Name: Multi-paramètres de mesure de louverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Apprenez à mesurer l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le cœur de souris. Cette méthode spectrofluorométrique évalue simultanément le calcium, le potentiel membranaire et le volume mitochondrial.

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1. Isolement des mitochondries de cœur de souris <ol><li> Pour isoler les mitochondries cardiaques, anesthésier et le sacrifice des souris, selon les procédures en vigueur de protection des animaux et du Comité institutionnel locale utilisation. </li></ol> Remarque: Toutes les étapes du protocole d&#39;isolement des mitochondries doivent être effectuées sur la glace. Utiliser des tampons glacées et pré-réfrigérés boîtes de Pétri, tubes et tubes Falcon Eppendorf. Les volumes indiqués dans le protocole sont pour un échantillon contenant 2 coeurs de souris. <ol start="2"><li> Retirez les cœurs, les placer dans le tampon d&#39;isolation froid mitochondries (300 mM de saccharose, 10 mM de Na-HEPES, 200 pM d&#39;EDTA, pH 7,4) et rincer le sang. </li></ol> Note: Pour des résultats optimaux, le pH des tampons mitochondriales doit être ajusté avec KOH et l&#39;acide acétique. <ol start="3"><li> Placer les coeurs sur un plat froid Petri, enlever la graisse et les oreillettes, et émincer finement à l&#39;aide d&#39;une lame jusqu&#39;à obtenirtion d&#39;un produit homogène. </li><li> Transfert cœur hachées dans un tube Falcon de 50 ml, ajouter 10 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec 0,1 mg / ml de trypsine et de permettre à l&#39;échantillon à digérer sur la glace pendant 10 min. </li></ol> Remarque: La trypsine pendant la procédure d&#39;isolement augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales. Nous recommandons de tester les fonctions mitochondriales sur les préparations isolées, c&#39;est l&#39;absence de trypsine afin de s&#39;assurer que l&#39;enzyme ne pas interférer avec la fonctionnalité. <ol start="5"><li> Ajouter 10 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec 0,1% d&#39;acides gras libres BSA et 5 mg d&#39;inhibiteur de trypsine (soja) et mélanger par inversion fois le tube plusieurs pour neutraliser la trypsine. </li></ol> Remarque: tampon d&#39;isolement mitochondries peuvent être préparés à l&#39;avance et peuvent être conservés à -20 ° C. Vérifier le pH lors de la décongélation. Trypsine, inhibiteur de la trypsine ou de BSA doit être undded dans le tampon d&#39;isolement Mitochondries le jour de l&#39;expérience. <ol start="6"><li> Récupérez le tissu digéré par centrifugation à faible vitesse et à moyen pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Tissus Resuspendre dans 8 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec des acides gras libres 0,1% de BSA et homogénéiser à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur Dounce motorisé avec un pilon en téflon (4-6 passes à 1,200-14,00 rpm). Conserver l&#39;échantillon sur la glace tout en homogénéisant. </li><li> Transfert homogénat dans un tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 800xg pendant 10 min à 4 ° C à noyaux granulés et les débris de tissu. </li><li> Récupérer le surnageant contenant les mitochondries dans des tubes Eppendorf et centrifuger à 8000 xg pendant 15 min, à 4 ° C. </li><li> Retirez soigneusement la couche supérieure blanche et laver le culot contenant plus sombre restant de la mitochondrie dans 1 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries. </li><li> Centrifuger à 8000xg pendant 15 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans la mitochondrie 150 pi Isola mitochondrialtion tampon. Gardez mitochondries sur la glace pour d&#39;autres essais. </li></ol> Remarque: Pour obtenir de meilleurs résultats lors des tests fonctionnels, utiliser des mitochondries dans les 4 heures de l&#39;isolement. <ol start="12"><li> Quantifier les protéines mitochondriales en utilisant le dosage de Bradford. </li></ol> 2. Contrôle de la qualité des mitochondries isolées 2,1. Mesure du rapport de contrôle respiratoire (RCR) <ol><li> Étalonner l&#39;électrode à oxygène avec Oxytherm eau saturée d&#39;air pour établir la conduite d&#39;oxygène maximale. Quand un niveau stable d&#39;oxygène est obtenue, ajouter 100 ul d&#39;une solution fraîchement préparée une solution à 10 mM de sodium hydrosulfite de mettre en place la ligne zéro oxygène. Effectuer des mesures à 30 ° C. