Un protocole pour l'analyse de l'hépatite C de réplication

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les différentes étapes du cycle de réplication du virus de l’hépatite C. Ceci est accompli en générant d’abord de l’ARN génomique du VHC, des transcrits à partir de constructions plasmidiques linéarisées du VHC. La deuxième étape consiste à transfecter les cellules avec H-C-V-R-N-A.

Ensuite, les cellules sont plaquées pour différents points temporels et essais. La dernière étape consiste à collecter le surnageant de culture cellulaire pour mesurer le titre viral et à récolter les cellules transfectées pour les protéines et l’ARN. En fin de compte, la transcription inverse, la PCR, le Western blot, le test d’immunofluorescence et le titre de VHC sont effectués et démontrent un système de culture cellulaire infectieux robuste du VHC.

Le principal avantage de ce système de culture cellulaire du virus de l’hépatite C infectieuse par rapport au système de réplication du VHC est qu’il permet d’étudier les étapes d’assemblage et de sortie du virus par le virus. Ce protocole peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la virologie de l’hépatite C, telles que Vion, la morphogenèse et l’interaction hôte-pathogène. Les implications de cette technique s’étendent au développement de vaccins, car elle permet de caractériser des souches virales atténuées qui peuvent être évaluées comme candidats vaccins potentiels.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du virus de l’hépatite C, elle peut également être appliquée à d’autres virus à ARN de la famille des virus de laboratoire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode seront confrontées au défi de générer une étude de haute qualité de l’ARN génomique du VHC. Le cycle complet de réplication du VHC est devenu possible en culture cellulaire à la suite de la découverte d’un isolat du génotype 2 du VHC : un isolé de l’hépatite 1 du VHC.

La démonstration visuelle du test virologique est essentielle car le test nécessitera une expertise dans les techniques moléculaires et cellulaires Utilisation d’un virus chimérique intragénotype A A, F-N-X-H-C-V et F-N-X-H-C-V poll null HCV pour l’évaluation de la réplication virale. Linéariser des plasmides viraux précédemment générés par digestion avec une enzyme de restriction XBA dans un tube de deux millilitres. Traitez ensuite les plasmides avec des nucléases de haricot mungo pour générer des extrémités émoussées.

Purifier les plasmides digérés par chromatographie d’échange d’anions. Vérifiez l’intégrité du plasmide linéarisé en soumettant l’ADN à l’électrophorèse sur gel AROS. Ensuite, ajoutez la matrice d’ADN plasmidique linéarisée dans un tube de 0,2 millilitre contenant sept composants de réaction de l’ARN polymérase T pour synthétiser les transcrits de l’ARN génomique du VHC.

Purifiez l’ARN traité à l’aide d’un kit de purification d’ARN nouvellement synthétisé. Vérifiez ensuite la production d’ARN par électrophorèse sur gel d’Agros. Ensuite, quantifiez l’ARN par photométrie spectrale.

Détachez les cellules adhérentes à base de HU sept à l’aide d’un traitement enzymatique à la trypsine et collectez les cellules en un cône de 50 millilitres. Deux après la réussive de centrifugation. Suspendez la pastille cellulaire avec un milieu froid à faible teneur en sérum Après avoir répété la centrifugation, remettez les cellules en suspension dans un milieu à faible teneur en sérum à une fois 10 à sept cellules par millilitre.

Ensuite, mélangez un total de 10 microgrammes d’ARN viral transcrit avec 400 microlitres de cellules remises en suspension dans un vétérinaire d’électroporation pré-refroidi de 0,4 centimètre et délivrez l’ARN viral dans les cellules à l’aide d’une électroporation à 270 volts, 100 ohms et 950 micro-ferres. Une fois terminé, remettre en suspension les cellules électroporées dans 10 millilitres de milieu de croissance complet avec 15 % FBS à ce stade, plaquer les cellules dans les deux flacons T 25 à environ 1,2 fois 10 aux six cellules par ballon et 48 plaques à puits à une fois 10 aux quatrièmes cellules par puits pour 4, 48 et 96 points de temps de 96 heures. Remplacer le milieu quatre à huit heures après la transfection par un milieu de croissance frais supplémenté à 10 % de FBS pour éliminer les débris de cellules mortes des flacons et des plaques de culture.

À l’aide d’une pipette sérologique, prélever les surnageants de culture cellulaire aux points de temps de 48 N 96 heures dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, retirez les débris cellulaires des échantillons collectés par centrifugation à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Conservez les surnageants acellulaires à moins 80 degrés Celsius.

Lyce les cellules pour l’analyse des protéines et de l’ARN par western blot et transcription inverse, PCR quantitative ou R-T-Q-P-C-R aux points temporels indiqués. Transcrire inversement un microgramme d’ARN cellulaire total à l’aide de l’enzyme transcriptase inverse et d’une amorce spécifique pour le brin sensoriel du VHC qui se lie à la région des cinq premiers éléments non traduits dans un tube de 0,2 millilitre. De plus, transcris inverser F-N-X-H-C-V-R-N-A de copies connues du génome à l’aide d’une amorce de brin de détection du VHC à l’aide d’un système de PCR en temps réel.

