Name: Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez comment mesurer la diffusion moléculaire dans les membranes plasmatiques de lymphocytes primaires par spectroscopie de corrélation de fluorescence. Cette technique permet d'étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans des cellules vivantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Vladana Vukojevic, Centre de médecine moléculaire, Karolinska Institutet pour l&#39;entretien de l&#39;instrument Zeiss ConfoCor 3 et pour obtenir des conseils utiles concernant les mesures de cellules. Cette étude a été financée par des subventions de Vetenskapsrådet (numéro de subvention 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse et de Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

<ol><li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes%3A+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li>
<li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein%2Flipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li>
<li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.200910041/abstract">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li>
<li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).</li>
<li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li>
<li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImFCS%3A+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li>
<li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-techniques%3A+advances+in+receptor+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li>
<li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li>
<li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li>
<li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li>
<li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li>
<li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100036a009">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li>
<li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li>
<li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II%3A+application+to+simulated+and+in+vitro+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li>
<li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+%28mICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435(2016).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole a pour FCS peut être utilisé pour l&#39;évaluation de la dynamique moléculaire des molécules de surface sur tous les types de cellules immunitaires (murins, humains ou d&#39;autres espèces). Mesures FCS dynamique moléculaire spatio-temporelles vers le bas à la résolution une seule molécule dans les cellules vivantes. La densité moléculaire, ainsi que la vitesse de diffusion et de regroupement dynamique des protéines d&#39;intérêt, peuvent être extraits à partir des courbes d&#39;auto-corrélation. <p cla...

