Multi-paramètres de mesure de l'ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

L'objectif de cette vidéo est de décrire une procédure permettant de caractériser la transition de perméabilité mitochondriale. Mauvaise ouverture des mitochondries, isolées du cœur de souris. Premièrement, les mitochondries sont isolées à partir de cœurs de souris.

À l'aide de la méthode de centrifugation différentielle, la qualité des mitochondries isolées est ensuite évaluée à l'aide d'une électrode d'oxygène thermique reliée à un ordinateur afin de mesurer le rapport de contrôle respiratoire et d'évaluer l'intégrité de la membrane mitochondriale. Ensuite, à l'aide d'un appareil spectrofluorométrique, la mesure simultanée de la gestion du calcium, du potentiel de membrane mitochondriale et du volume mitochondrial est utilisée pour déterminer la transition de perméabilité. Ouverture insuffisante.

Les données obtenues ont révélé des différences dans la capacité de rétention du calcium et dans la transition de perméabilité mitochondriale. Faible sensibilité des mitochondries isolées, ouverture de la transition de perméabilité mitochondriale. L'ouverture du pore est un phénomène complexe qui implique des modifications à plusieurs niveaux de la physiologie et de l'anatomie mitochondriales.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la mesure simultanée de plusieurs paramètres offre une image plus complète du phénomène que la mesure individuelle de paramètres isolés, tels que le calcium, la mobilisation ou le gonflement. Avant de commencer la procédure, décongeler le tampon d'isolement mitochondrial et vérifier le pH, qui doit être de 7,4. Ensuite, placer tous les tampons, boîtes et tubes qui seront utilisés sur de la glace. Noter que toutes les étapes du protocole d'isolement des mitochondries doivent être effectuées sur de la glace.

Placer les cœurs de souris euthanasiées dans une boîte de Pétri et rincer tout sang avec du tampon de lyse mitochondriale froid. Ensuite, transférer les cœurs dans une nouvelle boîte de Pétri à l’aide d’une lame, retirer la graisse et les oreillettes, puis hacher finement les cœurs jusqu’à obtention d’un produit homogène.

Transférez les cœurs hachés dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 milligramme par millilitre de trypsine, et laissez le prélèvement digérer sur de la glace pendant 10 minutes. Notez que l'utilisation de la trypsine augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales.

Cependant, nous recommandons de tester la fonctionnalité des mitochondries isolées sur des préparations obtenues en l'absence de trypsine afin de s'assurer que l'enzyme n'interfère pas avec leurs ions. Après l'incubation, ajouter 10 millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 % de BS, a, libre d'acides gras, et cinq milligrammes d'inhibiteur de la trypsine, puis mélanger en retournant le tube plusieurs fois pour neutraliser la trypsine. Récupérer le tissu digéré par une centrifugation de faible à moyenne vitesse pendant une minute à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, resuspendre le tissu dans huit millilitres de tampon d'isolement des mitochondries contenant 0,1 % de BSA sans acides gras, en gardant l'échantillon sur de la glace. Utiliser un homogénéisateur motorisé avec un pilon en téflon pour homogénéiser l'échantillon en quatre à six passages à 1 200-1 400 tr/min. Transférer l'homogénat dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 800 × g pendant 10 minutes à 4 °C.

Pour faire précipiter les noyaux et les débris tissulaires. Après la centrifugation, récupérer le surnageant contenant les mitochondries dans des tubes de microcentrifugeuse et les centrifuger à 8 000 × g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, le culot présentera une couche blanche à sa surface.

Utilisez un système sous vide pour aspirer et retirer soigneusement la couche blanche située au-dessus du culot mitochondrial. Ensuite, resuspendez à nouveau le culot plus foncé restant, qui contient les mitochondries, dans un millilitre de tampon d'isolement des mitochondries.

Ensuite, centrifuger les mitochondries à 8 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot mitochondrial dans 150 microlitres de tampon d'isolement des mitochondries. Conserver les mitochondries sur de la glace.

