Name: Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez l'ingénierie de nanocapteurs fluorescents à nanotubes de carbone pour la détection moléculaire in vivo. Cette méthode utilise des polymères amphiphiles pour détecter la dopamine dans les tissus vivants.

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Ce travail a été soutenu par le Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), une subvention de la Fondation Simons et une subvention de jeune chercheur de la Fondation pour la recherche sur le cerveau et le comportement.

Attention: S&#39;il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (SDS) avant utilisation. Nanomatériaux peuvent avoir des risques supplémentaires par rapport à leurs homologues de la matière en vrac. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées, y compris les contrôles techniques (hotte, enceinte de bruit) et de l&#39;équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, lunettes, blouse, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures). 1. Préparation de tampon, un tensioactif et un polymère Solutions <ol><li> Préparation d&#39; une solution de NaCl 100 mM , <ol><li> Dissoudre 584 mg de NaCl dans 80 ml d&#39;eau déminéralisée. Ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml. </li></ol></li><li> Préparation de 3% de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution <ol><li> Dissoudre 3 g de SDS dans 80 ml d&#39;eau déminéralisée. Ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml. </li></ol></li><li> Préparation de cholate de sodium à 2% (SC) solution <ol><li> Dissoudre 2 g de gazonium cholate hydraté dans 80 ml d&#39;eau déminéralisée. Ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour amener le volume total à 100 ml. </li></ol></li><li> Préparation du tampon d&#39;image (1 x Tris: 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl) <ol><li> Dissoudre 22,23 g de base Tris et 58,44 g de NaCl dans 500 ml d&#39;eau déminéralisée en utilisant une barre d&#39;agitation magnétique et la plaque. </li><li> ajouter avec précaution du HCl concentré jusqu&#39;à ce qu&#39;un pH de 8,1 soit atteint. </li><li> Ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour atteindre un volume final de 1 L. </li></ol></li><li> Synthèse du polymère RMCT-PEG-RMCT <ol><li> Dissoudre l&#39;aminé difonctionnalisés polyéthylène glycol (PEG) (5 kDa ou 20 kDa, de 0,1 mol / L) et de l&#39;isothiocyanate de rhodamine (RMCT, 0,2 mol / L) dans 1 ml d&#39;un mélange 1: 1 de dichlorométhane et de diméthylformamide (DMF). </li><li> Ajouter 0,2 mol / L de N, N - diisopropyléthylamine (DIEA). </li><li> Au bout de 3 h, un précipité 10x volume d&#39;éther diéthylique suivie d&#39;une filtration sous vide. </li><li> Redissoudre dans du DMF et répéter l&#39;éther précipitation follomené par filtration sous vide. REMARQUE: Les autres molécules modifiées isothiocyanate (par exemple, isothiocyanate de fluorescéine, FITC) peut être attaché à du PEG ou d&#39; autres polymères d&#39;aminé modifiée à l&#39; aide d&#39; un procédé similaire. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39; ADN-pégylé (PEG-ADN) <ol><li> Moissonneuse-batteuse 100 ul de tris (2-carboxyéthyl) chlorhydrate de phosphine (TCEP) solution (0,5 M, pH 7,0) avec 44,9 ul de 5&#39;-thiol modifié par l&#39;ADN (1 mg / 10 ul dans du NaCl 0,1 M) et ajouter à 4,855 ml de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Agiter pendant 1 h. </li><li> Dissoudre 500 mg de méthoxypolyéthylèneglycol maléimide dans 5 ml de tampon phosphate salin. </li><li> Combiner les solutions d&#39;ADN et de PEG (10 ml au total) et agiter pendant 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de l&#39;unité Walled Carbon Nanotubes (SWNT) Suspensions <ol><li> Wash de SWNT pour éliminer le catalyseur et les impuretés. <ol><li> Ajouter 200-300 mg de SWNT non lavés dans un conta de tube de centrifugeuse en plastiqueining 45 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Tourbillonnaire la solution pendant 2 min et de traitement par ultrasons au moyen d&#39;un bain de sonication pendant 5 min. Notez que sonicator paramètres varient d&#39; un instrument à, afin de vérifier que la densité optique de la solution SWNT augmente (c. -à- vire