Name: Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez la préparation de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines et leur injection sous-rétinienne chez des souris rd10. Cette méthode permet d'étudier les thérapies cellulaires pour restaurer la vision.

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Nous remercions Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee et Yingying Chung pour leur assistance technique pour la préparation des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de l’ESC h après cryoconservation. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la bourse de subvention de recherche pour jeunes chercheurs du Conseil national de recherches médicales (NMRC/OFYIRG/0042/2017) et de la subvention du 24e programme de recherche concurrentielle de la National Research Foundation (CRP24-2020-0083) à H.G.T.

Les expériences in vivo ont été réalisées conformément aux directives et au protocole approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de SingHealth (IACUC) et la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les chiots ont été immunodéprimés de P17 (avant la transplantation) à P30 (après la transplantation) en les nourrissant avec de l’eau potable contenant de la cyclosporine (260 g/L).
1. Préparation des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de l’ESC au jour 32 après cryoconservation
<ol><li>Préchauffer le milieu de différenciation des photorécepteurs (PRDM) dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Récupérer un flacon cryogénique contenant des cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de l’ESC au jour 32 à partir de l’azote liquide. Conserver sur de la glace sèche.</li>
	<li>Décongeler le cryoflacon à 37 °C au bain-marie pendant 3 à 5 minutes. Remettre en suspension le jour 32 cellules dans 1 mL de PRDM et centrifuger à 130 x g pendant 4 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PRDM.</li>
	<li>Retirer 10 μL du mélange pour le comptage des cellules. Mélanger les cellules en utilisant 0,2 % de bleu de trypan selon les instructions du fabricant. Pipeter le mélange de cellules dans la lame de la chambre de comptage des cellules. Déterminez le nombre et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.</li>
	<li>Passez à l’étape suivante lorsque la viabilité cellulaire est supérieure à 70 %. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 130 x g pendant 4 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le PRDM à la concentration de 3 x 105 cellules/μL pour la transplantation.</li>
	<li>Observez les amas de cellules visibles. Remettre en suspension les amas cellulaires à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL dans le tube du microfuge jusqu’à ce qu’aucun amas cellulaire visible ne soit observé. Chargez dans la seringue d’injection 33G pour observer l’extrusion de la solution cellulaire à travers l’aiguille.</li>
</ol>2. Délivrance sous-rétinienne des hESCs chez les souris rd10
<ol><li>Préparation des animaux<ol><li>Anesthésier la souris (P20, mâle/femelle, 3-6 g) à l’aide d’une combinaison de kétamine (20 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (2 mg/kg de poids corporel) dans une seringue de tuberculine de 1 mL fixée à une aiguille 27G par voie intrapéritonéale. Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) à la souris comme analgésique préventif.</li>
		<li>Après l’administration de l’anesthésie, instiller une goutte de 1 % de tropicamide et de 2,5 % de phényléphrine pour la dilatation de la pupille. Appliquez un gel ophtalmique sur la cornée pour prévenir la sécheresse oculaire et la cataracte liée à l’anesthésie.</li>
		<li>Placez la souris dans une cage vide jusqu’à ce qu’elle soit complètement anesthésiée. Évaluez le niveau d’anesthésie approprié en pinçant le coussinet et confirmez si l’animal ne réagit pas au pincement dur.</li>
		<li>Lorsque la souris est complètement anesthésiée, placez l’animal sur un tampon chaud réglé à 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Délivrance sous-rétinienne des cellules<ol><li>Pour utiliser une approche pars plana trans-vitréenne à 1 port, comme c’est le cas ici, effectuer une injection sous-rétinienne dans un environnement stérile. Utilisez un microscope opératoire vertical avec un trajet de lumière directe pour effectuer l’injection.</li>
		<li>Préparez la seringue en verre de 10 μL en retirant l’embout de l’aiguille. Montez l’aiguille émoussée 33G sur la seringue en verre. Prenez le couvercle du moyeu métallique et fixez soigneusement l’aiguille sur la seringue.</li>
		<li>Rincez à l’eau distillée pour vérifier s’il y a des signes de fuite et de perméabilité de l’aiguille. Videz la seringue et placez-la sur le côté avec précaution.</li>