Effectuez la QPCR en utilisant 50 nanogrammes du CD NA transcrit résultant à l’aide d’amorces spécifiques HCV et d’un colorant vert de liaison à l’ADN contenant un super mélange QPCR. Utilisez les conditions suivantes lors de l’exécution de QPCR pour déterminer le numéro de copie H-C-V-R-N-A après QPCR. Résoudre le lysat cellulaire à partir de l’ARN viral transfecté à 96 heures.

Post-transfection à l’aide de la page SDS. Transférez ensuite les protéines résolues dans le gel dans une membrane de fluorure de poly-vigne par la méthode turbo trans-plot. Bloquer la membrane à l’aide d’une solution bloquante contenant 5 % de lait écrémé et 0,2 % de 20 % de PBS et placée dans un récipient.

Incuber la membrane avec un anticorps monoclonal primaire de souris et du S3 à une dilution d’un sur 1000 et de la bêta-actine à une dilution d’un sur 5 000 dans une chambre froide de quatre degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter de l’immunoglobuline G anti-souris de chèvre conjuguée à la peroxydase de raifort à une dilution d’un sur 5 000 et détecter par chimiluminescence. À ce stade, fixez les cellules transfectées H-C-V-R-N-A à l’aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius pour le test d’immunofluorescence.

Une fois terminé, laver les cellules avec PB S3 plusieurs fois après les avoir bloquées avec un tampon de blocage du test d’immunofluorescence, utiliser un anticorps polyclonal de lapin anti NS cinq un anticorps primaire et un anticorps monoclonal de souris anti ARN DS J deux à une dilution de un à 200 et incuber pendant cinq heures à toute la nuit dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, laver les cellules avec du PB S3 plusieurs fois après l’anticorps primaire. Ajoutez ensuite l’immunoglobuline polyclonale de chèvre G 4 8 8 et l’anticorps secondaire polyclonal anti muse de chèvre 5 9 4 à une dilution d’un sur 1000 et incubez pendant une heure à température ambiante sur une bascule de table.

Après avoir lavé les cellules avec du PB S3, colorez les noyaux à l’aide de la matrice herx et visualisez-les à l’aide d’un microscope fluorescent. Teinte naïve de la plaque suivante, 7,5 0,1 cellules à environ trois fois 10 à la troisième cellule par puits. Le lendemain, à l’aide d’une plaque à 96 puits, procéder à une dilution en série d’un surnageant de culture acellulaire récolté à partir de cellules transfectées H-C-V-R-N-A à l’aide d’un milieu de croissance et inoculer en trois exemplaires sur la teinte.

7.5 0.1 cellules Fixez les cellules 72 heures après l’infection à l’aide de méthanol pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius après avoir retiré les cellules de la coloration aminée du congélateur pour la protéine H-C-V-N-S cinq A en utilisant les conditions décrites précédemment à l’aide d’un microscope fluorescent. Comptez les foyers cellulaires positifs NS cinq, A dans le puits avec la dilution virale la plus élevée et calculez le nombre moyen d’unités formant foyer par millilitre. La qualité du plasmide linéarisé du VHC a été évaluée par électrophorèse sur gel.

Le H-C-V-D-N-A a été soumis à une transcription in vitro médiée par T sept ARN polymérase, qui a donné un seul produit ARN à 9,6 kilobases. Les résultats ont indiqué que le virus de type sauvage répliquait efficacement le génome. Le type sauvage présentait un niveau de réplication du génome supérieur de 1 à 3 log par rapport au virus poll null.

Le virus de type sauvage a produit la protéine NS trois impliquée dans le clivage des protéines virales et la réplication du génome. Le virus de type sauvage a également exprimé la protéine NS cinq a et la protéine NS cinq a et l’ARN double brin co-localisé dans le cytoplasme cellulaire des cellules transfectées de type sauvage, suggérant une réplication virale active, les mesures du titre du virus ont indiqué que le virus de type sauvage est infectieux et produit plus de 10 000 foyers formant des unités par millilitre de particule infectieuse six heures après la transfection. Les virus de type sauvage et de pôle nul avaient des activités de luciférase similaires, indiquant un niveau d’entrée similaire de transfected.

L’ARN avait cependant été traduit 48 heures et 96 heures après la transfection. Le virus de type sauvage a montré des niveaux de réplication du génome accrus par rapport au virus sans sondage. Le virus de type sauvage a également produit la protéine virale NS trois.

Le virus poll null avait une activité luciférase de niveau de base, tandis que le virus de type sauvage avait un niveau de réplication de deux à trois log supérieur à celui du virus rapporteur poll null. Une fois maîtrisés, les tests virologiques de l’hépatite TC peuvent être effectués en deux semaines s’ils sont effectués correctement. Lors de cette procédure, il est important d’avoir des cellules robustes et des transcrits d’ARN génomique du VHC de haute qualité. À la suite de cette procédure, les souches de VHC peuvent être testées dans des systèmes modèles animaux pour étudier in vivo la valeur adaptative et les interactions hôte-pathogène.

La mise au point d’un système de culture cellulaire du VHC infectieux a permis aux chercheurs d’explorer le virion, la morphogenèse et les étapes de sortie virale du cycle de réplication du VHC. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer divers tests virologiques pour caractériser les différentes étapes du cycle de réplication du virus de l’hépatite C. N’oubliez pas que travailler avec le virus de l’hépatite C peut être extrêmement dangereux et que des précautions de sécurité telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.