au noir) pour veiller à ce que les SWNT sont dispersés. </li><li> Centrifuger la solution pendant 20 minutes à 16.100 xg et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter environ 45 ml d&#39;eau désionisée fraîche. </li><li> Répétez les étapes 2.1.2-2.1.4 jusqu&#39;à 8 fois. </li><li> Retirer l&#39;eau autant que possible en faisant attention à ne pas perturber SWNT granulées et laisser SWNT culot sécher à l&#39;air. </li></ol></li><li> Les suspensions d&#39;acide nucléique de SWNT <ol><li> Dissoudre les acides nucléiques (NA) dans 0,1 M de NaCl à une concentration de 100 mg / ml. </li><li> Retirer l&#39;électricité statique de spatule jetable, microtubes et SWNT stock à l&#39;aide d&#39;un canon anti-statique. Dans une hotte aspirante, ajouter 20 ul de la solution d&#39;AN à 980 pi de 00,1 M de NaCl suivi par l&#39;addition de 1 mg SWNT. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil à ultrasons avec embout de 3 mm de diamètre, sonication la solution pendant 10 min à 40% d&#39;amplitude dans un bain de glace. </li><li> Centrifuger la solution ADN-SWNT DEUX FOIS pendant 90 min à 16100 x g. Si vous utilisez PEG-ADN, purifier l&#39;excès et l&#39;ADN qui n&#39;a pas réagi et le PEG en utilisant un 100 kDa spin-filtre. Ajouter suffisamment PBS pour remplir le spin-filtre et essorage à 9300 xg pendant 1,5 min, Répétez cette étape de lavage 3 fois. </li><li> Recueillir et conserver le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot contenant les faisceaux et les agrégats de la CNT. Jeter la pastille conformément aux procédures de déchets dangereux institutionnels appropriés pour les nanomatériaux. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de la solution à 632 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS pour déterminer la concentration approximative de SWNT en suspension en utilisant ε = 0,036 L / cm · mg conformément à la loi de Beer-Lambert et le facteur de dilution approprié. </li></ol></li><li> Les suspensions de polymères amphiphilesde SWNT <ol><li> Retirer l&#39;électricité statique de spatule jetable, des tubes de centrifugeuse micro et SWNT stock. Dans une hotte, ajouter 5 mg SWNT à 5 ml de solution de SC 2% (en variante, la solution SDS peut être utilisé). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil à ultrasons avec la pointe de 6 mm de diamètre, sonication la solution pendant 1 h à 40% d&#39;amplitude dans un bain de glace. </li><li> échantillon Centrifugeuse à 150.000 xg pendant 4 h en utilisant une ultracentrifugeuse et recueillir soigneusement surnageant. </li><li> Dissoudre 1% en poids de polymère amphiphile (par exemple, RMCT-PEG-RMCT) en solution SC-SWNT. </li><li> Dialyser la solution polymère-SC-SWNT en utilisant une membrane de dialyse 3,5 kDa contre 1 L d&#39;eau déminéralisée ou tampon pendant 5 jours. Modifier hors de l&#39;eau ou un tampon après 2 heures et 4 heures une membrane de dialyse plus grand peut être utilisé, tant qu&#39;il permet l&#39;élimination de l&#39;agent tensioactif de choix, mais la rétention des deux SWNT et d&#39;un polymère amphiphile. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de la solution à 632 nm en utilisant un spectrophotomètre UV / VIS pour déterminerconcentration approximative de SWNT en suspension en utilisant ε = 0,036 L / cm * mg conformément à la loi de Beer-Lambert et le facteur de dilution approprié. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de surface Immobilisé Capteurs SWNT <ol><li> Préparation de BSA-biotine et des solutions mères NEUTRAVIDIN <ol><li> Dissoudre 10 mg lyophilisé BSA-biotine dans 1 ml d&#39;eau déminéralisée pour faire un / ml solution mère et stocker 10 mg à 4 ° C. </li><li> Dissoudre 10 mg de protéine NeutrAvidin (NAV, déglycosylée protéine avidine) dans 2 ml d&#39;eau déminéralisée pour faire un / ml de solution mère de 5 mg. aliquotes de conserver à -20 ° C. aliquots décongelés peuvent être conservés pendant plusieurs jours à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer BSA-biotine lames de microscope revêtues <ol><li> Nettoyer une lame de microscope et 0,17 mm couvercle en verre (ou en fonction de l&#39;objectif du microscope) avec de l&#39;eau déminéralisée, suivi par le méthanol, l&#39;acétone