Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l'égard des lymphocytes T

Génération des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) donne une approche alternative de l'utilisation de cellules souches embryonnaires à des cellules T à base d'immunothérapie. Procédé montre que, en utilisant soit

L’objectif global de cette procédure est de générer et de caractériser des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites ou IPS. Les cellules IPS peuvent ensuite être différenciées in vitro sur un système de culture OP neuf DL one, puis matures in vivo chez une souris déficiente en chiffon. Ou les cellules peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer OT un TCR, puis transférées adoptivement pour un développement in vivo.

Après six semaines de différenciation in vivo, les souris peuvent être testées par injection intrapéritonéale avec sept cellules tumorales EEG, puis la spécificité antigénique des cellules T dérivées de l’IPS peut être évaluée. En fin de compte, les cellules IPS peuvent se différencier en cellules T conventionnelles et spécifiques à l’antigène, ces dernières étant capables de protéger les animaux contre la provocation tumorale. Les implications de cette technique s’étendent à l’immunothérapie individualisée du cancer.

La méthode permet de générer un grand nombre de cellules T réactives à la tumeur à partir d’une quantité minimale de sang ou de tissu cutané du patient Le jour zéro, transférez cinq fois 10 vers les quatrièmes cellules IPS sur une boîte de culture de 100 millimètres contenant une monocouche confluente d’OP neuf, DL d’une cellule dans un milieu alpha MEM 20 % FBS le cinquième jour, trypsine yeux. Ensuite, centrifugez les cellules après les avoir incubées sur une boîte de culture fraîche de 100 millimètres pendant 30 minutes et une plaque d’incubation à 37 degrés, cinq fois 10 à la cinquième des cellules flottantes dans 20 % FBS alpha, milieu MEM et trois ligands plats de souris sur une nouvelle boîte de 100 millimètres contenant une monocouche d’OP neuf. DL one cells le huitième jour pipette doucement les cellules faiblement attachées, centrifuge les cellules, puis transfère les cellules dans un seul puits d’une plaque de culture à six puits recouverte d’OP neuf confluent DL one cells incube les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant deux semaines supplémentaires le jour 22.

Incuber des cellules IPS détachées dans un milieu frais sur une nouvelle boîte de culture à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, retirez environ la moitié des cellules flottantes et passez-les dans une passoire en nylon de 70 microns pour exclure les amas de cellules et lavez la suspension unicellulaire résultante trois fois avec du PBS froid. Après le troisième lavage, remettre les cellules en suspension dans le PBS à raison de 1,5 fois la 10e des septièmes cellules par millilitre et maintenir les cellules sur de la glace avant l’injection IV.

Placez une souris de quatre semaines déficiente en chiffon sous une lumière infrarouge pour dilater la veine de la queue. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26 et demi avec 200 microlitres de suspension cellulaire et transférez adoptivement les cellules à travers la veine de la queue dilatée. Trois semaines plus tard, après avoir confirmé l’euthanasie de la souris transférée adoptivement, on enlève les ganglions lymphatiques et la rate après avoir décomposé mécaniquement les tissus.

Mélangez la suspension unicellulaire avec un tampon de lyse CK, puis lavez les mononucléocytes résultants deux fois dans du PBS froid. Ensuite, après la coloration pour les marqueurs de surface cellulaire, évaluer les cellules par analyse cytométrique en flux le jour zéro, utiliser le réactif de transfection du gène JAMA pour transfecter les cellules d’emballage de la plaque E avec un MIDR OT un MIDR le premier jour, une graine un fois 10 aux six cellules IPS dans un puits d’une plaque pré-codée à 24 puits de gélatine à 0,1 % le deuxième jour, collecter le pseudo-virus contenant de la Snatine à partir des cellules de la plaque E, puis le faire passer à travers un filtre de 0,4 micron pour exclure les contaminants potentiels après la centrifugation. Transduction des cellules en présence d’un poly-cerveau pendant une heure à 330 fois G à 32 degrés Celsius.

