Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène contre Autoimmunité

L’objectif global de cette expérience est de développer une nouvelle méthode pour générer des cellules souches dérivées de cellules souches de cellules T régulatrices articulaires enflammées pour l’immunothérapie contre l’arthrite auto-immune. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de l’auto-immunité sur les immunothérapies potentielles pour l’arthrite auto-immune. Le principal avantage de cette technique est que les lymphocytes T régulateurs dérivés de cellules souches sont nypèdes et d’un seul type.

Commencez par diluer les cellules d’alimentation d’intérêt à une densité minimale de un fois 10 les quatrièmes cellules par centimètre carré dans le milieu OP9, et plaquez une fois 10 aux sixièmes cellules d’alimentation par parabole de 10 centimètres. Lorsque les cellules deviennent confluentes à 80 à 90 %, retirez le milieu des cultures et ensemencez 0,5 à une fois 10 à la cinquième des cellules souches pluripotentes inductibles ou IPSC transduites rétroviralement dans le milieu OP9 dans chaque boîte. Cinq jours plus tard, aspirez le milieu et lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS.

Ensuite, détachez les cellules avec quatre millilitres de trypsine par plat, à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, arrêtez les réactions avec huit millilitres de milieu IPSC et tirez les cellules pour la centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu IPSC frais et replaquez les cellules sur de nouvelles boîtes de 10 centimètres.

Laissez les cellules nourricières adhérer à la plaque pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Ensuite, collectez les IPSC flottants et filtrez les cellules transduites à travers une crépine de 70 microns pour le comptage. Semez cinq fois 10 à la cinquième IPSC sur une plaque fraîche de cellules nourricières confluentes à 80 à 90 % dans un milieu OP9 complété par Murine-Flt3-Ligand et retournez les cultures dans l’incubateur.

Après trois jours, utilisez une pipette de 10 millilitres pour laver la vaisselle avec le milieu de culture. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu OP9 frais dans le plat et lavez doucement tous les IPSC semi-adhérents avec un pipetage soigneux et puissant qui ne perturbe pas la couche de cellules nourricières. Répétez le lavage avec 10 millilitres de PBS pour récolter les dernières cellules semi-adhérentes, en tirant les lavages de chaque plat dans un tube conique par culture.

Après avoir fait tourner les cellules, remettez les granulés en suspension dans 10 millilitres de milieu OP9 complété par le ligand Murine-Flt3 et l’IL-7 et filtrez les cellules à travers une passoire de 70 microns. Semez une culture IPSC par puits dans une plaque de culture à six puits contenant 80 à 90 % de monocouches de cellules nourricières confluentes et retournez les co-cultures dans l’incubateur. Tous les deux jours, remplacer la moitié du milieu par du milieu OP9 frais complété par du ligand murin-Flt3 et de l’IL-7, et tous les quatre à six jours, réensemencer les IPSC différenciateurs sur de nouvelles plaques avec une nouvelle couche de cellules nourricières si nécessaire.

Commencez par détacher les cultures cellulaires d’intérêt avec de la trypsine et remettre en suspension chaque type de cellule dans 10 millilitres de milieu frais. Placez chaque culture cellulaire dans une nouvelle boîte de 10 centimètres et laissez les cellules nourricières adhérer dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 30 minutes, collectez les IPSC flottants et passez les cultures dans des passoires cellulaires individuelles de 70 microns pour retirer les grappes de cellules pour le comptage.

Remettre chaque culture en suspension à une concentration de 1,5 fois 10 à 10 à la septième cellule par millilitre dans du PBS froid, en filtrant à nouveau si nécessaire. Ensuite, placez quatre souris femelles C57BL/6 âgées de quatre à six semaines une à la fois dans un dispositif de contention pour petits animaux et transférez adoptivement 200 microlitres d’un type de cellule par souris dans la veine de la queue de chaque animal. Utilisez un pied à coulisse pour mesurer l’enflure des deux genoux afin d’établir la mesure de base.

10 jours après le transfert cellulaire, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, injectez aux souris 100 microgrammes de BSA méthylée émulsionnée dans un adjuvant de Freund complet à la base de la queue de chaque animal de laboratoire. 17 jours après le transfert cellulaire, induire l’arthrite par injection intra-articulaire de 20 microgrammes de BSA méthylé dans 10 microlitres de PBS dans l’articulation du genou gauche et de 20 microgrammes de BSA méthylé et de 100 microgrammes d’ovalbumine entière dans 10 microlitres de PBS dans l’articulation du genou droit de chaque animal anesthésié transféré adoptivement. Sept jours après avoir induit l’arthrite, mesurez à nouveau les genoux pour calculer le pourcentage d’augmentation du diamètre du genou et excisez chirurgicalement les rotules.

Fixez les articulations dans du formol. Ensuite, après décalcification dans l’EDTA, enrober les genoux dans de la paraffine et obtenir des coupes de quatre microns pour la coloration histochimique et l’analyse. Au jour 28, les lymphocytes T régulateurs spécifiques de l’antigène expriment des niveaux substantiels de CD3 et de récepteurs des lymphocytes T spécifiques de l’antigène.

La plupart de ces cellules expriment également CD25, CD127 et CTLA-4, qui sont tous généralement exprimés à des niveaux élevés dans les cellules T régulatrices naturelles. En effet, FoxP3 persiste dans les cellules T régulatrices dérivées d’IPSC, même après une stimulation in vitro à long terme avec le ligand Notch, comme détecté par coloration intracellulaire. De plus, ces cellules régulatrices T IPSC spécifiques de l’antigène produisent des cytokines suppressives lorsqu’elles sont stimulées par des splénocytes pulsés d’antigène in vitro, indiquant un phénotype suppressif potentiel pour ces cellules.

Des cellules positives à FoxP3 sont observées dans les genoux traités à l’OVA, mais aucune cellule positive à FoxP3 n’est apparente dans les genoux qui reçoivent des cellules IPSC transduites par vecteur de contrôle. De plus, beaucoup plus de cellules CD4 positives, FoxP3 positives, TCR3 Beta 5 positives sont visualisées dans les genoux des souris qui reçoivent des IPSC transduites avec le vecteur TCR-FoxP3, qu’avec le vecteur FoxP3 seul, ce qui suggère que les cellules IPSC-Treg spécifiques de l’antigène migrent vers le genou arthritique induit par l’antigène après leur transfert adoptif chez les animaux receveurs. Le transfert adoptif de cellules dérivées de l’IPSC affecte également une diminution substantielle de l’enflure inflammatoire du genou en présence d’OVA, mais n’a aucun effet sur les genoux de contrôle injectés de BSA méthylé.

Les effets positifs de la réduction de l’enflure sont encore confirmés par l’imagerie Micro-CT à haute résolution de la perte osseuse réduite observée dans les genoux traités par transfert cellulaire par rapport aux animaux témoins injectés uniquement avec du MBSA. Une fois rassemblées, ces procédures approfondies peuvent être complétées en six semaines si elles sont effectuées correctement. En essayant cette technique, il est important de se rappeler d’induire la différenciation imprégnée des IPSC transduits par l’antigène TCR-FoxP3.

À la suite de cette procédure, différents composés de cytokines suppressives peuvent également être délibérés pour répondre à des questions supplémentaires sur la survie et la qualité des cellules T Reg de l’IPSC spécifiques de l’antigène. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie cellulaire pour explorer le rôle des cellules T régulatrices spécifiques de l’antigène dans les maladies auto-immunes. N’oubliez pas que travailler avec des cacteurs à carrosserie directe peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que travailler dans deux installations de base, doivent toujours être prises lors de l’exécution d’une procédure.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.