et un rinçage final de l&#39;eau déminéralisée. </li><li&gt; Créer des canaux en plaçant plusieurs morceaux de ruban adhésif double face environ 5 mm d&#39;intervalle sur la lame de microscope propre. Sceller les canaux en prenant une lamelle de verre longues et en appuyant sur la partie supérieure de la bande double face. Assurez-vous qu&#39;elle est centrée sur la lame de microscope de sorte que les bords de la lamelle et glisser ne sont pas rincer. </li><li> Ajouter 100 pi de BSA-biotine solution mère à 900 pi de tampon de 1x Tris à une concentration finale de 1 mg / mL. </li><li> Un débit de 50 ul de la solution de BSA-biotine dans le canal par pipetage de la solution dans une extrémité et évacuant la solution à l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;un tissu. Incuber pendant 5 minutes, puis 3-5 bouffées avec 50 ul de 0,1 M de NaCl. </li><li> Diluer 40 pi de 5 mg / mL VNI stock en 960 pi de tampon 1x Tris à une concentration finale de 0,2 mg / mL. </li><li> Écoulement 50 ul de la solution VL dans le canal par pipetage de la solution dans une extrémité et évacuant la solution à l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;un tissu. Incuber pendant 2-5 minutessuivie de 3-5 bouffées avec 50 ul de 0,1 M de NaCl. </li><li> Diluer les solutions mères de SWNT en suspension dans un tampon d&#39;image à une concentration de 1-10 mg / l et un débit de 50 ul de la solution dans le canal et laisser incuber pendant 5 min. </li><li> Rincer délicatement loin SWNT en excès à l&#39;aide de 50 pi de tampon d&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Préparation des lames de microscope de APTES REMARQUE: Les lames silanisées APTES permettent d&#39;immobiliser un moyen SWNT d&#39;ADN enveloppés chargés négativement à la surface d&#39;un substrat en verre. <ol><li> Préparer une solution aqueuse à 10% de (3-aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans l&#39;éthanol. </li><li> Utilisation des canaux réalisés en utilisant les étapes décrites dans 3.2.2, le débit dans un tampon de 100 pi de Tris 1x. </li><li> Rincer le canal avec une solution APTES et incuber pendant 5 min. Laver avec du tampon Tris 1x. </li><li> Diluer solutions de stockage de l&#39;ADN-SWNT en suspension dans un tampon d&#39;imagerie à une concentration de flux / Terrain 1-10 mg 50 ul de la solution dans le canal et Incubmangé pendant 5 min. </li><li> Rincer délicatement loin SWNT en excès à l&#39;aide de 50 pi de tampon d&#39;imagerie. </li></ol></li></ol> 4. Fluorescence Spectroscopy et Microscopie de SWNT Capteurs <ol><li> nIR Fluorescence Microscopy <ol><li> Effectuer une imagerie de surface en utilisant des SWNT immobilisés excitation laser et d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;un réseau de capteurs InGaAs pour l&#39;imagerie. </li><li> Diriger le faisceau laser pour entrer dans le port d&#39;éclairage arrière d&#39;un microscope inversé en utilisant des miroirs sur supports cinématiques réglables et une paire d&#39;iris-tige fixés à la hauteur du port. Assurer que le faisceau soit de niveau et droite en confirmant qu&#39;il passe à travers les deux iris lorsqu&#39;il est placé entre les miroirs ultérieurs et avant qu&#39;il ne pénètre dans l&#39;orifice d&#39;illumination. Si nécessaire, ajuster la hauteur du faisceau en utilisant un ensemble de périscope. Retirez tous les filtres de chaleur de courte passe-sur le port d&#39;éclairage qui atténuerait le faisceau. </li><li> Insérez un cube de filtre approprié dans le microscopepour réfléchir la lumière d&#39;excitation dans l&#39;objectif et de collecter la lumière d&#39;émission. Cela se compose généralement d&#39;un filtre à long col dichroïque avec une coupure au-dessus de la longueur d&#39; onde d&#39;excitation, (par exemple, 750 LP) et un filtre à long passage d&#39;émission (par exemple, 850 LP) afin de réduire davantage la lumière d&#39;excitation diffusée à partir de frapper le capteur. En outre, le filtre d&#39;émission peut être choisi pour être sélectif pour l&#39;émission d&#39;un SWNT chiralité particulier. </li><li> Effectuer des réglages fins de l&#39;alignement du faisceau en insérant un cube d&#39;alignement approprié de remplacer l&#39;objectif avec deux offset, disques dépoli contenant 1 mm pinholes. Aligner le faisceau par rapport au centre des deux disques d&#39;alignement inférieure et supérieure. </li><li> Attacher un capteur tableau 2D InGaAs au port d&#39;imagerie latérale du microscope en utilisant un adaptateur approprié et une lentille 0,5X si nécessaire pour s&#39;adapter à la taille du capteur. