Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène contre Autoimmunité

L'objectif général de cette expérience est de développer une nouvelle méthode permettant de produire des cellules T régulatrices associées aux articulations enflammées, dérivées de cellules souches, pour une immunothérapie contre l'arthrite auto-immune. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'auto-immunité concernant des immunothérapeutiques potentielles pour l'arthrite auto-immune. Le principal avantage de cette technique est que les cellules T régulatrices dérivées de cellules souches sont typées et d'un seul type.

Commencez par diluer les cellules nourricières d'intérêt jusqu'à une densité minimale de 1 × 10⁴ cellules par centimètre carré dans du milieu OP9, et ensemencez 1 × 10⁶ cellules nourricières par boîte de 10 cm. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, retirez le milieu des cultures et semez 0,5 à 1 × 10⁵ cellules souches pluripotentes induites, ou IPSC, transduites par rétrovirus, dans du milieu OP9 dans chaque boîte. Cinq jours plus tard, aspirez le milieu et lavez les cellules avec 10 mL de PBS.

Ensuite, détacher les cellules avec quatre millilitres de trypsine par boîte, à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, arrêter les réactions avec huit millilitres de milieu IPSC et récupérer les cellules par centrifugation. Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu IPSC frais et repiquer les cellules dans de nouvelles boîtes de 10 centimètres.

Laisser les cellules nourricières adhérer à la plaque pendant 30 minutes dans l'incubateur de culture cellulaire. Ensuite, recueillir les iPSC en suspension et filtrer les cellules transduites à l’aide d’un tamis de 70 microns pour les compter. Ensemencer cinq fois 10 à la puissance 5 iPSC sur une plaque fraîche de cellules nourricières à 80 à 90 % de confluence, dans du milieu OP9 supplémenté en Murine-Flt3-Ligand, puis replacer les cultures dans l'incubateur.

Après trois jours, utilisez une pipette de 10 millilitres pour laver la boîte avec le milieu de culture. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu OP9 frais dans la boîte et détachez délicatement les IPSC semi-adhérents par une pipetage soigneux et ferme, sans perturber la couche de cellules nourricières. Répétez le lavage avec 10 millilitres de PBS afin de récupérer les dernières cellules semi-adhérentes, en recueillant les éluats de chaque boîte dans un tube conique par culture.

Après avoir centrifugé les cellules, resuspendre les culots dans 10 millilitres de milieu OP9 supplémenté en Murine-Flt3-Ligand et en IL-7, puis filtrer les cellules à travers un tamis de 70 microns. Ensemencer une culture d'iPSC par puits dans une plaque de culture à six puits contenant une monocouche de cellules nourricières à 80 à 90 % de confluence, puis replacer les cocultures dans l’incubateur. Tous les deux jours, remplacer la moitié du milieu par du milieu OP9 frais supplémenté en Murine-Flt3-Ligand et en IL-7, et tous les quatre à six jours, réensemencer les iPSC en cours de différenciation dans de nouvelles plaques avec une couche fraîche de cellules nourricières si nécessaire.

Commencez par détacher les cultures cellulaires d'intérêt à l'aide de la trypsine et resuspendez chaque type cellulaire dans 10 millilitres de milieu frais. Ensuite, ensemencez chaque culture cellulaire dans une nouvelle boîte de 10 centimètres et laissez les cellules nourricières adhérer dans l'incubateur de culture cellulaire. Après 30 minutes, récupérez les iPSC en suspension et passez les cultures à travers des tamis cellulaires individuels de 70 microns afin d'éliminer les agrégats cellulaires avant le comptage.

Ressuspendre chaque culture à une concentration de 1,5 × 10⁷ cellules par millilitre dans du PBS froid, en filtrant à nouveau si nécessaire. Ensuite, placer des souris femelles C57BL/6 âgées de quatre à six semaines, une par une, dans un dispositif de contention pour petit animal et transférer de façon adoptive 200 µL d'un type de cellule par souris dans la veine de la queue de chaque animal. Utiliser un pied à coulisse à cadran pour mesurer l'œdème des deux genoux afin d'établir la mesure de base.

10 jours après le transfert des cellules, utiliser une seringue d'un millilitre pour injecter aux souris 100 microgrammes de BSA méthylée émulsifiée dans l'adjuvant de Freund complet à la base de la queue de chaque animal expérimental. 17 jours après le transfert des cellules, induire l'arthrite par injection intra-articulaire de 20 microgrammes de BSA méthylée dans 10 microlitres de PBS dans l'articulation du genou gauche et de 20 microgrammes de BSA méthylée et 100 microgrammes d'ovalbumine entière dans 10 microlitres de PBS dans l'articulation du genou droit de chaque animal receveur anesthésié ayant subi un transfert adoptif. Sept jours après l'induction de l'arthrite, mesurer à nouveau les genoux afin de calculer le pourcentage d'augmentation du diamètre du genou, puis exciser chirurgicalement les rotules.

Fixer les articulations dans le formol. Ensuite, après décalcification à l'EDTA, inclure les genoux dans la paraffine et obtenir des coupes de quatre micromètres pour la coloration histochimique et l'analyse. Au jour 28, les cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène expriment des niveaux importants de CD3 et de récepteurs spécifiques de l'antigène sur les cellules T.

La plupart de ces cellules expriment également CD25, CD127 et CTLA-4, qui sont généralement exprimés à des niveaux élevés dans les cellules T régulatrices naturelles. En effet, FoxP3 persiste dans les cellules T régulatrices dérivées des IPSC, même après une stimulation prolongée in vitro avec le ligand Notch, comme détecté par coloration intracellulaire. De plus, ces cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène produisent des cytokines suppresseurs lorsqu'elles sont stimulées par des splénocytes chargés en antigène in vitro, indiquant un phénotype suppresseur potentiel pour ces cellules.

Des cellules positives pour FoxP3 sont observées dans les genoux traités avec l'OVA, aucune cellule positive pour FoxP3 n'étant apparente dans les genoux recevant des IPSC transduites avec le vecteur contrôle. De plus, beaucoup plus de cellules positives pour CD4, positives pour FoxP3 et positives pour TCR3 Beta 5 sont visualisées dans les genoux de souris recevant des IPSC transduites avec le vecteur TCR-FoxP3, par rapport au vecteur FoxP3 seul, suggérant que les cellules IPSC-Treg spécifiques de l'antigène migrent vers le genou atteint d'arthrite induite par l'antigène après leur transfert adoptif chez les animaux receveurs. Le transfert adoptif de cellules dérivées d'IPSC entraîne également une diminution importante du gonflement inflammatoire du genou en présence d'OVA, mais n'a aucun effet sur les genoux injectés avec l'albumine de sérum bovin méthylée contrôle.

Les effets positifs de la réduction du gonflement sont confirmés par une imagerie Micro-CT à haute résolution, qui met en évidence une perte osseuse réduite dans les genoux traités par transfert cellulaire par rapport aux animaux contrôles injectés uniquement avec du MBSA. Une fois mobilisées, ces procédures approfondies peuvent être menées à terme en six semaines si elles sont correctement réalisées. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de veiller à induire la différenciation acquise des iPSCs transduites par l’antigène TCR-FoxP3.

Après cette procédure, différents composés de cytokines suppresseurs peuvent également être envisagés afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la survie et la qualité des cellules T régulatrices IPSC spécifiques de l'antigène. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie cellulaire pour explorer le rôle des cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène dans les maladies auto-immunes. N'oubliez pas que le travail avec des facteurs autochtones directs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que de travailler dans une installation de niveau 2, doivent toujours être prises lors de l'exécution d'une procédure.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.