De nombreuses fonctions des cellules immunitaires reposent sur la diffusion et les interactions au sein des membranes moléculaire. Les membranes biologiques sont complexes et nombreux facteurs qui peuvent être importants pour la fonction des cellules immunitaires peuvent influencer la vitesse de diffusion translationnelle des protéines dans les membranes cellulaires 1. Nous avons récemment montré que tueuses naturelles (cellules NK), les lymphocytes appartenant au système immunitaire inné, présentent la diffusion différentielle de deux protéines étudiées à la membrane cellulaire en fonction de l&#39;état de l&#39; activation des cellules NK 2. La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique qui est capable de quantifier les vitesses de diffusion moléculaire dans les membranes biologiques. Il rend compte de la vitesse de diffusion moyenne de molécules marquées par fluorescence dans un volume fixe, généralement l&#39;objet d&#39;un microscope confocal. Elle est basée sur la mesure des fluctuations de fluorescence qui se produit lors d&#39;un mouvement moléculaireun système dans l&#39;état d&#39;équilibre. FCS a été largement utilisé pour l&#39;étude de la diffusion des colorants et des protéines fluorescentes, à la fois en solution et dans des membranes lipidiques. D&#39; autres paramètres de sortie qui affectent la vitesse de diffusion peuvent également être étudiés indirectement de cette manière (par exemple, des changements de conformation des protéines ou des interactions des molécules sur les membranes cellulaires) 3, 4. FCS se distingue par rapport aux autres techniques en raison de sa haute sensibilité, ce qui permet la possibilité pour la détection de molécule unique. Cela fonctionne bien pour les concentrations moléculaires dans la gamme nanomolaire à millimolaire, ce qui est typique pour des niveaux d&#39;expression endogènes de la plupart des protéines 5. En outre, FCS peut donner une approximation du nombre absolu de protéines dans le volume étudié, alors que la plupart des autres techniques donnent seulement des informations relatives au sujet des niveaux d&#39;expression de protéine. D&#39;autres méthodes pour mesurer les taux de diffusion moléculaire dans les membranes comprennent fluorécupération rescence après photoblanchiment (FRAP), seul le suivi des particules (SPT), multiple sténopé FCS, et l&#39;image de corrélation méthodes. Méthodes de FRAP et de l&#39; image de corrélation sont des techniques d&#39; ensemble, qui généralement ne donnent pas d&#39; informations sur le nombre absolu de molécules 10. Par rapport à SPT, le débit de FCS est plus élevé en ce qui concerne la caractérisation de la moyenne de la population. L&#39;analyse est moins exigeant étant donné que la vitesse de diffusion moyenne des molécules présentes à l&#39;intérieur de la focalisation du laser est mesurée, plutôt que le taux de molécules uniques. Aussi, à moins que des microscopes spécialisés sont disponibles 11, SPT ne peut donner aucune information sur les concentrations, puisque l&#39; étiquetage SPT standard doit être très faible pour permettre l&#39;identification de molécules simples. D&#39;autre part, FCS exige que les molécules à l&#39;étude pour être mobile. Il sera tout simplement pas détecter d&#39;éventuelles fractions ou molécules immobiles putatifs se déplaçant très lentement. Le taux de molécules de diffusion quirésider dans le foyer plus longtemps que d&#39; environ un dixième du temps d&#39;acquisition ne sera pas correctement représentée dans les mesures de FCS 3, 12. Par conséquent, les coefficients de diffusion enregistrés par FCS ont tendance à être plus rapide que les vitesses de diffusion signalés par des techniques comme FRAP et SPT, où les fractions proches à immobile et très lents sont pris en compte. SPT donnera également une description plus détaillée de la variabilité des taux de diffusion au sein de la population moléculaire que FCS sera. FCS quantifie la fluctuation d&#39;intensité de fluorescence au fil du temps dans le volume excité. Dans le cas des mesures de la membrane, cela se traduit par la zone éclairée de la membrane. Dans cet article, nous utilisons le fait que de telles fluctuations sont induites par des molécules présentant la diffusion brownienne et se déplacent donc dans et hors du volume d&#39;excitation. Il y a aussi plusieurs autres sources possibles pour la fluctuations du signal de fluorescence, comme clignotant ou la présence d&#39;un état de triplet dans les fluorophores, des effets sur l&#39;environnement, la liaison-déliaison du ligand, ou le déplacement de la membrane de la cellule entière. Ces sources d&#39;erreur putatifs doivent être prises en considération lors de la conception d&#39; une expérience FCS afin d&#39;interpréter correctement les résultats 12, 13. En règle générale, les taux de diffusion latérale dans les membranes biologiques sont faibles en raison de l&#39;encombrement et des interactions entre les deux protéines de membrane et entre les protéines et le cytosquelette. Historiquement, l&#39;utilisation de FCS dans les membranes a ainsi été entravée par le manque de fluorophores photo-stable, qui sont nécessaires pour éviter le blanchiment pendant les temps de transit prolongés à travers la mise au point d&#39;excitation 14. Cependant, aujourd&#39;hui, il y a beaucoup d&#39;options pour les colorants photo-stables appropriés. Des améliorations significatives dans les détecteurs et autres matériels permettent également la détection de prote fluorescentins et colorants de luminosité plus faible. Ici, un protocole de base pour l&#39;application du FCS à l&#39;aide de lymphocytes primaires murins, où la protéine d&#39;intérêt est marqué avec un anticorps étiqueté par fluorescence, est décrite. Une approche pour adapter les courbes d&#39;autocorrélation afin d&#39;en extraire le coefficient de diffusion et la densité moléculaire est également représentée. Le protocole vise à être facilement suivie par immunologistes sans expérience préalable des techniques pour étudier la diffusion des molécules. Cependant, une compréhension de base de la microscopie confocale devrait (d&#39;acquérir cette connaissance de base, voir la référence 15). Ce protocole peut assez facilement être adapté à d&#39;autres cellules en suspension, les deux lignées cellulaires et des cellules primaires. Pour les utilisateurs plus expérimentés FCS, des méthodes d&#39;analyse plus raffinées existent, dont certains sont décrits dans la discussion.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit souris II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Sélection négative des cellules NK</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Phosphate inactivé</td>à la chaleur</tr><tr><td>Sérum salin tamponné</td><td>-</td><td>-</td><td>Fabriqué en maison&nbsp ;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute moyen 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&nbsp ;</td><td>E15-848</td><td>Fluide transparent</td></tr><tr><td>Clone d’anticorps 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Pour le blocage des récepteurs Fc.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ly49A&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Anticorps monoclonal fabriqué en interne et conjugué en interne à l’anticorps anti-H-2Dd Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Conjugué en interne à MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Colorant fluorescent pour la conjugaison d’anticorps.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Dilué dans de l’eau distillée (1.10)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (20 kDa) greffé avec du polyéthylène glycol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Dilué dans du PBS (pH 7,4) à 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Chlorure de rhodamine 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Coefficient de diffusion connu : 3,3 &times ; 10&minus ; 10 m2/s 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A20006</td><td>Coefficient de diffusion connu : 4,4 &times ; 10&moins ; 10 m2/s 20</td></tr><tr><td>microscope confocal&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel : Confocor 3</td> Logiciel <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Matlab avec boîte à outils d’ajustement courbe</td><td>Version</td><td>R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&nbsp ;</td><td>155411</td><td>8 puits, fond borosilicaté 1,0</td></tr></tbody></table>