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon de respiration mitochondries (125 mM de KCl, 20 mM d&#39;HEPES, MgCl2 3 mM, EGTA 400 uM, 300 uM DTT 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) avec 1 uM roténone à la chambre Oxytherm, sceller la chambre et enre débutding. </li><li> Lorsque le signal d&#39;oxygène est stable, ajouter 250 mg mitochondries et enregistrer la respiration basale pendant 1 min. La respiration à ce point devrait être très faible, comme les mitochondries sont respirants sur des substrats endogènes (respiration Etat 1). </li><li> Ajouter 5 mM de succinate et de signal d&#39;enregistrement pendant 1 min. La consommation d&#39;oxygène devrait augmenter au cours de la respiration Etat 2. </li><li> Induire la respiration État 3 par addition de 150 uM d&#39;ADP. A ce point de la consommation d&#39;oxygène devraient augmenter en raison de la synthèse d&#39;ATP par phosphorylation oxydative. Signal d&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce que la respiration ralentit, ce qui indique la consommation d&#39;ADP et la transition vers l&#39;état 4 respiration. Etat disque 4 respiration pendant au moins 1 min. </li><li> Ajouter 1 CCCP uM et signal d&#39;enregistrement pendant 1 min. Respiration découplée doit être maximale. </li></ol> Remarque: L&#39;effet de CCCP sur la respiration mitochondriale est dose-dépendante: des concentrations élevées de CCCP peut inhiber la consommation d&#39;oxygène et doivent donc être soigneusement titrated. <ol start="7"><li> Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant le taux de consommation d&#39;oxygène lors de la respiration État 3 par le taux de consommation d&#39;oxygène pendant la respiration État 4. Un RCR cible doit être ≥ 4. </li></ol> 2,2. Évaluation de l&#39;intégrité membranaire mitochondrial (cytochrome c test) <ol><li> Laver soigneusement la chambre Oxytherm avec de l&#39;éthanol à 70% et à l&#39;eau et répétez les étapes 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Ajouter 1 mM d&#39;ADP et de la consommation d&#39;oxygène record de 1 min. </li><li> Ajouter 10 uM cytochrome c. Depuis le cytochrome c est imperméable à l&#39;intactes les membranes mitochondriales, une augmentation de la respiration indique cassés ou endommagés membranes mitochondriales. </li></ol> 3. La mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale <ol><li> Configurez le spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l&#39;ouverture mtPTP. Utilisation du programme FelixGx, créer une nouvelle configuration matérielle (Quanta maître sta stablete) comprenant la source de lumière, monochromateur d&#39;excitation, un compartiment d&#39;échantillon et deux détecteurs positionnés à 90 ° et 270 ° par rapport à la monochromateur d&#39;excitation (Figure 4). Pour obtenir une résolution maximale de temps, les deux monochromateurs d&#39;émission (90 ° et 270 °) doit être désactivé et les filtres d&#39;émission à 90 ° et 270 ° dans le compartiment échantillon activé dans le menu de configuration matérielle. Cette étape permet de supprimer le contrôle moteur des longueurs d&#39;onde d&#39;émission et de fixer chaque monochromateur à une longueur d&#39;onde particulière. Si les monochromateurs d&#39;émission ne sont pas désactivés, chaque détecteur de cycle entre deux longueurs d&#39;onde et des mesures en double seront enregistrées. </li><li> Créer un protocole d&#39;acquisition à l&#39;aide du type Multi Dye et entrez les colorants suivants: <ul><li> Fura (haute Ca + +): excitation 340 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> Fura (faible teneur en Ca + +): excitation 380 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> JC1 (total): excitation 