Incuber-les toute la nuit à la même température après avoir répété la procédure de transduction. La trypsine observe les cellules IPS transduites le quatrième jour, puis après la granulation, les cellules réhydratent les cellules dans un milieu frais et les ensemencent sur des cellules nourricières snl 7 6 7 irradiées précodées. Une fois que les cellules transduites ont atteint la confluence, trier les cellules rouges doubles positives GFP et DS par cytométrie en flux.

Six semaines après le transfert adoptif des cellules IPS, injectez 50 microlitres d’EEG, sept cellules thoma, dans la cavité péritonéale de la même souris au 50e jour de la provocation tumorale. Utilisez un kit d’isolement de lymphocytes T positifs pour trier les lymphocytes T positifs de la rate et des ganglions lymphatiques de l’animal transféré adoptivement. Mélangez les cellules T CD isolées à huit cellules T positives avec une taille SPOC irradiée d’une souris naïve C 57 noire à six J dans un rapport de un à 10 et pulsez la co-culture avec 0,5 micromole par mil d’ovules pendant 40 heures.

Ensuite, ajoutez du felden A dans les cellules pendant encore quatre heures. Enfin, évaluez les populations cellulaires par analyse cytométrique en flux après avoir isolé les cytes SP d’une souris naïve C 57 noire six J. Divisez la suspension cellulaire en deux groupes.

Étiquetez le groupe CFSE élevé avec cinq micromoles par mil de CFSE et pulsez les cellules avec 10 microgrammes par mil de peptide d’ovule pendant une heure, étiquetez le groupe A-C-F-S-E avec 0,5 MICROMOLES par mil CFSE et n’épulsez pas. Mélangez 2,5 fois 10 à la sixième, les cellules hautes CFSE avec 2,5 fois 10 à la sixième, les cellules basses CFSE à PBS. Ensuite, analysez les cytes par cytométrie en flux pour l’expression de CFSE.

16 heures après le transfert adoptif chez la souris d’intérêt Pour compter les cellules tumorales intrapéritonéales au 20e jour de la provocation tumorale. Utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18 et demi et du PBS froid pour laver la cavité péritonéale. Comptez les cellules tumorales récupérées pour identifier les cellules infiltrant la tumeur.

Retirez la tumeur à un stade avancé de la provocation tumorale, puis coupez la tumeur en trois morceaux. Placez le premier morceau de tumeur dans un flacon cryogénique et placez le flacon sur de la glace sèche. Fixez immédiatement le deuxième morceau de formaldéhyde.

Conservez le troisième morceau dans un support RPMI 1640 conditionné après séchage à l’air libre des sections de tissus cryoconservés. Fixez-les dans de l’acétone froide pendant 15 minutes après avoir séché à l’air les sections fixes pendant encore 15 minutes. Lavez les lames pendant cinq minutes dans du PBS après le lavage.

Placez les lames dans une chambre humide et couvrez les sections de tissu avec 30 microlitres de 3 %B, SA et PBS pendant 30 minutes pour bloquer la liaison non spécifique. Ensuite, épongez le tampon bloquant et incubez les sections de tissu avec un mélange de 50 microlitres d’anticorps pe anti TCR RV alpha deux et d’anticorps anti-ovules fitzy dilué dans 3 % de PSA dans du PBS dans la chambre humide pendant deux heures à la fin de l’incubation. Laver les lames trois fois dans du PBS froid, enfin monter les sections avec un média de montage à base d’eau avant un examen microscopique fluorescent pour l’analyse cytométrique en flux des lymphocytes T infiltrant la tumeur.

Écrasez la tumeur en une suspension unicellulaire. Analysez ensuite les cellules à la recherche de marqueurs de surface spécifiques. C, CD trois et TCR bêta sont utilisés comme marqueurs des lymphocytes T pour déterminer si la stimulation des cellules IPS avec le ligand d’encoche DL un pourrait contribuer à l’expression de surface des cellules T CD quatre et CD huit sur des cellules dérivées de cellules IPS TCR r bêta positives CD a été évaluée.