La respiration de mitochondries isolées est mesurée à l'aide d'une électrode à oxygène thermique reliée à un ordinateur et contrôlée par le logiciel oxy. Le logiciel plus exige que l'électrode à oxygène soit étalonnée le jour de l'expérience. Ajoutez deux millilitres de tampon de respiration mitochondrial contenant une concentration finale d'une micromolaire de rotenone dans la chambre de l'oxy, scellez la chambre et commencez l'enregistrement du signal d'oxygène.

Le signal enregistré par le système et affiché sur l'écran de l'ordinateur est proportionnel à la concentration en oxygène dans la chambre oxytherm. Une fois que le signal d'oxygène est stable, ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et enregistrez la respiration basale pendant une minute. À ce stade, la respiration doit être très faible, car les mitochondries utilisent des substrats endogènes.

Ceci est la respiration à l'état un. Ajouter du succinate à une concentration finale de cinq millimolaire pour initier la respiration mitochondriale au niveau du complexe deux et enregistrer le signal pendant une minute. La consommation d'oxygène devrait augmenter durant la respiration à l'état deux.

Pour induire la respiration à l'état 3, ajoutez un DP à une concentration finale de 150 micromolaire. À ce stade, la consommation d'oxygène devrait augmenter en raison d'une synthèse de TP par phosphorylation oxydative. Enregistrez le signal jusqu'à ce que la respiration ralentisse, indiquant une consommation de DP et une transition vers l'enregistrement de la respiration à l'état 4.

État quatre : enregistrez la respiration pendant au moins une minute. Ajoutez du CCCP à une concentration finale de un micromolaire et enregistrez le signal pendant une minute. À ce stade, la respiration découplée devrait être maximale.

Calculez le rapport de contrôle respiratoire en divisant la vitesse de consommation d'oxygène durant l'état trois par la vitesse de consommation d'oxygène durant l'état quatre. Un RCR cible doit être supérieur à quatre. Ensuite, pour évaluer l'intégrité de la membrane mitochondriale, induisez la respiration à l'état trois dans un nouvel échantillon de mitochondries en ajoutant un DP à une concentration finale de un millimolaire.

Ensuite, enregistrez la consommation d'oxygène pendant une minute, ajoutez du cytochrome C à 10 micromolaire et enregistrez la consommation d'oxygène pendant deux à trois minutes. Étant donné que le cytochrome C ne peut pas traverser les membranes mitochondriales intactes dans une préparation mitochondriale de bonne qualité, il n'y aura aucune augmentation ou seulement une très faible augmentation de la respiration. Une augmentation de la respiration indique des membranes mitochondriales rompues ou endommagées.

L'instrumentation pour la mesure multiparamétrique de l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale comprend un spectrofluorimètre à double émission Quantum Master, contrôlé par le programme Felix GX. À l'aide du programme Felix GX, créez un protocole d'acquisition multidi et saisissez les paramètres pour la mesure du calcium, du potentiel de membrane mitochondrial et du gonflement pour les colorants ratiométriques, Forer et JC-1 ; générez les tracés dérivés pour le rapport Forer et le rapport JC-1. Dans une cuve jetable en méthacrylate à quatre faces, mélangez un millilitre de tampon d'essai mitochondrial avec une concentration finale d'une micromolaire de roténone, de cinq millimolaires de succinate et de 800 nanomolaires de Fora FF. Ajoutez 250 microgrammes de mitochondries et placez l'échantillon dans le compartiment d'échantillonnage du spectrofluorimètre.

Commencez l'enregistrement des signaux fluorescents après une minute, mettez en pause l'acquisition, ajoutez du JC-1 à 500 nanomolaire, puis redémarrez l'acquisition. Le signal du rapport du JC-1 doit augmenter, indiquant la prise en charge par les mitochondries actives. Poursuivez l'enregistrement jusqu'à ce que le signal du JC-1 ait atteint un plateau.