diffusion moléculaire membranes plasmatiques de lymphocytes primaires mesurées par fluorescence correlation spectroscopy

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

spectroscopie de fluorescence de corrélation (FCS) est une technique puissante pour étudier la diffusion des molécules dans les membranes biologiques avec une résolution spatiale et temporelle. FCS peut quantifier la concentration et le coefficient de diffusion moléculaire des molécules marquées par fluorescence dans la membrane cellulaire. Cette technique a la capacité d&#39;explorer les caractéristiques de diffusion moléculaire de molécules dans la membrane plasmique des cellules immunitaires à l&#39; état d&#39; équilibre (ie, sans processus affectant le résultat pendant la durée de la mesure réelle). FCS est adapté à l&#39;étude de la diffusion des protéines qui sont exprimées à des niveaux typiques pour la plupart des protéines endogènes. Ici, un procédé simple et robuste pour déterminer le taux de protéines de la membrane cellulaire sur les lymphocytes primaires de diffusion est démontrée. Un moyen efficace d&#39;effectuer des mesures sur des cellules vivantes d&#39;anticorps tachés et observations qui se produisent souvent après acquisition sont décrits. Les récents progrèsdans le développement des colorants fluorescents photo-stable peut être utilisé en conjugant les anticorps d&#39;intérêt pour les colorants appropriés qui ne sont pas largement décolorent lors de la mesure. En outre, cela permet la détection d&#39;entités à diffusion lente, ce qui est une caractéristique commune des protéines exprimées dans les membranes cellulaires. La procédure d&#39;analyse pour extraire des paramètres de concentration et de diffusion moléculaire à partir des courbes d&#39;auto-corrélation générée est mise en évidence. En résumé, un protocole de base pour la mesure FCS est fourni; elle peut être suivie par des immunologistes avec une compréhension de la microscopie confocale, mais sans autre expérience préalable des techniques de mesure des paramètres dynamiques, tels que les taux de diffusion moléculaire.

Un résultat typique va générer une courbe d'auto-corrélation avec un temps de transit dans la plage de 10 ms à 400 ms pour les protéines de membrane. Le nombre de molécules peut varier entre 0,5 et environ 200 um par 2 pour les protéines exprimées de manière endogène. Vérifiez soigneusement que le CPM est pas plus faible que prévu. Cela peut signifier qu'il ya une influence du signal d'arrière-plan. En règle générale, le signal de la RPC sur les cellules qui est accepté pour l...

