Multi-paramètres de mesure de l'ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

L’objectif de cette vidéo est de décrire une procédure de caractérisation de la transition de perméabilité mitochondriale. Mauvaise ouverture dans les mitochondries, isolée du cœur de souris. Tout d’abord, les mitochondries sont isolées du cœur de souris.

À l’aide de la méthode de centrifugation différentielle, la qualité des mitochondries isolées est ensuite évaluée à l’aide d’une électrode d’oxygène oxythermique connectée à un ordinateur pour mesurer le rapport de contrôle respiratoire et évaluer l’intégrité de la membrane mitochondriale. Ensuite, à l’aide d’instruments spectro fluorométriques, la mesure simultanée de la manipulation du calcium, du potentiel de la membrane mitochondriale et du volume mitochondrial est utilisée pour déterminer la transition de perméabilité. Mauvaise ouverture.

Les données résultantes ont montré des différences dans la capacité de rétention du calcium et la transition de perméabilité mitochondriale. Faible sensibilité des mitochondries isolées, Ouverture de la transition de perméabilité mitochondriale. Les pores sont un phénomène complexe qui implique des changements à plusieurs niveaux de la physiologie et de l’anatomie mitochondriales.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la mesure de plusieurs paramètres en même temps offre une image plus complète du phénomène que la mesure de paramètres individuels seuls, tels que le calcium, la mobilisation ou le gonflement. Avant de commencer l’intervention, décongelez le tampon d’isolement mitochondrial et vérifiez le pH, qui doit être de 7,4. Placez ensuite tous les tampons, plats et tubes qui seront utilisés sur de la glace. Notez que toutes les étapes du protocole d’isolement des mitochondries doivent être effectuées sur glace.

Placez les cœurs de souris euthanasiées sur une boîte de Pétri et rincez le sang avec des mitochondries froides. Tampon d’isolement. Ensuite, transférez les cœurs dans une nouvelle boîte de Pétri à l’aide d’une lame, retirez la graisse et les oreillettes, puis émincez les cœurs jusqu’à l’obtention d’un produit homogène.

Transférer les cœurs hachés dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de tampon d’isolement des mitochondries avec 0,1 milligramme par millilitre de tripsine, et laissez l’échantillon digérer sur de la glace pendant 10 minutes. Notez que l’utilisation de la trypsine augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales.

Cependant, nous recommandons de tester la fonctionnalité des mitochondries isolées sur des préparations obtenues en l’absence de trypsine pour s’assurer que l’enzyme n’interfère pas avec leurs ions. Après l’incubation, ajoutez 10 millilitres de tampon d’isolement des mitochondries contenant 0,1 % d’acides gras sans acides gras, BS, a et cinq milligrammes d’inhibiteur de trypsine et mélangez en inversant le tube plusieurs fois Pour neutraliser la trypsine, récupérez le tissu digéré à vitesse faible à moyenne. Centrifugation pendant une minute de quatre degrés Celsius.

Après le spin Resus, suspendez le tissu dans huit millilitres de tampon d’isolement des mitochondries avec 0,1 % de BSA sans acides gras, en gardant l’échantillon sur de la glace. À l’aide d’un homogénéisateur de danse motorisé muni d’un pilon en téflon, homogénéiser l’échantillon en quatre à six passages à 1 200 à 1 400 tr/min. Transférez l’homogénat dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-le à 800 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Pour granuler les noyaux et les débris tissulaires. Après la rotation, récupérez le supinate contenant les mitochondries dans des microtubes à centrifuger et centrifugez-les à 8 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, le granulé aura une couche blanche sur le dessus.

Utilisez un système d’aspiration pour aspirer et retirer soigneusement la couche blanche sur le dessus de la pastille mitochondriale. Ensuite, remettez en suspension la pastille plus foncée restante, qui contient les mitochondries dans un millilitre de mitochondries. Tampon d’isolement.

Ensuite, centrifugez les mitochondries à 8 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supinate et remettez en suspension la pastille mitochondriale. Dans 150 microlitres de mitochondries, tampon d’isolement, maintenez les mitochondries sur de la glace.