543 nm, Émission 595 nm (détecteur 2) </li><li> JC1 (monomère): excitation 498 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> Gonflement: excitation 525 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li></ul></li><li> Définissez les fentes d&#39;excitation et d&#39;émission à 1 nm et la température à 37 ° C. </li><li> Pour obtenir le signal ratiométrique pour Fura et JC-1, de générer deux traces dérivés: Fura (haute Ca + +) / Fura (faible teneur en Ca + +) et JC1 (total) / JC1 (monomère). </li><li> Ajuster manuellement la longueur d&#39;onde d&#39;émission de détecteurs 1 et 2 à 525 nm et 595 nm, respectivement. </li><li> Mélanger 1 ml du tampon de dosage mitochondries (120 mM de KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) avec 1 uM roténone, 5 mM de succinate et 800 nM Fura FF dans un jetable 4-faces le méthacrylate de cuvette. Ajouter un échantillon de 250 mg mitochondries et les placer dans le compartiment échantillon. Assurez-vous que l&#39;agitateur magnétique est activé. </li><li> Démarrez l&#39;enregistrement. Après 1 min, mettre en pause l&#39;acquisition, ajouter 500 nM JC-1, puis redémarrez l&#39;unecquisition. Le signal de JC-1 ratio devrait augmenter, indiquant absorption du colorant par les mitochondries actif. L&#39;enregistrement jusqu&#39;à JC-1 signal a atteint un plateau (généralement moins de 5 minutes). </li><li> Ajouter 20 uM CaCl 2. Une augmentation instantanée du signal Fura rapport FF doit être observé par l&#39;augmentation de Ca 2 + dans la présence du tampon de dosage, suivie d&#39;une diminution progressive due à mitochondriale de Ca 2 + absorption. Le signal de JC-1 ratio devrait présenter une diminution transitoire brève indicatif de dépolarisation de la membrane mitochondriale légère. </li><li> Attendre le retour de signal FF Fura rapport au niveau de base avant l&#39;addition d&#39;une autre impulsion CaCl 2 (1-1.5 min). Continuer impulsions à intervalles fixes jusqu&#39;à ce que les mitochondries ne peuvent pas s&#39;accumuler Ca 2 + et commencent à libérer le Ca 2 + dans le tampon de dosage. ouverture mtPTP est visualisée par une augmentation simultanée du signal Fura rapport FF en raison de la libération de Ca 2 +, une diminution du rapport signal JC-1 en raison de pote membranential effondrement, et une diminution de la diffusion de la lumière due à un gonflement des mitochondries (figure 5). </li><li> Après activation mtPTP, vérifier la spécificité de Fura FF, JC-1 et les signaux de gonflement respectivement avec 1 mM d&#39;EGTA, 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine. </li><li> Pour vérifier la spécificité de l&#39;ouverture mtPTP, répéter les étapes de 3,6 à 3,9 en présence de 1 pM de la cyclosporine A cyclophiline D inhibiteur (cyclophiline D est un composant de la mtPTP). En présence de cyclosporine A, l&#39;ouverture de la mtPTP nécessite beaucoup plus de CaCl 2 impulsions que les échantillons de contrôle (figure 6). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 2 montre un contrôle typique respiratoire des mitochondries isolées cœur de souris. 3 état respiration est réalisé par addition d&#39;ADP à respirant mitochondries de succinate, et se caractérise par une consommation d&#39;oxygène sensiblement augmentée par rapport à la SUBSTRAte seul. L&#39;appauvrissement de l&#39;ADP ajouté État initiés 4 respiration, au cours de laquelle la consommation d&#39;oxygène ralentit et est comparable aux taux obtenus avant l&#39;addition d&#39;ADP. RCR est obtenu en divisant le taux de consommation d&#39;oxygène pour la respiration Etat 3 par celui de la respiration Etat 4. Le test de cytochrome c est utilisé pour doser l&#39;intégrité de la membrane mitochondriale externe: lorsque le cytochrome c est ajouté à la mitochondrie qui respire le succinate et de l&#39;ADP, aucune augmentation de la respiration est observée, indiquant une intactes extérieures membranes mitochondriales (figure 3). Une image représentative de l&#39;ouverture mtPTP dans les mitochondries isolées coeur est représenté sur la figure 4. Dans ce cas, l&#39;ouverture