Droplet pour l&#39;analyse quantitative de spectrométrie de masse

Nous décrivons ici la production in vitro de l’ADN du VHB via un système d’infection de virus de l’hépatite B et la détection très sensible de son intégration (1 – 2 copies) à l’aide d’inverse nested PCR.

Détection de faibles copies numéro ADN Viral intégré formé par In Vitro l’infection par l’hépatite B

Le but du présent protocole est de fournir un guide étape par étape pour réaliser des expériences 3D « foie-on-a-chip » infection par le virus de l’hépatite B.

« Foie-on-a-Chip » Cultures d’hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer pour Infection de Virus de l’hépatite B

Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.

La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Apprenez à analyser le cycle de réplication du virus de l'hépatite C en générant de l'ARN génomique HCV et en transfectant des cellules. Cette méthode permet d'étudier l'entrée virale, l'assemblage et la sortie des virions.

Un protocole pour l'analyse de l'hépatite C de réplication

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