Une méthode de mesure de la diffusion des protéines dans les membranes des cellules immunitaires primaires à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est décrite. Dans cet article, l’utilisation d’anticorps pour le marquage fluorescent est illustrée.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

L’objectif général de ce protocole est de mesurer le taux de diffusion d’une protéine marquée dans les membranes des cellules immunitaires primaires à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence. Cette méthode peut aider à identifier des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la biologie cellulaire, telles que l’identification de cellules tueuses naturelles avec une dynamique de récepteur membranaire plus active. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est utilisée avec des cellules vivantes, de sorte qu’elle reflète avec précision l’état naturel de la façon dont les molécules se déplacent.Les implications de cette technique s’étendent à l’immunothérapie du cancer si différents traits naturels des cellules tueuses, tels que la diffusion moléculaire, sont liés à leur fonction qui permet de mieux prédire l’efficacité. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du mouvement moléculaire dans les cellules immunitaires, elle peut également être appliquée à d’autres cellules primaires et lignées cellulaires dans n’importe quelle discipline. Ouvrez le logiciel en mode expert, avec l’option Scanner de nouvelles images sélectionnée.Sélectionnez la lentille de l’objectif à eau 40X sur le microscope confocal à balayage laser. Sous l’onglet Acquérir, appuyez sur les boutons Config et Scan pour ouvrir le contrôle de configuration et le contrôle de numérisation. Sous l’onglet ConfoCor, appuyez sur Mesure pour ouvrir la fenêtre Mesure.Ensuite, créez un dossier pour enregistrer les mesures FCS. Démarrez une nouvelle base de données d’images en cliquant sur Nouveau sous l’onglet Fichier. Allumez la lampe halogène.À l’aide du bouton Laser, allumez les lasers appropriés pour exciter les fluorophores. Spécifiez ensuite les paramètres de capture d’image dans la fenêtre Contrôle de configuration. Cela comprend le laser d’excitation, les filtres d’excitation et d’émission, le trajet de la lumière et les détecteurs utilisés.De même, allez dans la fenêtre Mesure et ajustez les paramètres FCS sous l’onglet Configuration du système. Activez les canaux de détection pour les enregistrements FCS en basculant Ch 1 pour le canal vert et Ch 2 pour le canal rouge. Pendant que le laser se stabilise, ce qui peut prendre jusqu’à 30 minutes, ajustez le sténopé.Tout d’abord, placez une goutte de 50 microlitres de colorant au centre dans un puits d’une lame de verre de couverture à huit chambres recouverte de poly-L-lysine. Les puits adjacents sont utilisés pour effectuer des mesures de cellules, car l’étalonnage dépend de la glissière. Mettez une goutte d’eau distillée sur l’objectif à eau 40X et positionnez la diapositive.Appuyez ensuite sur Vis pour sélectionner la source de lumière visible et concentrez-vous sur la position centrale de la gouttelette de fluorophore. Dans la fenêtre Mesure du logiciel, sélectionnez l’onglet Acquisition et sous Positions, basculez la position actuelle. Revenez ensuite à l’onglet Configuration du système dans la même fenêtre et définissez une puissance élevée ou saturée pour le laser vert.Pour tester la stabilité du signal, appuyez sur Démarrer pour ouvrir une nouvelle fenêtre affichant la courbe de corrélation Time trace et Auto. Vérifiez que le signal fluorescent est élevé, stable et que l’axe des y présente une fluctuation dans la gamme des kilohertz. Des valeurs inférieures peuvent être dues à une mise au point imprécise ou à la dégradation du colorant.Ensuite, dans la fenêtre Mesure, sélectionnez le bouton O Ajuster. Sélectionnez ensuite le canal de détection correct et appuyez sur Réglage automatique X.Si la limite supérieure de la courbe résultante est manquante ou non centrée, cochez l’option Grossier et appuyez à nouveau sur Réglage automatique X. Après avoir réglé la direction X, faites de même pour la direction Y en appuyant sur Réglage automatique Y.Désélectionnez Grossier et alternez entre le réglage X et Y en appuyant sur Réglage automatique jusqu’à ce que les deux aient des maxima clairs et des valeurs stables.Si les cellules sont marquées par deux fluorophores différents, ajoutez une goutte de solution de fluorophore rouge dans une chambre adjacente. Calibrez ensuite le deuxième canal. Réglez le laser rouge sur une puissance élevée et répétez la procédure d’étalonnage de stabilité.Ensuite, nous mesurons le temps de transit des fluorophores à diffusion libre à travers le foyer. Et nous utilisons ensuite la platine pour calculer l’aire de la membrane cellulaire qui se trouve dans le foyer. Pour commencer, concentrez-vous sur une gouttelette de solution en effectuant soigneusement la procédure de réglage.Ensuite, allez dans l’onglet Acquisition de la fenêtre Mesure et réglez le temps d’acquisition sur 30 secondes avec trois répétitions. Réglez la puissance du laser sur une saturation proche de la saturation et appuyez sur Start pour prendre une mesure. Enregistrez les comptages par molécule ou CPM une fois la mesure terminée.Ensuite, prenez de nouvelles mesures en réduisant de manière itérative la puissance du laser. Dans cette plage de puissance, incluez la puissance attendue des mesures de cellule à venir. Vérifiez ensuite que les valeurs CPM évoluent linéairement avec la puissance du laser.