Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

L’objectif général de ce protocole est de mesurer le taux de diffusion d’une protéine marquée dans les membranes des cellules immunitaires primaires à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence. Cette méthode peut aider à identifier des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la biologie cellulaire, telles que l’identification de cellules tueuses naturelles avec une dynamique de récepteur membranaire plus active. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est utilisée avec des cellules vivantes, de sorte qu’elle reflète avec précision l’état naturel de la façon dont les molécules se déplacent.

Les implications de cette technique s’étendent à l’immunothérapie du cancer si différents traits naturels des cellules tueuses, tels que la diffusion moléculaire, sont liés à leur fonction qui permet de mieux prédire l’efficacité. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du mouvement moléculaire dans les cellules immunitaires, elle peut également être appliquée à d’autres cellules primaires et lignées cellulaires dans n’importe quelle discipline. Ouvrez le logiciel en mode expert, avec l’option Scanner de nouvelles images sélectionnée.

Sélectionnez la lentille de l’objectif à eau 40X sur le microscope confocal à balayage laser. Sous l’onglet Acquérir, appuyez sur les boutons Config et Scan pour ouvrir le contrôle de configuration et le contrôle de numérisation. Sous l’onglet ConfoCor, appuyez sur Mesure pour ouvrir la fenêtre Mesure.

Ensuite, créez un dossier pour enregistrer les mesures FCS. Démarrez une nouvelle base de données d’images en cliquant sur Nouveau sous l’onglet Fichier. Allumez la lampe halogène.

À l’aide du bouton Laser, allumez les lasers appropriés pour exciter les fluorophores. Spécifiez ensuite les paramètres de capture d’image dans la fenêtre Contrôle de configuration. Cela comprend le laser d’excitation, les filtres d’excitation et d’émission, le trajet de la lumière et les détecteurs utilisés.

De même, allez dans la fenêtre Mesure et ajustez les paramètres FCS sous l’onglet Configuration du système. Activez les canaux de détection pour les enregistrements FCS en basculant Ch 1 pour le canal vert et Ch 2 pour le canal rouge. Pendant que le laser se stabilise, ce qui peut prendre jusqu’à 30 minutes, ajustez le sténopé.

Tout d’abord, placez une goutte de 50 microlitres de colorant au centre dans un puits d’une lame de verre de couverture à huit chambres recouverte de poly-L-lysine. Les puits adjacents sont utilisés pour effectuer des mesures de cellules, car l’étalonnage dépend de la glissière. Mettez une goutte d’eau distillée sur l’objectif à eau 40X et positionnez la diapositive.

Appuyez ensuite sur Vis pour sélectionner la source de lumière visible et concentrez-vous sur la position centrale de la gouttelette de fluorophore. Dans la fenêtre Mesure du logiciel, sélectionnez l’onglet Acquisition et sous Positions, basculez la position actuelle. Revenez ensuite à l’onglet Configuration du système dans la même fenêtre et définissez une puissance élevée ou saturée pour le laser vert.

Pour tester la stabilité du signal, appuyez sur Démarrer pour ouvrir une nouvelle fenêtre affichant la courbe de corrélation Time trace et Auto. Vérifiez que le signal fluorescent est élevé, stable et que l’axe des y présente une fluctuation dans la gamme des kilohertz. Des valeurs inférieures peuvent être dues à une mise au point imprécise ou à la dégradation du colorant.

Ensuite, dans la fenêtre Mesure, sélectionnez le bouton O Ajuster. Sélectionnez ensuite le canal de détection correct et appuyez sur Réglage automatique X.Si la limite supérieure de la courbe résultante est manquante ou non centrée, cochez l’option Grossier et appuyez à nouveau sur Réglage automatique X. Après avoir réglé la direction X, faites de même pour la direction Y en appuyant sur Réglage automatique Y.Désélectionnez Grossier et alternez entre le réglage X et Y en appuyant sur Réglage automatique jusqu’à ce que les deux aient des maxima clairs et des valeurs stables.

Si les cellules sont marquées par deux fluorophores différents, ajoutez une goutte de solution de fluorophore rouge dans une chambre adjacente. Calibrez ensuite le deuxième canal. Réglez le laser rouge sur une puissance élevée et répétez la procédure d’étalonnage de stabilité.

Ensuite, nous mesurons le temps de transit des fluorophores à diffusion libre à travers le foyer. Et nous utilisons ensuite la platine pour calculer l’aire de la membrane cellulaire qui se trouve dans le foyer. Pour commencer, concentrez-vous sur une gouttelette de solution en effectuant soigneusement la procédure de réglage.

Ensuite, allez dans l’onglet Acquisition de la fenêtre Mesure et réglez le temps d’acquisition sur 30 secondes avec trois répétitions. Réglez la puissance du laser sur une saturation proche de la saturation et appuyez sur Start pour prendre une mesure. Enregistrez les comptages par molécule ou CPM une fois la mesure terminée.

Ensuite, prenez de nouvelles mesures en réduisant de manière itérative la puissance du laser. Dans cette plage de puissance, incluez la puissance attendue des mesures de cellule à venir. Vérifiez ensuite que les valeurs CPM évoluent linéairement avec la puissance du laser.