La respiration des mitochondries isolées est mesurée à l’aide d’une électrode d’oxygène oxythermique connectée à un ordinateur et contrôlée par oxy. Le logiciel plus, l’électrode d’oxygène doit être calibrée le jour de l’expérience. Ajoutez deux millilitres de tampon de respiration mitochondriale contenant une concentration finale d’une roténone micromolaire à l’oxy de la chambre, scellez la chambre et commencez à enregistrer le signal d’oxygène.

Le signal enregistré par le système et affiché sur l’écran de l’ordinateur est proportionnel à la concentration d’oxygène dans la chambre oxythermique. Une fois que le signal d’oxygène est stable, ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et enregistrez la respiration basale pendant une minute. La respiration à ce stade doit être très faible car les mitochondries aspirent sur des substrats endogènes.

C’est l’état une respiration. Ajoutez du succinate à une concentration finale de cinq millimolaires pour initier la respiration mitochondriale au complexe deux et enregistrez le signal pendant une minute. La consommation d’oxygène doit augmenter pendant l’état de respiration deux.

Pour induire l’état de respiration, ajoutez un DP à une concentration finale de 150 micromolaires. À ce stade, la consommation d’oxygène devrait augmenter en raison d’une synthèse de TP par phosphorylation oxydative. Enregistrez le signal jusqu’à ce que la respiration ralentisse, indiquant une consommation de DP et passez à l’état quatre de l’enregistrement de la respiration.

État quatre, respiration pendant au moins une minute. Ajoutez CCCP à une concentration finale d’une micromolaire et enregistrez le signal pendant une minute. À ce stade, la respiration découplée doit être maximale.

Calculez le rapport de contrôle respiratoire en divisant le taux de consommation d’oxygène pendant l’état trois. Respiration par le taux de consommation d’oxygène pendant l’état quatre, la respiration un RCR cible doit être supérieure à quatre. Ensuite, pour évaluer l’intégrité de la membrane mitochondriale, induisez la respiration de l’état trois dans un nouvel échantillon de mitochondries en ajoutant un DP à une concentration finale d’un millimolaire.

Ensuite, enregistrez la consommation d’oxygène pendant une minute, ajoutez 10 cytochromes C micromolaires et notez la consommation d’oxygène pendant deux à trois minutes. Étant donné que le cytochrome C est imperméable aux membranes mitochondriales intactes dans une bonne préparation mitochondriale, il n’y aura pas d’augmentation ou une très petite augmentation de la respiration. Une augmentation de la respiration indique des membranes mitochondriales brisées ou endommagées.

L’instrumentation pour la mesure multiparamétrique de l’ouverture du port de transition de perméabilité mitochondriale consiste en un ordinateur de fluorimètre spectro à double émission quantique contrôlé par le programme Felix GX. À l’aide du programme Felix GX, créez un protocole d’acquisition multidi et entrez les paramètres pour la mesure du potentiel de membrane mitochondriale calcique et du gonflement pour le rapport des colorants métriques, Forer et JC one génèrent les traces dérivées pour un rapport et un rapport JC un dans un tampon de dosage de mitochondries de méthamphétamine ACRL vete mix d’un millilitre jetable avec une concentration finale d’une roténone micromolaire, cinq millimolaires de succinate et 800 nanomolaires. Pour un FF, ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et placez l’échantillon dans le compartiment à échantillon du spectrofluorimètre.

Commencez à enregistrer les signaux fluorescents au bout d’une minute, mettez l’acquisition en pause, ajoutez 500 nanomolaires JC un, puis redémarrez l’acquisition. Le signal JC un rapport devrait augmenter, indiquant l’absorption de la matrice par les mitochondries actives. Continuez l’enregistrement jusqu’à ce que le signal JC One ait atteint un plateau.