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une immersion dans l&#39;huile objectif 100X (1,4 NA), appliquer de l&#39;huile d&#39;immersion libre fluorescence et placez le Immobilisée échantillon de SWNT sur la platine du microscope. </li><li> Élever l&#39;objectif jusqu&#39;à ce que les contacts de l&#39;huile au fond du verre de couverture (# 1.5, épaisseur de 170 um). Faire des ajustements au collier objectif si nécessaire pour des conditions d&#39;imagerie, par exemple, la température, l&#39; épaisseur du verre, etc. </li><li> Soulevez lentement l&#39;objectif avec la source d&#39;excitation sur et surveiller le signal de fluorescence de la caméra InGaAs. L&#39;intensité de fluorescence devrait augmenter progressivement le plan focal se rapproche de la surface et les capteurs viennent immobilisés dans le foyer. </li></ol></li><li> nIR Fluorescence Spectroscopy REMARQUE: La spectroscopie de fluorescence peut être effectuée en utilisant la même configuration de microscope, mais en dirigeant la lumière collectée hors du corps de microscope et dans un spectromètre et InGaAs détecteur à réseau linéaire. <ol><li> Utilisation de supports cinématiques et des miroirs notés pour nIR, diriger le chemin de la lumière vers la fente d&#39;entrée du spectromètre. Concentrez la lumière vers le bas pour un point sur la fente d&#39; entrée en utilisant une lentille de focalisation (par exemple plan-convexe, f = 150 mm). Cet alignement est réalisé en atténuant la puissance du laser à &lt;1 mW et le remplacement de l&#39;objectif de microscope avec un &quot;miroir 1 et en utilisant un filtre cube 50/50 diviseur de faisceau. La lumière d&#39;excitation sera alors quitter le corps du microscope à travers l&#39;orifice de sortie et ne pouvez être utilisé pour régler les miroirs et de lentilles pour focaliser le faisceau sur la fente d&#39;entrée. </li><li> Après avoir remplacé l&#39;objectif du microscope et à long filtre passe, placer une plaque bien sur la scène et enregistrer les spectres d&#39;un échantillon de mise au point à l&#39;aide du spectromètre et tableau InGaAs. </li></ol></li><li> Mesure de la réponse réversible (GT) 15 ADN-SWNT à la dopamine <ol><li> Monter le capteur revêtu canaux sur la scène du microscope et mettre au point à l&#39;aide d&#39;un objectif d&#39;huile 100X et la caméra InGaAs. Ajouter 50 ul de solution 100 uM de dopamine dans du tampon phosphate salin (PBS) pour le canal d&#39;écoulement et l&#39;enregistrementle changement d&#39;intensité de fluorescence. </li><li> Laver la solution de la dopamine en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate et d&#39;observer le changement de la fluorescence des capteurs de SWNT individuels. </li></ol></li><li> Dépistage Bien-plaque pour une réponse en analyte de SWNT capteurs NOTE: Projection de différents analytes peut être effectuée en utilisant une plaque de puits transparente contrôlée à l&#39;aide d&#39;une platine motorisée. Une plaque de puits idéal est transparent à la lumière visible et IR et a des parois latérales noires pour minimiser la diaphonie entre les puits. <ol><li> Pipette volumes égaux de capteur de SWNT en suspension (par exemple, 5 mg concentration / L) dans chaque puits, assez pour couvrir le fond du puits de manière uniforme, typiquement&gt; 100 pi pour une plaque de 96 puits et&gt; 30 pl pour une plaque à 384 puits . </li><li> Pipette analytes (par exemple, 2 ul, 100 uM de volume final) de criblage de bibliothèque dans les plaques des puits. Préparer chaque analyte en triple pour tenir compte des puits de potentiel à puits variation, fluctuatdes ions d&#39;intensité d&#39;excitation, ou de la température. </li><li> Soulever l&#39;objectif (par exemple, 20X achroplan, 0,45 NA) tout en surveillant les spectres d&#39;émission à l&#39; aide du spectromètre et réseau InGaAs. la position optimale de l&#39;objectif de mettre le plan focal à peu près au milieu du volume de l&#39;échantillon dans le puits, ce qui devrait correspondre à un maximum d&#39;intensité mesurée. </li><li> Pour chaque échantillon, enregistrer l&#39;exposition d&#39;un 1-10 pour recueillir un spectre. </li><li> Comparer les spectres d&#39;émission pour chaque puits à un témoin ne contenant que des SWNT sans analyte supplémentaire pour quantifier la réponse de fluorescence. </li></ol></li></ol>

