Name: Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de lantigène contre Autoimmunité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez une méthode pour générer des cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène à partir de cellules iPSC pour l'immunothérapie contre l'arthrite auto-immune. Cette technique fournit une population uniforme de Tregs fonctionnelles.

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Ce projet a été financé, en partie, au titre des subventions des Instituts nationaux de la santé (R01AI121180, R21AI109239 et K18CA151798), l&#39;American Diabetes Association (1-16-IBS-281), et le ministère de la Santé en Pennsylvanie (Fonds de règlement du tabac) à JS

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<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
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<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
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<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, une étape critique est la différenciation in vitro de TCR / FoxP3 CSPi géniques-transduction. In vitro signalisation Notch induit le développement vers la lignée cellulaire T. Pour différencier CSPi en CD4 + Foxp3 + Tregs, nous avons utilisé les cellules b OP9-DL1 / DL4 / IA, qui expriment des molécules hautement CMH II (IA) b. La plupart des CSPi se différencient en cellules CD4 +. Cependant, après l&#39;expression du TCR de sur...

L’arthrite auto-immune est une maladie systémique caractérisée par une hyperplasie du tissu synovial et une destruction progressive du cartilage articulaire, de l’os et des ligaments1. La génération ou la fonction défectueuse des Tregs dans l’arthrite auto-immune contribue à l’inflammation chronique et aux lésions tissulaires, car les Tregs jouent un rôle crucial dans la prévention du développement des cellules immunitaires auto-réactives. 
La manipulation des Tregs est une stratégie idéale pour le développement de thérapies visant à supprimer l’inflammation de manière dépendante de l’Ag. Pour l’immunothérapie à base de Tregs, la spécificité des Tregs transférés est importante pour le traitement de l’auto-immunitéen cours 2. Pour présenter l’activité suppressive, les Tregs doivent migrer et être conservés dans la région affectée, ce qui peut être dirigé par la spécificité du TCR pour l’Ag à cet endroit3. Bien que les Tregs polyclonaux puissent contenir une petite population contenant cette spécificité Ag de leurs TCR, le nombre de ces Tregs spécifiques de l’Ag est généralement faible. Par conséquent, les thérapies cellulaires utilisant des Tregs polyclonaux contre les maladies auto-immunes nécessitent des transferts adoptifs d’un grand nombre de Tregs4,5. Parce que les cellules souches pluripotentes (CSP) ont la capacité de se développer en n’importe quel type de cellule, les CSP-Tregs spécifiques de l’Ag peuvent s’avérer être de bons candidats pour l’immunothérapie à base de Tregs. Des études antérieures ont montré le développement réussi de cellules T dérivées de PSC, y compris les Tregs6-8. 
Ici, nous décrivons un protocole pour développer des iPSC-Tregs spécifiques à l’Ag. Nous décrivons en outre une thérapie cellulaire de l’arthrite auto-immune dans un modèle murin utilisant de tels Tregs. Cette méthode est basée sur la modification génétique d’iPSC murins avec des TCR spécifiques de l’Ag et le facteur de transcription FoxP3. Les iPSC modifiées se différencient ensuite en Tregs spécifiques de l’Ag sur les cellules stromales OP9 exprimant les ligands Notch DL1, DL4 et les molécules MHC-II (I-Ab) en présence des cytokines mFlt3L et mIL-7. Ces iPSC-Tregs spécifiques de l’Ag peuvent produire des cytokines suppressives, telles que le TGF-β et l’IL-10, lorsqu’ils sont stimulés avec l’Ag, et le transfert adoptif de ces Tregs a la capacité de supprimer le développement de l’AIA dans un modèle murin. Le protocole décrit peut être utilisé pour développer des Tregs spécifiques de l’Ag dérivés de cellules souches pour des interventions thérapeutiques potentielles.