		<li>Placez la souris anesthésiée sur un oreiller, l’œil de traitement regardant directement vers l’objectif du microscope. Appliquez le chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % et attendez 30 s. Appliquez 150 μL de gel ophtalmique sur l’œil et placez une lamelle ronde dessus.</li>
		<li>Effectuez un examen approximatif de l’œil en observant la cornée, l’iris, la pupille, le cristallin et la conjonctive. À travers la pupille, visualisez le fond d’œil de la souris en ajustant le plan focal. Ajustez la tête jusqu’à ce que la tête optique soit positionnée au centre de la pupille et minimisez le mouvement de la tête en la positionnant correctement sur l’oreiller.</li>
		<li>Tapotez doucement la base du tube avec les hESC plusieurs fois pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. À l’aide de la seringue de microlitres en verre de 10 μL avec une aiguille émoussée de 33 G, prélever 2 μL de cellules/milieux. Prélever les cellules juste avant l’injection pour éviter que les cellules ne s’agglutinent/ne s’agglutinent dans la seringue.</li>
		<li>À l’aide d’une aiguille jetable de 30 G, faites une plaie de sclérectomie à 2 mm derrière le limbe. Maintenez l’angle de l’aiguille à ~45° pour éviter de toucher la lentille. Une fois que la pointe de l’aiguille est visualisée dans le chas de l’aiguille, retirez délicatement l’aiguille. Jetez l’aiguille dans le bac pointu après utilisation pour éviter les blessures par piqûre d’aiguille.</li>
		<li>Prenez la seringue en verre et insérez l’aiguille émoussée dans la plaie de sclérectomie. Sans toucher la lentille, faites avancer l’aiguille émoussée jusqu’à ce qu’elle atteigne la rétine opposée à la plaie d’entrée. Assurez-vous que la zone d’injection est dégagée des principaux vaisseaux sanguins de la rétine pour éviter les saignements.</li>
		<li>Pénétrez doucement dans la rétine jusqu’à ce qu’une branche de pression sur la sclérotique soit visible. Gardez l’extrémité émoussée de l’aiguille parallèle à la sclérotique pour éviter la fuite des cellules dans l’espace vitré.</li>
		<li>Injecter lentement 2 μL de suspension cellulaire ou de milieu PRDM (témoin) dans l’espace sous-rétinien tout en maintenant une légère pression sur la seringue. Lors d’une injection réussie, une tache visible (c’est-à-dire une rétine surélevée avec la suspension cellulaire ou le milieu à l’intérieur) devrait se former au site d’injection. REMARQUE : Seule une légère pression doit être utilisée pendant l’injection pour éviter la déchirure de la rétine et le blocage des cellules à l’extrémité de l’aiguille.</li>
		<li>Après avoir confirmé la tache, attendez 10 s pour laisser les cellules se déposer. Rétractez doucement l’aiguille de l’œil.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomographie par cohérence optique peropératoire (OCT) de la bulle (facultatif)<ol><li>Positionnez l’œil de la souris pour visualiser la tache au microscope en déplaçant lentement la tête. Fixez la position en tenant doucement la tête. Aucune dilatation supplémentaire de la pupille n’est nécessaire. Ne retirez pas la lamelle et le gel sur l’œil. Il donne un support optique clair pour visualiser la bleb.</li>
		<li>Effectuez l’OCT peropératoire à l’aide de la fonction iOCT intégrée du microscope opératoire.</li>
		<li>Appuyez sur l’option Cube sur l’écran OCT et positionnez la zone de numérisation sur le bleb en appuyant sur les boutons fléchés . Ajustez l’OCT en faisant glisser Centrage et Mise au point pour obtenir la meilleure qualité d’OCT. Appuyez sur Capture/Scan pour obtenir le scan OCT de la zone de bleb. Examinez les images pour vérifier la qualité des numérisations.</li>
	</ol></li>
	<li>Récupération<ol><li>Retirez la lamelle et nettoyez le gel de l’œil avec de la gaze. Appliquez une pommade antibiotique une fois après l’injection pour prévenir l’infection.</li>
		<li>Laissez l’animal se remettre de l’anesthésie sous une lumière chaude jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir sa position couchée sternale et retourner dans sa cage d’origine. Surveillez l’animal pendant au moins 3 jours après l’injection pour détecter des signes d’inflammation, d’infection et de détresse. REMARQUE : La lumière chaude de 150 W doit être à au moins 30 cm de la cage de l’animal et des précautions doivent être prises pour éviter une brûlure.</li>
		<li>Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) 8 heures pendant 1 jour ou selon les recommandations du vétérinaire. Si une inflammation ou une infection de l’œil est observée, consultez un professionnel vétérinaire pour un traitement approprié.</li>
	</ol></li>
	<li>Nettoyage et stérilisation des instruments<ol><li>Rincez la seringue microlitre en verre de 10 μL et l’aiguille émoussée 33G avec 100 % éthanol 10x. Lavez l’éthanol en flashant la seringue avec de l’eau distillée.</li>
		<li>Démontez la seringue en verre et l’aiguille. Séchez la seringue pour la ranger.</li>
	</ol></li>
</ol>