À condition que le reste de l’échelle soit linéaire, la saturation à la puissance la plus élevée est acceptable. La première fois qu’un anticorps fluorescent nouvellement conjugué est utilisé, effectuez une mesure FCS des anticorps à diffusion libre pour quantifier la CPM attendue. Et il est important d’utiliser des puits recouverts de PEG Poly-L-Lysine pour les anticorps libres.

Pour cette procédure, enduire une lame chambrée de 200 microlitres de Poly-L-Lysine greffée sur du polyéthylène glycol. Laissez la solution adhérer pendant une heure à température ambiante. La solution mère peut être réfrigérée jusqu’à deux semaines.

Et le bouillon de poudre doit être conservé au congélateur. Plus tard, retirez le liquide et laissez la chambre sécher à l’air. Au microscope, diluez l’anticorps dans le PBS entre un et 10 microgrammes par millilitre.

Procédez à la mesure du temps de transit des anticorps libres comme décrit dans la section précédente pour les fluorophores libres. Pour prendre la mesure dans une cellule, ajoutez 125 microlitres de cellules dans du PBS plus 1 % de FCS à partir de la suspension cellulaire marquée par l’anticorps. Et 150 microlitres de transparent Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 dans un puits vide dans la diapositive de verre recouverte de PLL.

Laissez les cellules incuber dans l’obscurité à la température de mesure pendant au moins 20 minutes avant de continuer, afin que les cellules puissent se fixer et s’équilibrer. Commencez l’imagerie par des balayages XY rapides pour trouver la puissance laser la plus faible possible nécessaire pour visualiser les cellules. Centrez ensuite l’image sur une cellule ronde de luminosité moyenne où la membrane est clairement définie.

Il est crucial qu’il n’y ait pas de signal fluorescent dans le cytoplasme. Zoomez jusqu’à ce que la cellule couvre la majeure partie de l’image. Concentrez-vous ensuite sur le haut de la membrane cellulaire.

Commencez par le centre de la cellule et déplacez-vous vers le haut jusqu’à ce que le centre de l’image montre une petite zone ronde avec une fluorescence uniforme. Il est crucial de placer soigneusement l’attention. Si le foyer n’est pas dans la membrane, la fluorescence détectée ne proviendra pas des récepteurs membranaires marqués par fluorescence.

Et donc les résultats ne seront pas le reflet de leur comportement. Maintenant, sous l’onglet Acquisition de la fenêtre Mesure, sélectionnez une position pour la mesure FCS en activant le réticule. Réglez ensuite le nombre de répétitions entre six et 10 et réglez le temps de mesure sur 10 secondes par répétition.

Revenez maintenant à l’onglet Configuration du système de la fenêtre de mesure et réduisez la puissance laser pour les mesures FCS entre un et 10 microwatts. Appuyez ensuite sur Démarrer. Si la trace d’intensité diminue de plus de 30 % au cours des 10 premières secondes, la cellule a alors été trop blanchie et une autre cellule doit être mesurée à une puissance inférieure.

Si le signal est perdu, ajustez la mise au point dans la direction Z et redémarrez la mesure. Une fois la mesure terminée, regardez dans la fenêtre Contrôle de balayage pour vérifier que la cellule est toujours centrée afin de vous assurer que sa membrane a été mesurée. Si la cellule s’est déplacée, ignorez les données.

Allez maintenant dans la fenêtre Corrélation automatique et supprimez manuellement les répétitions individuelles qui contiennent des manœuvres de zoom, du blanchiment, de grands clusters ou d’autres artefacts. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Supprimer pour supprimer les artefacts. La sélection des artefacts réels nécessite de la pratique.

L’élimination des répétitions est un processus simple, mais les répétitions doivent être évaluées correctement pour savoir ce qui doit être supprimé et ce qui ne doit pas l’être. Enregistrez ensuite le fichier final au format FCS. Conservez uniquement les cellules qui ont au moins quatre répétitions restantes après la suppression des artefacts pour une analyse plus approfondie.

Une courbe d’autocorrélation typique d’un récepteur membranaire est lisse et a un temps de transit de l’ordre de 10 à 400 millisecondes. Définissez les domaines d’ajustement de sorte que le début et la fin de la partie en pente la plus raide, représentant la diffusion, soient représentés. À l’aide d’un modèle de diffusion libre en deux dimensions pour ajuster les données, faites attention à la partie la plus fortement inclinée de la courbe.

De petites fluctuations d’environ une seconde à l’échelle tau, observées dans le résidu, sont acceptables. Si la courbe s’ajuste mal, mais que la cellule ne présente pas de problèmes apparents, tels que le déplacement, le blanchiment ou les grappes, les valeurs de départ ou les limites supérieure et inférieure du modèle doivent probablement être modifiées. Une fois que le modèle s’ajuste bien à la courbe de corrélation automatique, extrayez les valeurs des paramètres variables.

Le nombre de molécules peut varier entre 0,5 et environ 200 par micron carré pour les protéines exprimées de manière endogène. Vérifiez que la valeur CPM de la mesure cellulaire est d’au moins 33 % de celle enregistrée à partir d’anticorps à diffusion libre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le taux de diffusion des protéines à l’aide de la spectroscopie de corrélation fluorescente.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de garder les cellules sur la glace jusqu’à environ 20 minutes avant le début de la mesure. Ne mesurez pas d’échantillons plus de deux heures.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la corrélation entre le taux de diffusion et le niveau d’expression d’une certaine protéine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie moléculaire et de l’immunologie pour explorer la dynamique des protéines dans les cellules vivantes.