mtPTP a été déclenchée par l&#39;addition de 4 CaCl 2 impulsions (20 uM de chacun) à intervalles de 1,5 min. ouverture mtPTP est évident par la libération simultanée de près mitochondrial Ca 2 + (augmentation du signal Fura rapport FF), l&#39;effondrement de mitochondpotentiel de membrane de rials (diminution de JC-1 rapport signal) et une augmentation du volume mitochondrial (diminution du signal de gonflement). Lorsque la cyclosporine A est ajouté, qui se lie à la composante cyclophiline D de mtPTP, ouverture mtPTP nécessite 7 impulsions de CaCl 2 au lieu de 4 (figure 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du multi-paramètre protocole de transition de perméabilité mitochondriale des pores d&#39;ouverture de cœur mitochondries isolées. Cœur est récoltée à partir des souris et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. La préparation mitochondriale est ensuite évaluée par la mesure qualitative polarographique de la commande de rapport et respiratoire intact membrane mitochondriale en présence de cytochrome c. Mitochondrial ouverture de pore de transition de perméabilité dans les mitochondries isolées est déclenchée par séquentiel CaCl 2 ajouts et est mesurée avec un spectrofluorimètre en surveillant libération de Ca 2 + de l&#39;effondrement membrane des mitochondries, le potentiel et le gonflement de la matrice mitochondriale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figure 2. Mesure d&#39; rapport de contrôle respiratoire (RCR) de coeur mitochondries isolées. La consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées coeur est mesurée au cours de la respiration Etat 3 en présence de succinate et de l&#39;ADP, et pendant 4 Etat respiration après consommation ADP. La réponse de mitochondries isolées de découpleurs est mesuré par l&#39;addition de CCCP. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figure 3. Mesure<html> tion de l&#39;intégrité membranaire des mitochondries isolées de cœur. Intégrité de la membrane mitochondriale est déterminée en mesurant la consommation d&#39;oxygène dans les mitochondries isolées en présence de succinate et de l&#39;ADP et après l&#39;addition de cytochrome c. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figure 4. Configuration matérielle Spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l&#39;ouverture mtPTP. La configuration matérielle du spectrofluorimètre comprend une source lumineuse, un monochromateur d&#39;excitation, un compartiment pour un échantillon et deux détecteurs de longueurs d&#39;onde d&#39;émission fixe à 525 nm et 595 nm. Détecteur 1 est utilisé pour la détection du signal de Fura FF haute et faible teneur en Ca 2 +, JC-1 monomère, et le signal de gonflement. Détecteur 2 mesure le signal JC-1 global. jove_content &quot;fo: keep-together.within pages =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figure 5. Multi-paramètre de mesure de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées. mtPTP ouverture a été déclenchée par additions successives de 20 M CaCl 2 et a été caractérisé par la libération de Ca 2 + par les mitochondries, l&#39;effondrement du potentiel de membrane mitochondriale et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale (gonflement). Extramitochondriale Ca 2 + et le potentiel de membrane ont été mesurées avec des indicateurs ratiométriques Fura FF (vert trace) et JC-1 (rouge trace). Gonflement des mitochondries a été mesurée en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nm (trace noire). Spécificité de JC-1 et les signaux de gonflement a été testé avec 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine (une toxine microbienne). <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figure 6. Multi-Paramètre de mesure de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées en présence de cyclosporine A. cyclosporine A (1 uM) augmente le nombre de CaCl 2 impulsions nécessaires à l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole présenté ici décrit les étapes nécessaires expérimentales pour évaluer ouverture de pore de transition de perméabilité dans le cœur des mitochondries isolées (Figure 1 et Figure 4): la procédure d&#39;isolement de cœur de souris mitochondries, les contrôles des voies respiratoires en assurer l&#39;intégrité et la fonctionnalité, les paramètres mitochondriaux surveillés pendant ouverture mtPTP et les colorants utilisés pour leur évaluation, la mise en place de l&#39;instrume...