À condition que le reste de l’échelle soit linéaire, la saturation à la puissance la plus élevée est acceptable. La première fois qu’un anticorps fluorescent nouvellement conjugué est utilisé, effectuez une mesure FCS des anticorps à diffusion libre pour quantifier la CPM attendue. Et il est important d’utiliser des puits recouverts de PEG Poly-L-Lysine pour les anticorps libres.Pour cette procédure, enduire une lame chambrée de 200 microlitres de Poly-L-Lysine greffée sur du polyéthylène glycol. Laissez la solution adhérer pendant une heure à température ambiante. La solution mère peut être réfrigérée jusqu’à deux semaines.Et le bouillon de poudre doit être conservé au congélateur. Plus tard, retirez le liquide et laissez la chambre sécher à l’air. Au microscope, diluez l’anticorps dans le PBS entre un et 10 microgrammes par millilitre.Procédez à la mesure du temps de transit des anticorps libres comme décrit dans la section précédente pour les fluorophores libres. Pour prendre la mesure dans une cellule, ajoutez 125 microlitres de cellules dans du PBS plus 1 % de FCS à partir de la suspension cellulaire marquée par l’anticorps. Et 150 microlitres de transparent Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 dans un puits vide dans la diapositive de verre recouverte de PLL.Laissez les cellules incuber dans l’obscurité à la température de mesure pendant au moins 20 minutes avant de continuer, afin que les cellules puissent se fixer et s’équilibrer. Commencez l’imagerie par des balayages XY rapides pour trouver la puissance laser la plus faible possible nécessaire pour visualiser les cellules. Centrez ensuite l’image sur une cellule ronde de luminosité moyenne où la membrane est clairement définie.Il est crucial qu’il n’y ait pas de signal fluorescent dans le cytoplasme. Zoomez jusqu’à ce que la cellule couvre la majeure partie de l’image. Concentrez-vous ensuite sur le haut de la membrane cellulaire.Commencez par le centre de la cellule et déplacez-vous vers le haut jusqu’à ce que le centre de l’image montre une petite zone ronde avec une fluorescence uniforme. Il est crucial de placer soigneusement l’attention. Si le foyer n’est pas dans la membrane, la fluorescence détectée ne proviendra pas des récepteurs membranaires marqués par fluorescence.Et donc les résultats ne seront pas le reflet de leur comportement. Maintenant, sous l’onglet Acquisition de la fenêtre Mesure, sélectionnez une position pour la mesure FCS en activant le réticule. Réglez ensuite le nombre de répétitions entre six et 10 et réglez le temps de mesure sur 10 secondes par répétition.Revenez maintenant à l’onglet Configuration du système de la fenêtre de mesure et réduisez la puissance laser pour les mesures FCS entre un et 10 microwatts. Appuyez ensuite sur Démarrer. Si la trace d’intensité diminue de plus de 30 % au cours des 10 premières secondes, la cellule a alors été trop blanchie et une autre cellule doit être mesurée à une puissance inférieure.Si le signal est perdu, ajustez la mise au point dans la direction Z et redémarrez la mesure. Une fois la mesure terminée, regardez dans la fenêtre Contrôle de balayage pour vérifier que la cellule est toujours centrée afin de vous assurer que sa membrane a été mesurée. Si la cellule s’est déplacée, ignorez les données.Allez maintenant dans la fenêtre Corrélation automatique et supprimez manuellement les répétitions individuelles qui contiennent des manœuvres de zoom, du blanchiment, de grands clusters ou d’autres artefacts. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Supprimer pour supprimer les artefacts. La sélection des artefacts réels nécessite de la pratique.L’élimination des répétitions est un processus simple, mais les répétitions doivent être évaluées correctement pour savoir ce qui doit être supprimé et ce qui ne doit pas l’être. Enregistrez ensuite le fichier final au format FCS. Conservez uniquement les cellules qui ont au moins quatre répétitions restantes après la suppression des artefacts pour une analyse plus approfondie.Une courbe d’autocorrélation typique d’un récepteur membranaire est lisse et a un temps de transit de l’ordre de 10 à 400 millisecondes. Définissez les domaines d’ajustement de sorte que le début et la fin de la partie en pente la plus raide, représentant la diffusion, soient représentés. À l’aide d’un modèle de diffusion libre en deux dimensions pour ajuster les données, faites attention à la partie la plus fortement inclinée de la courbe.De petites fluctuations d’environ une seconde à l’échelle tau, observées dans le résidu, sont acceptables. Si la courbe s’ajuste mal, mais que la cellule ne présente pas de problèmes apparents, tels que le déplacement, le blanchiment ou les grappes, les valeurs de départ ou les limites supérieure et inférieure du modèle doivent probablement être modifiées. Une fois que le modèle s’ajuste bien à la courbe de corrélation automatique, extrayez les valeurs des paramètres variables.Le nombre de molécules peut varier entre 0,5 et environ 200 par micron carré pour les protéines exprimées de manière endogène. Vérifiez que la valeur CPM de la mesure cellulaire est d’au moins 33 % de celle enregistrée à partir d’anticorps à diffusion libre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le taux de diffusion des protéines à l’aide de la spectroscopie de corrélation fluorescente.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de garder les cellules sur la glace jusqu’à environ 20 minutes avant le début de la mesure. Ne mesurez pas d’échantillons plus de deux heures.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la corrélation entre le taux de diffusion et le niveau d’expression d’une certaine protéine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie moléculaire et de l’immunologie pour explorer la dynamique des protéines dans les cellules vivantes.