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<li>Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+and+Oxidized+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+as+Robust+Near-IR+Fluorescent+Probes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+C%22%5BJournal%5D)">Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging.</a> J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

SWNT sont facilement mises en suspension dans une solution aqueuse par sonication directe avec le SDS ou ADNsb, comme indiqué par une augmentation de la densité optique fournie par la dispersion colloïdale de l&#39;hybride SWNT-polymère résultant. SDS et ADNsb solubilise et disperse des faisceaux de SWNTs par adsorption sur la surface de SWNT par des interactions hydrophobes ou pi-pi. En outre, d&#39;autres polymères, tels que l&#39;ADN génomique, des polymères amphiphiles, des polymères et des lipides conjugués, peuven...

Monoparoi nanotubes de carbone (SWNTs) sont atomiquement des couches minces d&#39;atomes de carbone laminées dans de longs cylindres minces, qui présentent des propriétés électroniques et optiques uniques. 1 Ces propriétés comprennent une bande interdite production proche infrarouge (NIR) émission de fluorescence par recombinaison exciton qui est très sensible à son environnement local. L&#39;émission NIR SWNT tombe dans la fenêtre infrarouge proche dans lequel la profondeur de pénétration de la lumière est maximal pour les tissus biologiques. 2,3 En outre, SWNT présentent plusieurs caractéristiques uniques atypiques contrairement à des fluorophores organiques: SWNT présentent un grand décalage de Stokes, ne photobleach pas, et ne clignotent pas. 4 Récemment, l&#39; exploitation de ces caractéristiques a conduit à l&#39;élaboration d&#39;un assortiment de capteurs moléculaires avec des applications en biologie. 5,6 Unmodified, cependant, SWNT sont insolubles dans l&#39; eau, et d&#39; obtenir des suspensions de SWNT individuelles peut être un défi. 7,8 Bundling et l&#39; agrégation des SWNT en solution peuvent masquer leur fluorescence de bande interdite, 2 les rendant impropres à des applications de détection. Dispersion des nanotubes de carbone individuels en solution aqueuse nécessite la modification de leur surface pour empêcher l&#39;agrégation entraînée hydrophobie. 9 Bien que la modification covalente peut rendre SWNT soluble dans l&#39;eau, 10 ainsi que de répandre la chimie de liaison spécifique, les sites de défaut dans le réseau de SWNT réduire ou diminuent leur émission de fluorescence. Au lieu de cela, des SWNT fonctionnalisation peut être réalisée en utilisant des tensioactifs, des lipides, des polymères et de l&#39; ADN 9,11 - 13 adsorbées à la surface des nanotubes au moyen d&#39; interactions hydrophobes et d&#39; empilement pi-pi. L&#39;environnement chimique résultante entourant SWNT fonctionnalisés de surface est appelée la phase de couronne. Perturbations à la phase corona peuvent avoir un impact important sur excitons voyageant sur la surface du nanotube, ce qui provoque des modulations à SWNT Fluorescence émission. Il est cette relation sensible entre la phase corona et SWNT fluorescence qui peut être exploitée pour développer de nouveaux capteurs moléculaires en incorporant des modalités de liaison spécifique sur la grande surface de SWNT. Perturbations à la phase de corona SWNT sur analyte de liaison peuvent conduire à des changements dans l&#39;environnement diélectrique local, transfert de charge, ou d&#39;introduire des défauts de réseau, tous capables de moduler l&#39;émission de fluorescence des SWNT à servir de mécanisme de transduction du signal. 