Notez le diagramme à points sur la droite, qui montre le jour 22 : CD, trois TCR positifs, R bêta positif, CD quatre CD négatifs, huit lymphocytes T positifs simples positifs générés à partir de cellules IPS in vitro. De plus, les cellules dérivées de la cellule IPS ont produit de l’interleukine deux et de l’interféron gamma lorsqu’elles ont été stimulées in vitro par des anticorps anti CD trois recouverts d’une plaque et des anticorps anti CD 28 solubles confirmant que les cellules T dérivées des cellules IPS sont fonctionnelles après transfert adoptif chez les souris receveuses. La majorité des cellules IPS transduites par le gène TCR ont subi une différenciation en CTL positives pour le CD huit, qui ont répondu in vitro à la stimulation peptidique en sécrétant de l’interleukine deux et de l’interféron gamma dans ces diagrammes de points à partir de cellules de ganglions lymphatiques et de rate regroupées.

Des lymphocytes T CD huit V bêta cinq positifs ont été générés chez des souris transférées adoptivement avec des cellules IPS transduites TCR mais non transduites par le contrôle. Les populations de CD huit positifs et de V bêta cinq positifs étaient positives pour la coloration intracellulaire des cytokines pour l’interleukine deux et la production d’interféron gamma représentée dans ces histogrammes par les lignes sombres par rapport aux histogrammes de contrôle d’isotype ombrés indiquant que les CTL dérivés de l’IPS étaient fonctionnels. Ces données montrent que les cellules hautes CFSE pulsaient avec l’eptide représenté par les pics à droite dans chaque graphique et les cellules de contrôle CFSE basses représentées par les pics à gauche qui ont été injectées chez les souris 10 semaines après le transfert de cellules IPS ou un jour après le transfert O OT un transfert CTL.

Les CTL dérivées de l’IPS spécifiques de l’antigène ont répondu à la stimulation de l’antigène et ont eu une activité cytotoxique, comme l’indique l’absence de cellules CFSE élevées ici. Les cellules IPS transduites par le gène OT un TCR ont été transférées adoptivement dans six souris noires C57, puis les souris ont été soumises à un test EEG, sept cellules tumorales le jour 20 cellules tumorales dans la cavité péritonéale ont été dénombrées. Notez la réduction significative du nombre de cellules tumorales chez les souris qui ont reçu TCR TRANSDUCED IPS par rapport aux groupes témoins.

Plus important encore, le transfert adoptif de cellules IPS transduites par TCR a déclenché l’infiltration de CTL hyperréactifs dans les tissus tumoraux et a protégé les animaux contre la provocation tumorale, comme on le voit dans cette coloration h et e des tissus tumoraux récupérés jours 30 à 35 après les tumeurs de provocation tumorale de souris transférées adoptivement avec des cellules transduites TCR ou des CTL OT one mais pas injectés ou témoins. Les cellules transduites étaient infiltrées par des cellules inflammatoires, comme l’indiquent les flèches rouges ici. Des CTL V alpha deux positifs spécifiques aux ovules en rouge ont été trouvés pour infiltrer les tissus tumoraux exprimant les ovules en vert.

Alors que les tumeurs chez les souris des groupes témoins avaient moins ou pas de cellules infiltrantes tumorales dans cette figure, les suspensions de cellules uniques des tissus tumoraux ont été analysées pour l’expression de la positivité V alpha deux et de la positivité V bêta cinq par cytométrie en flux après contrôle sur la population positive CD huit. Notez que les tissus tumoraux de souris transférées adoptivement avec des cellules IPS transduites TCR présentaient le plus haut niveau de cellules infiltrant la tumeur, tandis que les tumeurs de souris ayant reçu un contrôle. L’IPS transduite n’a montré aucune infiltration par des cellules T CD huit positives spécifiques aux ovules.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à partir des cellules IPS et de la façon d’évaluer les fonctions des lymphocytes T dérivés de l’IPS.