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Hydrosulfite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> La roténone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochrome c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alaméthicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Broyeur de tissu Potter-Elvehjem de Téflon pilon 15 ml </td><td> Industries Wheaton </td><td></td></tr><tr><td> Agitateur à hélice </td><td> Industries Wheaton </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (électrode à oxygène à température contrôlée) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 spectrofluorimètre double émission </td><td> Photon Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le cœur de souris mitochondries isolées

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mtPTP) est un canal non spécifique qui se forme dans la membrane mitochondriale interne pour transporter les solutés de masse moléculaire inférieure à 1,5 kDa. Bien que l&#39;identité définitive moléculaire du pore est encore en débat, des protéines telles que la cyclophiline D, VDAC et ANT contribuer à mtPTP formation. Alors que la participation de l&#39;ouverture mtPTP dans la mort cellulaire est bien établi 1, l&#39;accumulation de preuves indique que le mtPTP joue un rôle physiologique pendant mitochondrial homéostasie du Ca 2 + 2, la bioénergétique et de signalisation redox 3. mtPTP ouverture est déclenchée par la matrice Ca 2 +, mais son activité peut être modulée par de nombreux autres facteurs tels que le stress oxydatif, l&#39;adénine nucléotide épuisement, de fortes concentrations de Pi, dépolarisation de la membrane mitochondriale ou de désaccouplement, et les acides gras à longue chaîne 4. In vitro, mtPTP l&#39;ouverture peut être achieved en augmentant la concentration de Ca + 2 à l&#39;intérieur de la matrice mitochondriale par des ajouts exogènes de Ca 2 + (capacité de rétention de calcium). Lorsque les niveaux de Ca 2 + à l&#39;intérieur des mitochondries atteindre un certain seuil, la mtPTP ouvre et facilite libération de Ca 2 +, la dissipation de la force proton motrice, l&#39;effondrement du potentiel de membrane et une augmentation de volume de la matrice mitochondriale (gonflement) qui conduit finalement à la rupture de la la membrane externe mitochondriale et la perte irréversible de la fonction des organites. Nous décrivons ici un essai fluorimétrique qui permet une caractérisation complète de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur de souris mitochondries isolées. Le test consiste à mesurer simultanément les 3 paramètres mitochondriaux qui sont modifiés lors de l&#39;ouverture se produit mtPTP: mitochondrial Ca 2 + (absorption et de libération, telle que mesurée par la concentration de Ca 2 + dans le milieu d&#39;essai), le potentiel de membrane mitochondriale, et mitochole volume ndrial. Les colorants utilisés pour la mesure de Ca 2 + dans le milieu d&#39;essai et le potentiel de membrane mitochondrial sont Fura FF, une membrane imperméant, indicateur logométrique qui subit un changement de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation en présence de Ca 2 +, et JC-1, cationique, Indicateur ratiométrique qui forme monomères verts ou rouges agrégats au potentiel de membrane haute et basse, respectivement. Les variations de volume mitochondrial sont mesurées par diffusion de la lumière par l&#39;enregistrement de la suspension mitochondriale. Depuis de haute qualité, les mitochondries fonctionnelles sont nécessaires pour l&#39;essai d&#39;ouverture mtPTP, nous décrivons également les mesures nécessaires pour obtenir intacte, le cœur fortement couplé et fonctionnelles des mitochondries isolées.

