Une méthode alternative et Validé Injection pour l'accès à l'espace sous-rétinien

L'objectif général de cette étude est de décrire une nouvelle technique d'injection sous-rétinienne permettant de cibler des vecteurs viraux, des agents pharmacologiques ou des cellules souches pluripotentes induites vers l'espace sous-rétinien chez la souris. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans les domaines de la science de la vision et de l'ophtalmologie, notamment en évaluant l'efficacité de nouvelles interventions thérapeutiques contre les dégénérescences rétiniennes. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à délivrer des substances dans l'espace sous-rétinien avec une efficacité élevée, des dommages minimes et une récupération rapide de la structure et de la fonction rétiniennes.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Sachin P, un technicien de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, raccourcir les vibrisses d'une souris anesthésiée afin de faciliter la visualisation, et maintenir la température corporelle de l'animal à 37 degrés Celsius à l'aide d'un coussin chauffant à circulation d'eau. Ensuite, dilater ses pupilles à l'aide de gouttes ophtalmiques de phényléphrine à 2,5 %.

Ensuite, appliquer des gouttes ophtalmiques à base de méthylcellulose pour prévenir la sécheresse oculaire et minimiser les cataractes transitoires induites par l'anesthésique. Stériliser les instruments avant la chirurgie. Par la suite, préparer la fluorescéine diluée dans une hotte de sécurité biologique.

Remplissez la seringue avec la quantité appropriée de fluorescéine. Ensuite, pincez l'orteil pour vous assurer que l'animal est profondément anesthésié, puis positionnez la souris de manière à ce que l'œil à injecter soit orienté vers le haut et clairement visible au microscope stéréoscopique. Pincez délicatement la conjonctive temporale avec une paire de forceps à pointes fines.

Ensuite, effectuez une incision circonférentielle d'environ 90 degrés à l'aide de ciseaux courbes de Vannas. Répétez la procédure sur la capsule de Tenon sous-jacente. Puis, résectionnez le tissu conjonctif environnant à l’aide de forceps à pointe fine, tout en faisant pivoter le globe oculaire vers la région nasale.

Travailler vers le site d'injection à environ 0,5 millimètre du nerf optique et prendre grand soin d'éviter de perturber le sinus rétro-orbitaire. Une étape critique consiste à exposer le site d'injection, ce qui nécessite une rotation de l'œil, sans endommager l'œil lui-même ni les structures associées, en particulier en évitant tout dommage au sac sanguin orbital. Dans cette procédure, pratiquer une petite incision dans la sclère au site d'injection en grattant délicatement la cupule oculaire avec une lame ophtalmique de 22,5 degrés.

Cette incision doit être juste assez grande pour permettre à la pointe de l'aiguille de traverser la sclérotique. Ensuite, insérez l'aiguille biseautée de calibre 33 dans la sclérotomie, le biseau tourné vers la rétine et orienté parallèlement à celle-ci. Injectez la quantité souhaitée de fluorescéine à 0,01 % en appuyant lentement sur le piston avec une pression régulière.

Remarquez que lorsque l'aiguille se trouve dans l'espace sous-rétinien, une légère résistance sera ressentie lors de l'appui sur le piston. Il n'y aura aucune résistance si l'aiguille transperce la rétine, mais une forte résistance si l'aiguille ne pénètre pas la sclérotique ou l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE). Une autre étape critique est l'injection ciblant l'espace sous-rétinien.

Cela doit être effectué sans pénétrer à travers la rétine neurosensorielle, jusqu'à la cavité vitrée. Attendre plusieurs secondes avant de retirer l'aiguille, afin de minimiser le reflux. Ensuite, rincer l'œil avec une solution saline stérile et s'assurer que l'œil est revenu à sa position normale.

Ensuite, appliquer une couche épaisse de crème ophtalmique antibiotique triple sur la surface cornéenne de l'œil injecté. Puis, placer la souris dans une cage propre et individuelle pour la récupération. Surveiller sa respiration et sa température pendant la récupération de l'anesthésie, et vérifier qu'elle est capable de maintenir une décubitus sternal.

Effectuer une surveillance et un traitement postopératoires supplémentaires appropriés, y compris une injection sous-cutanée de carprofène, pour la gestion de la douleur postopératoire. Voici une reconstruction 3D du bleb en forme de dôme au site d'injection. Le bleb en forme de dôme est ensuite rempli en blanc dense pour montrer l'étendue et les marges du détachement rétinien.

Les coupes transversales de la rétine provenant de l'OCT apparaissent en blanc, tandis que l'espace rempli de liquide au niveau de l'ÉPR et des photorécepteurs apparaît en noir. Et sur cette figure, les clichés représentatifs d'OCTB au site de détachement rétinien maximal sont montrés avant l'injection, 10 minutes après l'injection et quatre semaines après l'injection. Cette image montre la formation et la résolution d'un bleb plat suite à une injection de 0,3 microlitre.

Cette image montre la formation et la résolution d'une bulle bombée suite à une injection de 0,5 microlitre, tandis que cette image montre la formation et la résolution d'une bulle bombée suite à une injection d'un microlitre. Enfin, voici un exemple de cicatrisation choroidienne sévère et d'amin­cissement rétinien au site d'injection. Les rétines conservent une fonction normale après la résolution de la bulle.

Pour neuf intensités d'illumination, les formes d'onde des réponses médiées par les bâtonnets en conditions scotopiques sont présentées avant l'injection et quatre semaines après l'injection, pour des volumes injectés de 0,3 microlitre, 0,5 microlitre et 1 microlitre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes par œil. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'évaluer la santé des yeux avant de commencer.

Exclure les yeux présentant des opacités de la cornée ou du cristallin, ou les yeux profonds pour lesquels cette procédure serait très difficile. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la TOM et l'imagerie du fond d'œil peuvent être réalisées afin d'évaluer la qualité de l'injection.