<table><tbody><tr><td>souris C57BL/6j</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD28 (37.51)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53 ans ; 6.7) anticorps</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD25 (3C7)</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta ; (H57597) anticorps</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta ;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Integrated science</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Attention : Allergène, Carcénogène,</td></tr><tr><td>Toxique Tampon de perméabilisation</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albumine</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner</td><td>resrestraint Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

développement de cellules souches dérivées de cellules t régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre autoimmunité

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Maladies auto-immunes surviennent en raison de la perte de l&#39;auto-tolérance immunologique. Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont des médiateurs importants de l&#39;auto-tolérance immunologique. Treg représentent environ 5 - 10% de la sous - population de lymphocytes T CD4 + matures chez les souris et les humains, avec environ 1 - 2% de ces Treg circulant dans le sang périphérique. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) peuvent être différenciées en Tregs fonctionnelle, qui ont un potentiel d&#39;être utilisé pour les thérapies à base de cellules de maladies auto-immunes. Ici, nous présentons une méthode pour développer l&#39; antigène (Ag) Tregs de CSPi spécifique de (c. -à- iPSC-Treg). La méthode est basée sur l&#39;intégration du facteur de transcription FoxP3 et un récepteur Ag-spécifique des cellules T (TCR) en CSPi puis différenciation sur les cellules OP9 stromales exprimant Notch ligands delta-like (DL) 1 et DL4. Après la différenciation in vitro, les iPSC-Tregs expriment CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 et Ag-TCR spécifique et sont capables de répondre à Ag stimulation.Cette méthode a été appliquée avec succès à la thérapie à base de cellules de l&#39;arthrite auto-immune chez un modèle murin. Le transfert adoptif de ces Ag spécifique iPSC-Tregs dans l&#39;arthrite Ag-induite (AIA) souris -bearing a la capacité de réduire l&#39;inflammation des articulations et de l&#39;enflure et de prévenir la perte osseuse.

Comme le montre ici, le jour 28, Tregs Ag spécifique exprimé sensiblement CD3 et Ag-TCR spécifique, deux marqueurs de cellules T. La population CD3 + TCRVβ5 + exprimé CD4. La plupart des cellules CD4 + TCRVβ5 + CD3 + ont également exprimé CD25, CD127, et CTLA-4, qui sont généralement exprimés à des niveaux élevés dans regs (T) de nTregs d&#39; origine naturelle et dans les cellules T exprimant de manière ectopique FoxP3. L...

Nous présentons ici une méthode pour développer des lymphocytes T régulateurs (Tregs) spécifiques de l’antigène fonctionnel (Ag) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour l’immunothérapie de l’arthrite auto-immune dans un modèle murin.

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

L'objectif général de cette expérience est de développer une nouvelle méthode permettant de produire des cellules T régulatrices associées aux articulations enflammées, dérivées de cellules souches, pour une immunothérapie contre l'arthrite auto-immune. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'auto-immunité concernant des immunothérapeutiques potentielles pour l'arthrite auto-immune. Le principal avantage de cette technique est que les cellules T régulatrices dérivées de cellules souches sont typées et d'un seul type.Commencez par diluer les cellules nourricières d'intérêt jusqu'à une densité minimale de 1 × 10⁴ cellules par centimètre carré dans du milieu OP9, et ensemencez 1 × 10⁶ cellules nourricières par boîte de 10 cm. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, retirez le milieu des cultures et semez 0,5 à 1 × 10⁵ cellules souches pluripotentes induites, ou IPSC, transduites par rétrovirus, dans du milieu OP9 dans chaque boîte. Cinq jours plus tard, aspirez le milieu et lavez les cellules avec 10 mL de PBS.Ensuite, détacher les cellules avec quatre millilitres de trypsine par boîte, à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, a

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Cette vidéo présente une thérapie cellulaire pour l’arthrite auto-immune chez la souris. Des cellules T régulatrices dérivées d’iPSC exprimant des récepteurs spécifiques de l’ovalbumine sont injectées avec de l’albumine sérique bovine méthylée émulsionnée (mBSA) émulsionnée dans un adjuvant. Les cellules présentatrices d'antigène (CPA) murines traitent et présentent la mBSA aux cellules T, provoquant l'activation et la migration des cellules T vers la membrane synoviale de l'articulation du...

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Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l'hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l'antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l'immunothérapie act-basée potentielle de l'infection de HBV.

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