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l&#39;ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manipulation, le volume potentiel de la membrane mitochondriale et mitochondrial. La procédure pour l&#39;obtention de coeur et de grande qualité fonctionnelle des mitochondries est également décrit.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mtPTP) est un canal non spécifique qui se forme dans la membrane mitochondriale interne pour transporter des solutés avec...

L'objectif de cette vidéo est de décrire une procédure permettant de caractériser la transition de perméabilité mitochondriale. Mauvaise ouverture des mitochondries, isolées du cœur de souris. Premièrement, les mitochondries sont isolées à partir de cœurs de souris.À l'aide de la méthode de centrifugation différentielle, la qualité des mitochondries isolées est ensuite évaluée à l'aide d'une électrode d'oxygène thermique reliée à un ordinateur afin de mesurer le rapport de contrôle respiratoire et d'évaluer l'intégrité de la membrane mitochondriale. Ensuite, à l'aide d'un appareil spectrofluorométrique, la mesure simultanée de la gestion du calcium, du potentiel de membrane mitochondriale et du volume mitochondrial est utilisée pour déterminer la transition de perméabilité. Ouverture insuffisante.Les données obtenues ont révélé des différences dans la capacité de rétention du calcium et dans la transition de perméabilité mitochondriale. Faible sensibilité des mitochondries isolées, ouverture de la transition de perméabilité mitochondriale. L'ouverture du pore est un phénomène complexe qui implique des modifications à plusieurs niveaux de la physiologie et de l'anatomie mitochondriales.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la mesure simultanée de plusieurs paramètres offre une image plus complète du phénomène que la mesure individuelle de paramètres isolés, tels que le calcium, la mobilisation ou le gonflement. Avant de commencer la procédure, décongeler le tampon d'isolement mitochondrial et vérifier le pH, qui doit être de 7,4. Ensuite, placer tous les tampons, boîtes et tubes qui seront utilisés sur de la glace. Noter que toutes les étapes du protocole d'isolement des mitochondries doivent être effectuées sur de la glace.Placer les cœurs de souris euthanasiées dans une boîte de Pétri et rincer tout sang avec du tampon de lyse mitochondriale froid. Ensuite, transférer les cœurs dans une nouvelle boîte de Pétri à l’aide d’une lame, retirer la graisse et les oreillettes, puis hacher finement les cœurs jusqu’à obtention d’un produit homogène.Transférez les cœurs hachés dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 milligramme par millilitre de trypsine, et laissez le prélèvement digérer sur de la glace pendant 10 minutes. Notez que l'utilisation de la trypsine augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales.Cependant, nous recommandons de tester la fonctionnalité des mitochondries isolées sur des préparations obtenues en l'absence de trypsine afin de s'assurer que l'enzyme n'interfère pas avec leurs ions. Après l'incubation, ajouter 10 millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 % de BS, a, libre d'acides gras, et cinq milligrammes d'inhibiteur de la trypsine, puis mélanger en retournant le tube plusieurs fois pour neutraliser la trypsine. Récupérer le tissu digéré par une centrifugation de faible à moyenne vitesse pendant une minute à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, resuspendre le tissu dans huit millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 % de BSA sans acides gras, en gardant l'échantillon sur de la glace. Utiliser un homogénéisateur motorisé avec un pilon en téflon pour homogénéiser l'échantillon en quatre à six passages à 1 200-1 400 tr/min. Transférer l'homogénat dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 800 × g pendant 10 minutes à 4 °C.Pour faire précipiter les noyaux et les débris tissulaires. Après la centrifugation, récupérer le surnageant contenant les mitochondries dans des tubes de microcentrifugeuse et les centrifuger à 8 000 × g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, le culot présentera une couche blanche à sa surface.Utilisez un système sous vide pour aspirer et retirer soigneusement la couche blanche située au-dessus du culot mitochondrial. Ensuite, resuspendez à nouveau le culot plus foncé restant, qui contient les mitochondries, dans un millilitre