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Cette vidéo montre l’utilisation de la spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour détecter l’interaction entre les protéines de surface cellulaire au niveau des contacts cellule-cellule. En exprimant le récepteur d’adhésion transmembranaire d’intérêt marqué par une protéine fluorescente et en mélangeant deux populations cellulaires différentes hébergeant deux marqueurs fluorescents séparés spectralement, la trans-interaction entre les récepteurs de deux cellules voisines avec une...

Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’interaction des protéines aux contacts cellulaires

Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d'analyse de fluctuation k-image de l'espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Nous présentons une nouvelle technique pour mesurer la diffusion latérale d’une espèce active de surface à l’interface fluide-fluide en fusionnant une monocouche de gouttelettes sur une monocouche plate.

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Cet article vise à présenter un protocole sur la façon de construire un microscope svFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) à variation ponctuelle pour mesurer la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes.

Spectroscopie de corrélation de fluorescence à variation ponctuelle pour l’analyse de la diffusion moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules vivantes

Nous présentons un protocole expérimental et un flux de travail d’analyse de données pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée à un transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence.

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Découvrez comment mesurer la diffusion moléculaire dans les membranes plasmatiques de lymphocytes primaires par spectroscopie de corrélation de fluorescence. Cette technique permet d'étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans des cellules vivantes.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Explorer plus de vidéos