En général, ajouter du chlorure de calcium dans les cinq minutes pour obtenir une concentration finale de 20 micromolaire. Une augmentation instantanée du signal du rapport de Fluor FF doit être observée, indiquant une concentration accrue de calcium dans le tampon d'essai, suivie d'une diminution progressive due à la prise en charge mitochondriale du calcium. Le signal du rapport JC un doit présenter une brève diminution transitoire, signe d'une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.

Lorsque le signal du rapport ER FF revient au niveau basal, généralement en une à 1,5 minute avec une autre addition de 20 micromolaire de chlorure de calcium, poursuivez les impulsions à intervalles fixes jusqu'à ce que les mitochondries ne puissent plus accumuler de calcium et commencent à libérer du calcium dans le tampon d'essai. L'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale est visualisée par une augmentation concomitante du signal du rapport URA FF due à la libération de calcium. Une diminution du rapport du signal JC-1 due à l'effondrement du potentiel membranaire et une diminution de la diffusion de la lumière due au gonflement mitochondrial surviennent tout en isolant les mitochondries de souris C57BL/6J.

Comme illustré dans cette vidéo, la consommation d'oxygène a ensuite été mesurée durant la respiration à l'état trois en présence de succinate et d'ADP, puis durant la respiration à l'état quatre après la consommation d'ADP. Comme indiqué ici, l'ajout d'ADP augmente la consommation d'oxygène en raison de la phosphorylation oxydative, puis la consommation d'oxygène ralentit. Une fois que tout l'ADP a été consommé, la réponse des mitochondries isolées au découplage est mesurée par l'ajout de CCCP en présence de CCCP. Le taux de consommation d'oxygène est alors plus élevé qu'au cours de la respiration à l'état trois, ce qui permet d'évaluer l'intégrité de la membrane des mitochondries isolées.

La consommation d'oxygène a été mesurée en présence de succinate et d'un DP, puis après l'ajout de cytochrome C. Comme on le voit ici, l'ajout de cytochrome C n'augmente pas significativement la consommation d'oxygène par rapport au DP et au succinate, ce qui indique que les membranes mitochondriales intactes ne sont pas perméables au cytochrome C. Ceci permet d'évaluer la transition de perméabilité mitochondriale, ainsi que l'ouverture pauvre des mitochondries isolées du cœur, qui sert d'indicateur de la capacité de rétention du calcium mitochondrial. La transition de perméabilité mitochondriale. L'ouverture pauvre a été déclenchée par des ajouts successifs de 20 micromolaire.

Le chlorure de calcium, le calcium extramitochondrial et le potentiel de membrane ont été mesurés à l'aide d'indicateurs ratiométriques. L'URA FF, représentée par la courbe verte, et le JC-1, représenté par la courbe rouge. Le gonflement des mitochondries a été mesuré en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nanomètres, indiquée par la courbe noire. La spécificité des signaux de JC-1 et du gonflement a été testée à l'aide de un micromolaire de CCCP et de cinq microgrammes par millilitre de la toxine microbienne éthin. Comme on peut le voir ici, la prise de calcium par les mitochondries s'accompagne d'une légère dépolarisation de la membrane mitochondriale.

Après quatre impulsions calciques, l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale est observée comme une augmentation de la FF d'URA, indiquant une libération de calcium. Une diminution de JC1 indique un effondrement du potentiel membranaire et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale, ce qui se manifeste par une réduction de la diffusion de la lumière en tant que marqueur de gonflement, permettant de vérifier la spécificité de l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Les mêmes mesures ont été réalisées en présence de cyclosporine A, qui se lie au composant cyclophiline D du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Comme le montre cette figure, la présence d'une micromolaire de cyclosporine A augmente le nombre d'impulsions de chlorure de calcium nécessaires pour ouvrir le pore de transition de perméabilité mitochondriale par rapport à l'échantillon témoin.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans des mitochondries cardiaques isolées. L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à obtenir des mitochondries isolées de bonne qualité. Il est donc essentiel de réaliser des mesures de contrôle qualité avant d'utiliser les mitochondries dans des expériences ultérieures.