Name: Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à légard des lymphocytes T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Apprenez la différenciation de cellules souches pluripotentes induites en lymphocytes T pour l'immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode permet de générer des cellules T antigéniques spécifiques capables de protéger contre les tumeurs.

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Nous remercions le Dr Shinya Yamanaka (Université de Kyoto) pour fournir iPS-MEF-Ng-20D-17 lignée cellulaire, le Dr Dario Vignali (recherche de l&#39;Hôpital pour enfants St. Jude) pour supporter le OT1-2A • pMig II construction, le Dr Juan Carlos Zuniga-Pflücker (Département d&#39;immunologie, Université de Toronto) pour supporter la lignée cellulaire OP9-DL1, et le Dr Kent Vrana E (Département de pharmacologie, Université de Penn State College of Medicine) pour aider à la conception de cette étude. Ce projet est financé, au titre des subventions avec le numéro de subvention K18CA151798 de l&#39;Institut national du cancer, la Fiducie et de la recherche Barsumian mélanome Fondation (Song J.).

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Pour ACT-thérapies basées sur la production in vitro d&#39;un grand nombre de très réactifs Ag des cellules T spécifiques in vivo pour re-perfusion est une approche optimale. Bien que notre méthode in vitro donne lieu de fonctionnelles des cellules T à partir de cellules iPS, un grand nombre de cellules iPS dérivées des cellules meurent en quatre semaines, en particulier dans la quatrième semaine. Nous concluons que les signaux de survie de signalisation Notch médié par le DL1 a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Souris C57BL/6J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 002216 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (2C11) antibody </td><td> BD PharMingen </td><td> 553058 </td></tr><tr><td> Anti-CD28 (37,51) antibody </td><td> BD PharMingen </td><td> 553295 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (17A2) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td> Anti-CD4 (GK1.5) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td> Anti-CD8 (53 à 6,7) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td> Anti-CD25 (3C7) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td> Unti-CD44 (1M7) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td> Anti-CD117 (2B8) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td> Anti-TCR-β (H57597) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td> Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td> Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody </td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> Un brefeldine </td><td> Sigma </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> Sciences intégrées </td><td> 204130 </td></tr><tr><td> ARN kit &lt;/ Td&gt; <td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> L&#39;ADN kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8 Kit d&#39;isolation </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> Un tampon de lyse ACK </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> mIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC anti-OVA anticorps </td><td> Immunochemicals Rockland </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Tampon de perméabilisation </td><td> Biolegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> Formaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0,4 um filtre </td><td> Millipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; Trieur de cellules MoFlo </td><td> Cytomation Dake </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux Calibur </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre LSR débit II </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Souris de contention </td><td> Braintree scientifique </td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes t