de tampon d'isolement des mitochondries.Ensuite, centrifuger les mitochondries à 8 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot mitochondrial dans 150 microlitres de tampon d'isolement des mitochondries. Conserver les mitochondries sur de la glace.La respiration de mitochondries isolées est mesurée à l'aide d'une électrode à oxygène thermique reliée à un ordinateur et contrôlée par le logiciel oxy. Le logiciel plus exige que l'électrode à oxygène soit étalonnée le jour de l'expérience. Ajoutez deux millilitres de tampon de respiration mitochondrial contenant une concentration finale d'une micromolaire de rotenone dans la chambre de l'oxy, scellez la chambre et commencez l'enregistrement du signal d'oxygène.Le signal enregistré par le système et affiché sur l'écran de l'ordinateur est proportionnel à la concentration en oxygène dans la chambre oxytherm. Une fois que le signal d'oxygène est stable, ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et enregistrez la respiration basale pendant une minute. À ce stade, la respiration doit être très faible, car les mitochondries utilisent des substrats endogènes.Ceci est la respiration à l'état un. Ajouter du succinate à une concentration finale de cinq millimolaire pour initier la respiration mitochondriale au niveau du complexe deux et enregistrer le signal pendant une minute. La consommation d'oxygène devrait augmenter durant la respiration à l'état deux.Pour induire la respiration à l'état 3, ajoutez un DP à une concentration finale de 150 micromolaire. À ce stade, la consommation d'oxygène devrait augmenter en raison d'une synthèse de TP par phosphorylation oxydative. Enregistrez le signal jusqu'à ce que la respiration ralentisse, indiquant une consommation de DP et une transition vers l'enregistrement de la respiration à l'état 4.État quatre : enregistrez la respiration pendant au moins une minute. Ajoutez du CCCP à une concentration finale de un micromolaire et enregistrez le signal pendant une minute. À ce stade, la respiration découplée devrait être maximale.Calculez le rapport de contrôle respiratoire en divisant la vitesse de consommation d'oxygène durant l'état trois par la vitesse de consommation d'oxygène durant l'état quatre. Un RCR cible doit être supérieur à quatre. Ensuite, pour évaluer l'intégrité de la membrane mitochondriale, induisez la respiration à l'état trois dans un nouvel échantillon de mitochondries en ajoutant un DP à une concentration finale de un millimolaire.Ensuite, enregistrez la consommation d'oxygène pendant une minute, ajoutez du cytochrome C à 10 micromolaire et enregistrez la consommation d'oxygène pendant deux à trois minutes. Étant donné que le cytochrome C ne peut pas traverser les membranes mitochondriales intactes dans une préparation mitochondriale de bonne qualité, il n'y aura aucune augmentation ou seulement une très faible augmentation de la respiration. Une augmentation de la respiration indique des membranes mitochondriales rompues ou endommagées.L'instrumentation pour la mesure multiparamétrique de l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale comprend un spectrofluorimètre à double émission Quantum Master, contrôlé par le programme Felix GX. À l'aide du programme Felix GX, créez un protocole d'acquisition multidi et saisissez les paramètres pour la mesure du calcium, du potentiel de membrane mitochondrial et du gonflement pour les colorants ratiométriques, Forer et JC-1 ; générez les tracés dérivés pour le rapport Forer et le rapport JC-1. Dans une cuve jetable en méthacrylate à quatre faces, mélangez un millilitre de tampon d'essai mitochondrial avec une concentration finale d'une micromolaire de roténone, de cinq millimolaires de succinate et de 800 nanomolaires de Fora FF. Ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et placez l'échantillon dans le compartiment d'échantillonnage du spectrofluorimètre.Commencez l'enregistrement des signaux fluorescents après une minute, mettez en pause l'acquisition, ajoutez du JC-1 à 500 nanomolaire, puis redémarrez l'acquisition. Le signal du rapport du JC-1 doit augmenter, indiquant la prise en charge par les mitochondries actives. Poursuivez l'enregistrement jusqu'à ce que le signal du JC-1 ait atteint un plateau.En général, ajouter du chlorure de calcium dans les cinq minutes pour obtenir une concentration finale de 20 micromolaire. Une augmentation instantanée du signal du rapport de