Revitaliser la vue : la thérapie par cellules souches pour la dégénérescence rétinienne

Hwee Goon Tay est cofondateur d’Alder Therapeutics AB. D’autres auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

L’injection sous-rétinienne a été utilisée pour la transplantation de suspension cellulaire pour traiter l’EPR et les maladies de la rétine 23,25,26,27,28,31,40. Cette approche est très essentielle dans les études sur les rongeurs, non seulement pour les approches de transplantation cellulai...

Les maladies héréditaires de la rétine et la dégénérescence maculaire liée à l’âge entraînent une perte de cellules photoréceptrices et éventuellement la cécité. Le photorécepteur rétinien est la couche du segment externe de la rétine composée de cellules spécialisées responsables de la phototransduction (c’est-à-dire la conversion de la lumière en signaux neuronaux). Les cellules photoréceptrices en bâtonnets et en cônes sont adjacentes à la couche pigmentée rétinienne (EPR)1. La thérapie de remplacement des cellules photoréceptrices pour compenser la perte cellulaire est une approche thérapeutique émergente et en développement. Des cellules souches embryonnaires (CSE)2,3,4, des cellules RPE dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et des cellules progénitrices de la rétine (CPR)4,5,6,7,8 ont été utilisées pour restaurer les cellules photoréceptrices endommagées. L’espace sous-rétinien, un espace confiné entre la rétine et l’EPR, est un endroit attrayant pour déposer ces cellules afin de remplacer les cellules photoréceptrices endommagées, l’EPR et les cellules de Mueller en raison de sa proximité 9,10,11.
Les thérapies géniques et cellulaires ont utilisé l’espace sous-rétinien pour la médecine régénérative pour diverses maladies de la rétine dans le cadre d’études précliniques. Cela comprend la livraison de copies fonctionnelles du gène ou d’outils d’édition de gènes sous la forme d’une thérapie oligonucléotidique anti-sens12,13 ou CRISPR/Cas9 ou de l’édition de bases via une stratégie basée sur le virus adéno-associé (AAV) 14,15,16, l’implantation de matériaux (par exemple, feuille RPE, prothèses rétiniennes 17,18,19) et d’organoïdes rétiniens différenciés dérivés de cellules souches 20,21,22 pour traiter les maladies de la rétine et les maladies liées à l’EPR. Essais cliniques utilisant hESC-RPE31 dans l’espace sous-rétinien pour traiter l’amaurose congénitale (ACL) de Leber associée à RPE6523,24, l’achromatopsie liée à CNGA325, la rétinite pigmentaire associée à MERTK26, la choroïdérémie 27,28,29,30 se sont avérés être une approche efficace. L’injection directe de cellules à proximité de la zone endommagée améliore considérablement les chances de règlement des cellules dans la région appropriée, l’intégration synaptique et l’amélioration visuelle éventuelle.
Même si l’injection sous-rétinienne dans des modèles humains et à grands yeux (c’est-à-dire le porc32, 33, 34, 35, le lapin36, 37, 38, 39, 40 et le primate non humain41, 42, 43) a été établie, une telle injection dans le modèle murin est toujours difficile en raison de la contrainte de la taille du globe oculaire et de l’énorme lentille occupant l’œil de la souris 44,45,46. Cependant, les modèles génétiquement modifiés ne sont facilement disponibles que chez les petits animaux et non chez les grands animaux (c’est-à-dire les lapins et les primates non humains), c’est pourquoi l’injection sous-rétinienne chez la souris attire l’attention sur l’étude de nouvelles approches thérapeutiques dans les maladies génétiques rétiniennes. Trois approches principales sont utilisées pour délivrer des cellules ou des AAV dans l’espace sous-rétinien, à savoir la voie transcornéenne, la voie trans-sclérale et la voie de la pars plana (voir la figure 2). Les voies transcornéennes et transsclérales sont associées à la formation de cataracte, aux synéchies, aux saignements choroïdiens et au reflux du site d’injection 11,44,45,47,48,49. Nous avons adopté l’approche pars plana comme visualisation directe du processus d’injection, et le site d’injection peut être réalisé en temps réel au microscope.
Nous avons récemment décrit une méthode qui permet de différencier les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en progéniteurs photorécepteurs dans des conditions chimiquement définies sans xéno, en utilisant l’isoforme LN523 de laminine humaine recombinante spécifique à la rétine. Étant donné que LN523 s’est avéré être présent dans la rétine, nous avons émis l’hypothèse que la niche de la matrice extracellulaire de la rétine humaine pourrait être récapitulée in vitro et ainsi soutenir la différenciation des photorécepteurs à partir des hESCs36. L’analyse transcriptomique unicellulaire a montré que les progéniteurs photorécepteurs co-exprimant l’homéobox cône-bâtonnet et la récupérine ont été générés après 32 jours. Un modèle murin mutant de dégénérescence rétinienne 10 (rd10) qui imite la rétinite pigmentaire humaine autosomique a été utilisé pour évaluer l’efficacité des progéniteurs photorécepteurs dérivés de hESC au jour 32 in vivo. Les cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC ont été injectées dans l’espace sous-rétinien de souris rd10 à P20, où le dysfonctionnement et la dégénérescence des photorécepteurs sont en cours36. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation des progéniteurs photorécepteurs dérivés de hESC post-cryoconservés et leur livraison dans l’espace sous-rétinien des souris rd10 . Cette méthode peut également être utilisée pour administrer des AAV, des suspensions cellulaires, des peptides ou des produits chimiques dans l’espace sous-rétinien chez la souris.