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Transfert de cellules adoptif (ACT) de lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène CD8 + cytotoxiques (CTL) est un traitement prometteur pour une variété de tumeurs malignes 1. CTL peut reconnaître les cellules malignes en interagissant avec des antigènes tumoraux les récepteurs de cellules T (TCR) et cytotoxines libération ainsi que les cytokines pour tuer les cellules malignes. Il est connu que moins différenciés et du centre-mémoire (appelé comme hautement réactif) CTL sont la population optimale pour l&#39;ACT à base d&#39;immunothérapie, parce que ces CTL ont un potentiel de prolifération élevé, sont moins enclins à l&#39;apoptose que les cellules plus différenciées et ont un une plus grande capacité à répondre à des cytokines homéostatiques 2-7. Toutefois, en raison de difficultés dans l&#39;obtention d&#39;un nombre élevé de CTL ces provenant de patients, il ya un besoin urgent de trouver une nouvelle approche pour générer hautement réactifs Ag-CTL spécifiques pour le succès des thérapies à base ACT-. Transduction TCR de la tige d&#39;auto-renouvelablecellules de reconstitution immunitaire a un potentiel thérapeutique pour le traitement de maladies 8-10. Toutefois, l&#39;approche pour obtenir des cellules souches embryonnaires (CSE) provenant de patients n&#39;est pas possible. Bien que l&#39;utilisation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) à des fins thérapeutiques a été largement appliqué dans la clinique 11-13, CSH ont réduit la différenciation et la prolifération des capacités, et les CSH sont difficiles à développer dans la culture cellulaire in vitro 14-16. Dernières technologies de cellules iPS et le développement d&#39;un système in vitro pour la livraison de gènes sont capables de générer des cellules iPS à partir de patients, sans aucune approche chirurgicale. En outre, comme les CES, les cellules iPS possèdent la capacité de prolifération indéfinie in vitro, et ont été montrés à se différencier en cellules hématopoïétiques. Ainsi, les cellules iPS ont un plus grand potentiel pour être utilisé dans ACT à base d&#39;immunothérapie par rapport aux CES ou CSH. Ici, nous présentons les méthodes pour la génération de lymphocytes Tcytes à partir de cellules iPS in vitro, in vivo et dans la programmation de l&#39;antigène-CTL spécifiques à partir de cellules iPS pour la promotion de la surveillance du cancer immunitaire. Stimulation in vitro avec un ligand de Notch entraîne la différenciation des cellules T à partir de cellules iPS, et les résultats TCR transduction de gènes dans des cellules iPS se différencier en cellules spécifiques de l&#39;antigène T in vivo, ce qui empêche la croissance tumorale. Ainsi, nous démontrons spécifique de l&#39;antigène différenciation des cellules T à partir de cellules iPS. Nos études fournissent une approche potentiellement plus efficace pour générer des CTL spécifiques de l&#39;antigène de l&#39;ACT à base de thérapies et de faciliter l&#39;élaboration de stratégies thérapeutiques pour les maladies.

Génération des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) donne une approche alternative de l&#39;utilisation de cellules souches embryonnaires à des cellules T à base d&#39;immunothérapie. Procédé montre que, en utilisant soit<em&gt; In vitro</em&gt; Ou<em&gt; In vivo</emSystème d&#39;induction&gt;, les cellules iPS peuvent se différencier en lymphocytes T à la fois classiques et spécifiques de l&#39;antigène.

Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes T

Le transfert adoptif de cellules (ACT) de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+ antigène-spécifiques constitue un traitement prometteur pour diverses affections malignes 1. Les CTL peuvent ...

L'objectif général de cette procédure est de générer et de caractériser des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites ou cellules IPS. Les cellules IPS peuvent ensuite être différenciées in vitro dans un système de culture OP9-DL1, puis mûries in vivo chez une souris déficiente en rag. Alternativement, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour surexprimer le TCR OT1, puis transférées de façon adoptive afin de permettre leur développement in vivo.Après six semaines de différenciation in vivo, les souris peuvent être soumises à une injection intrapéritonéale de sept cellules tumorales EEG, puis la spécificité antigénique des lymphocytes T dérivés des IPS peut être évaluée. En définitive, les cellules IPS peuvent se différencier en lymphocytes T conventionnels et en lymphocytes T spécifiques de l'antigène, ces derniers étant capables de protéger les animaux contre le défi tumoral. Les implications de cette technique s'étendent vers l'immunothérapie anticancéreuse individualisée.La méthode permet de générer un grand nombre de lymphocytes T réactifs contre la tumeur à partir d'une quantité minimale de sang ou de tissu cutané du patient. Au jour zéro,

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Suppression de la réplication du virus de l’hépatite B à l’aide de lymphocytes T spécifiques de l’antigène viral

Cette vidéo présente un test permettant de générer des cellules T CD8αβ+ dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques de l’antigène tumoral. Les iPSC spécifiques de l’antigène tumoral sont cultivées sur une monocouche de cellules stromales et différenciées en cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC). Les HPC sont différenciés en lymphocytes T CD4+ CD8+ doublement positifs à l’aide d’un milieu de différenciation. Ces cellules sont ensuite stimulées pour générer des...

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Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l'hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l'antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l'immunothérapie act-basée potentielle de l'infection de HBV.

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