Fluor FF doit être observée, indiquant une concentration accrue de calcium dans le tampon d'essai, suivie d'une diminution progressive due à la prise en charge mitochondriale du calcium. Le signal du rapport JC un doit présenter une brève diminution transitoire, signe d'une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.Lorsque le signal du rapport ER FF revient au niveau basal, généralement en une à 1,5 minute avec une autre addition de 20 micromolaire de chlorure de calcium, poursuivez les impulsions à intervalles fixes jusqu'à ce que les mitochondries ne puissent plus accumuler de calcium et commencent à libérer du calcium dans le tampon d'essai. L'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale est visualisée par une augmentation concomitante du signal du rapport URA FF due à la libération de calcium. Une diminution du rapport du signal JC-1 due à l'effondrement du potentiel membranaire et une diminution de la diffusion de la lumière due au gonflement mitochondrial surviennent tout en isolant les mitochondries de souris C57BL/6J.Comme illustré dans cette vidéo, la consommation d'oxygène a ensuite été mesurée durant la respiration à l'état trois en présence de succinate et d'ADP, puis durant la respiration à l'état quatre après la consommation d'ADP. Comme indiqué ici, l'ajout d'ADP augmente la consommation d'oxygène en raison de la phosphorylation oxydative, puis la consommation d'oxygène ralentit. Une fois que tout l'ADP a été consommé, la réponse des mitochondries isolées au découplage est mesurée par l'ajout de CCCP en présence de CCCP. Le taux de consommation d'oxygène est alors plus élevé qu'au cours de la respiration à l'état trois, ce qui permet d'évaluer l'intégrité de la membrane des mitochondries isolées.La consommation d'oxygène a été mesurée en présence de succinate et d'un DP, puis après l'ajout de cytochrome C. Comme on le voit ici, l'ajout de cytochrome C n'augmente pas significativement la consommation d'oxygène par rapport au DP et au succinate, ce qui indique que les membranes mitochondriales intactes ne sont pas perméables au cytochrome C. Ceci permet d'évaluer la transition de perméabilité mitochondriale, ainsi que l'ouverture pauvre des mitochondries isolées du cœur, qui sert d'indicateur de la capacité de rétention du calcium mitochondrial. La transition de perméabilité mitochondriale. L'ouverture pauvre a été déclenchée par des ajouts successifs de 20 micromolaire.Le chlorure de calcium, le calcium extramitochondrial et le potentiel de membrane ont été mesurés à l'aide d'indicateurs ratiométriques. L'URA FF, représentée par la courbe verte, et le JC-1, représenté par la courbe rouge. Le gonflement des mitochondries a été mesuré en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nanomètres, indiquée par la courbe noire. La spécificité des signaux de JC-1 et du gonflement a été testée à l'aide de un micromolaire de CCCP et de cinq microgrammes par millilitre de la toxine microbienne éthin. Comme on peut le voir ici, la prise de calcium par les mitochondries s'accompagne d'une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.Après quatre impulsions calciques, l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale est observée comme une augmentation de la FF d'URA, indiquant une libération de calcium. Une diminution de JC1 indique un effondrement du potentiel membranaire et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale, ce qui se manifeste par une réduction de la diffusion de la lumière en tant que marqueur de gonflement, permettant de vérifier la spécificité de l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Les mêmes mesures ont été réalisées en présence de cyclosporine A, qui se lie au composant cyclophiline D du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Comme le montre cette figure, la présence d'une micromolaire de cyclosporine A augmente le nombre d'impulsions de chlorure de calcium nécessaires pour ouvrir le pore de transition de perméabilité mitochondriale par rapport à l'échantillon témoin.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans des mitochondries cardiaques isolées. L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à obtenir des mitochondries isolées de bonne qualité. Il est donc essentiel de réaliser des mesures de contrôle qualité avant d'utiliser les mitochondries dans des expériences ultérieures.

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