Habituellement, dans les cinq minutes, ajoutez du chlorure de calcium à une concentration finale de 20 micromolaires. Une augmentation instantanée du signal du rapport Fluor FF doit être observée représentant une présence accrue de calcium dans le tampon de dosage, suivie d’une diminution progressive due à l’absorption mitochondriale de calcium. Le signal JC un rapport doit présenter une brève diminution transitoire indiquant une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.

Lorsque le signal du rapport ER FF revient au niveau basal, généralement dans un délai d’une à 1,5 minute à 20 micromolaires supplémentaires de chlorure de calcium, continuez à pulser à intervalles fixes jusqu’à ce que les mitochondries ne puissent plus accumuler de calcium et commencez à libérer du calcium dans le tampon de dosage. L’ouverture du port de transition de la perméabilité mitochondriale est visualisée par une augmentation simultanée du signal du rapport URA FF due à la libération de calcium. Une diminution du rapport du signal JC un due à l’effondrement du potentiel de membrane et une diminution de la diffusion de la lumière due au gonflement mitochondrial mitochondrial lorsqu’il est isolé de souris C 56 black six J.

Comme le montre cette vidéo, la consommation d’oxygène a ensuite été mesurée pendant l’état de respiration trois en présence de succinate et d’un DP et pendant l’état de respiration quatre après une consommation de DP comme montré ici, un ajout de DP augmente la consommation d’oxygène en raison de la phosphorylation oxydative et la consommation d’oxygène ralentit. Une fois que tout un DP a été consommé, la réponse des mitochondries isolées au découplage est mesurée par l’ajout de CCCP en présence de CCCP. Le taux de consommation d’oxygène est plus élevé que lors de la respiration d’état trois pour évaluer l’intégrité membranaire des mitochondries isolées.

La consommation d’oxygène a été mesurée en présence de succinate et d’un DP et après l’ajout de C.As de cytochrome comme on le voit ici, l’ajout de cytochrome C n’augmente pas significativement la consommation d’oxygène par rapport à un DP et un succinate, indiquant que les membranes mitochondriales intactes ne sont pas perméables au cytochrome C pour évaluer la transition de perméabilité mitochondriale, une mauvaise ouverture dans les mitochondries cardiaques isolées comme indicateur de la capacité de rétention du calcium mitochondrial. Transition de perméabilité mitochondriale. Une mauvaise ouverture a été déclenchée par des ajouts séquentiels de 20 micromolaires.

Le chlorure de calcium, le calcium mitochondrial supplémentaire et le potentiel membranaire ont été mesurés à l’aide des indicateurs métriques de rapport. URA FF représentée par la trace verte et JC par la trace rouge : le gonflement des mitochondries a été mesuré en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nanomètres, indiquée par la trace noire. La spécificité de JC one et les signaux de gonflement ont été testées avec une micromolaire, CCCP et cinq microgrammes par millilitre de la toxine microbienne éthine, comme on peut le voir ici, l’absorption de calcium par les mitochondries s’accompagne d’une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.

Après quatre impulsions calciques, l’ouverture du bassin de transition de perméabilité mitochondriale est observée comme une augmentation de l’URA FF, indiquant une libération de calcium. Une diminution de JC un indiquant un effondrement du potentiel membranaire et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale, ce qui est considéré comme une réduction de la diffusion de la lumière comme marqueur de gonflement pour vérifier la spécificité de l’ouverture du port de transition de perméabilité mitochondriale. Les mêmes mesures ont été effectuées en présence de cyclosporine A, qui se lie à la transition de perméabilité mitochondriale PO composant cyclo fillin D.As montré dans cette figure, la présence d’un cycliste micromolaire forant A augmente le nombre d’impulsions de chlorure de calcium nécessaires pour ouvrir la transition de perméabilité mitochondriale PO par rapport à l’échantillon témoin.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’ouverture du port de transition de la perméabilité mitochondriale dans les mitochondries cardiaques isolées. L’aspect le plus difficile de cette procédure est d’obtenir des mitochondries isolées de bonne qualité. Par conséquent, il est important d’effectuer des mesures de contrôle de la qualité avant d’utiliser les mitochondries pour d’autres expériences.