<table><tbody><tr><td>0,3 % Tobramycine</td><td>Novartis</td><td>NDC &nbsp ; 0078-0813-01</td><td>Tobrex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,3 % de tobramycine et 0,1 % de dexaméthasone</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,5 % de chlorhydrate de proparacaïne</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0,5 % d’alcaïne (15 mL)</td></tr><tr><td>1 mL seringue à tuberculine</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1 % de tropicamide</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1 % de mydriacyle (15 mL)</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de phényléphrine à 2,5 %</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>Mydfrin à 2,5 % (5 mL)</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Aiguille jetable</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, longueur 20 mm Aiguilles émoussées</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>NanoEnTek</td><td>Modèle : Eve</td><td></td></tr><tr><td>B27 sans vitamine A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2 %36</td></tr><tr><td>buprénorphine</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic vet (0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &micro ; M36</td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L dans l’eau potable</td></tr><tr><td>Jour 32 Cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC</td><td>DUKE-NUS Medical School</td><td></td> Les <td>cellules souches embryonnaires humaines sont différenciées pendant 32 jours. Voir protocole dans la Réf 36.</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Winner Industries Co. Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essentiel Moyen</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash ; 035</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire hESC H1</td><td>Institut de recherche WiCell</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé du cerveau humain (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique ciliaire humain (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute ; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 & micro ; g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Seringue en verre d’un microlitre (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorophénacétyl-L-alanyl)]-S-phénylglycine t-butyl ester (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &micro ; M36</td></tr><tr><td>N-2 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1 %36</sup</td></tr><tr><td>>acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash ; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope opératoire</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>avec fonction iOCT intégrée</td></tr><tr><td>PRDM (milieu de différenciation des photorécepteurs, 50ml)</td><td>DUKE-NUS Medical School</td><td></td><td>Voir la composition du milieu36. Milieu basal, 10 & micro ; M DAPT, 10 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de CNTF, 0,5 et micro ; M Acide rétinoïque, 2 % B27 et 1 % N2. Milieu de base : 1x GMEM, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM de B-mercaptoéthanol, 1x acides aminés non essentiels (NEAA).</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash ; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>B6. souris CXB1-Pde6brd10/J</td><td>Sexe : mâle/femelle, Âge : P20 (injection), Poids : 3-6 g&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0.5 & micro ; M36</td></tr><tr><td>Round Cover Slip (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 &micro ; M36</td></tr><tr><td>Vidisic Gel (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash ; 023</td><td>0,1 mM36</td></tr></tbody></table>

livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

La régénération des cellules photoréceptrices à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines est une thérapie prometteuse pour le traitement des maladies rétiniennes héréditaires et vieillissantes à des stades avancés. Nous avons montré que la matrice isoforme de laminine recombinante spécifique de la rétine humaine est capable de soutenir la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en progéniteurs de photorécepteurs. De plus, l’injection sous-rétinienne de ces cellules a également montré une restauration partielle dans les modèles de rongeurs et de lapins rd10 . L’injection sous-rétinienne est connue pour être une méthode établie qui a été utilisée pour délivrer des composés pharmaceutiques aux cellules photoréceptrices et à la couche épithéliale pigmentée rétinienne (EPR) de l’œil en raison de sa proximité avec l’espace cible. Il a également été utilisé pour délivrer des vecteurs viraux adéno-associés dans l’espace sous-rétinien afin de traiter les maladies rétiniennes. L’administration sous-rétinienne de composés pharmaceutiques et de cellules dans le modèle murin est difficile en raison de la contrainte de la taille du globe oculaire murin. Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la préparation des cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de l’hESC pour injection et la technique d’administration sous-rétinienne de ces cellules chez les souris mutantes de la rétinite pigmentaire génétique, rd10 . Cette approche permet d’opérer une thérapie cellulaire dans la zone ciblée, en particulier dans la couche nucléaire externe de la rétine, où se produisent les maladies conduisant à la dégénérescence des photorécepteurs.

La seringue en verre de 10 μL a été assemblée conformément aux instructions du fabricant (figure 1), et l’aiguille émoussée utilisée pour administrer la suspension cellulaire ou le milieu est illustrée à la figure 1B. Différentes approches pour l’injection sous-rétinienne sont illustrées à la figure 2. Nous décrivons l’approche pars plana dans ce protocole (Figure 2C). L’aiguille émoussée montée sur une...

Nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC post-cryopréservées et l’administration sous-rétinienne de ces cellules chez des souris rd10 .

Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Mes recherches portent sur le développement d’une thérapie à base de cellules souches pour les stades avancés des maladies de la rétine qui causent la dégénérescence des photorécepteurs. L’objectif de notre recherche est de remplacer la perte de photorécepteurs chez les patients par des progéniteurs photorécepteurs cliniquement sûrs et fonctionnels dans le but d’améliorer leur acuité visuelle ou même de restaurer leur vision. Le principal modèle préclinique est celui des souris, mais leur globe oculaire de petite taille rend difficile l’injection de matériaux, en particulier sous la rétine.Développer les compétences nécessaires pour effectuer des injections sous-rétiniennes réussies nécessite de la patience et de la persévérance. Nous avons développé avec succès une base de laminine pour la méthode de différenciation des récepteurs qui est capable de générer des progéniteurs de photorécepteurs en 32 jours. Les transplantations sous-rétiniennes de suspensions cellulaires de ces progéniteurs de photorécepteurs chez les rongeurs ont entraîné une connectivité synaptique entre les trous et la greffe dans les yeux.Cela a conduit à une restauration visuelle partielle. Notre approche est simple, la bonne visualisation aide le chirurgien à manipuler l’aiguille jusqu’à la zone d’intérêt.

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Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

Nous présentons ici un protocole accepté par la communauté en format multimédia pour l’injection sous-rétinienne d’un bolus de cellules EPR chez le rat et la souris. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les potentiels de sauvetage, les profils d’innocuité et les capacités de survie des cellules EPR greffées lors de l’implantation dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Injection sous-rétinienne a été largement appliquée dans les études précliniques de thérapie de remplacement de cellules souches pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Dans cet article visualisé, nous décrivons une technique d’injection sous-rétinienne moins risqués, reproductibles et précisément modifiés via l’approche trans-sclérale pour livrer des cellules dans les yeux de rat.

Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal est présentée ici.

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Ce protocole présente une approche trans-sclérale guidée par la vision transpupillaire pour administrer en toute sécurité et avec précision des greffons cellulaires sous-rétiniens, avec un faible taux de complications chirurgicales, chez des souris receveuses avec ou sans dégénérescence rétinienne.

Transplantation transsclérale guidée par voie transpupillaire de greffons sous-rétiniens dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne

Une méthode est décrite pour propager les tumeurs humaines chez la souris rétinoblastome. Les cellules tumorales sont injectées directement dans les yeux du système immunitaire chez les souris déficientes. Tumeurs secondaires ont été établies avec succès en utilisant les deux cellules directement récoltées à partir de tumeurs humaines et tumorspheres cultivés.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Nous démontrons comment mettre en place...

Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d&#39;ischémie / reperfusion modèle

Découvrez la préparation de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines et leur injection sous-rétinienne chez des souris rd10. Cette méthode permet d'étudier les thérapies cellulaires pour restaurer la vision.

Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10 (Vidéo) | JoVE Journal

Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10

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