14 Cette approche est utilisée dans le développement de nouveaux capteurs fluorescents pour la détection de différentes classes de molécules , y compris l&#39; ADN, 15,16 glucose 17 et de petites molécules telles que l&#39; ATP, 18 espèces réactives de l&#39; oxygène 19 et d&#39; oxyde nitrique. 20,21 Cependant, ces approches sont limitées en ce qu&#39;elles reposent sur l&#39;existence d&#39;une modalité de liaison connue pour l&#39;analyte cible. Récemment, une application plus génériquegardon à la conception de capteurs fluorescents a été développé en utilisant SWNT non covalente fonctionnalisés avec des hétéropolymères amphiphiles, des phospholipides et des acides polynucléique. Ces molécules adsorbées à la surface des nanotubes de carbone pour produire des suspensions très stables de SWNT individuels 22 - 25 avec des phases corona uniques qui peuvent se lier spécifiquement à des protéines ou de petites molécules 26,27 , y compris la dopamine. 28 - 30 Ingénierie de la phase corona pour disperser SWNT et en particulier des analytes cibles se lient est appelé à la reconnaissance moléculaire de phase corona (CoPhMoRe). 28 La petite taille, faible toxicité, une grande stabilité et unbleaching fluorescence nIR de capteurs CoPhMoRe SWNT font d&#39;excellents candidats pour la détection in vivo pour des mesures résolues en temps prolongées. 6 Des travaux récents ont montré leurs applications dans les tissus végétaux pour la détection optique des espèces d&#39;azote et d&#39; oxygène réactif. 31Une application particulièrement intéressante pour les capteurs CoPhMoRe SWNT est le potentiel de marqueur libre détection des neurotransmetteurs tels que la dopamine in vivo, où d&#39; autres techniques, telles que la détection électrochimique ou immunohistochimie, souffrent d&#39;un manque de résolution spatiale, la résolution temporelle et la spécificité. Conception et découverte capteurs CoPhMoRe SWNT a jusqu&#39;à présent été freinée par la taille et la diversité chimique de la bibliothèque de dispersant, ce qui limite la probabilité de trouver un capteur pour une cible particulière. À ce jour, les chercheurs ont seulement gratté la surface de conjugué disponible, co-bloc, biologique et polymères biomimétiques qui pourraient servir de dispersants fonctionnellement actifs pour les capteurs de SWNT. Ici, nous présentons des méthodes différentes pour les deux dispersant SWNT et de caractériser leur fluorescence pour le criblage à haut débit et pour seule analyse du capteur de SWNT. Plus précisément, nous décrivons la procédure de SWNT de revêtement avec oligom d&#39;acide polynucléiqueteurs utilisant sonication directe ainsi que la façon de fonctionnaliser SWNT avec des polymères amphiphiles par l&#39;échange de surfactant par dialyse. Nous utilisons (GT) 15 -ADN et de polyéthylène glycol fonctionnalisé avec de la rhodamine isothiocyanate (RMCT-PEG-RMCT) à titre d&#39; exemples. Nous démontrons l&#39;utilisation de (GT) 15 -ADN SWNT comme un capteur de CoPhMoRe pour la détection de la dopamine. Enfin, nous décrivons des procédures pour effectuer des mesures individuelles de détection de molécules qui peuvent être utilisées pour la caractérisation ou la détection de la molécule unique.

<table><tbody><tr><td>chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>cholate de sodium hydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>base tris (base Trizma)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>rhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>isothiocyanate de fluorescéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>dichlorométhane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>diméthylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropyléthylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>éther diéthylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyéthyl)phosphine chlorhydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ADN modifié au 5'-thiol&nbsp ;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>méthoxypolyéthylène glycol maléimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa filtres de spin</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Nanotubes de carbone à paroi unique super purifiés Integris</td><td></td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr><tr><td>phosphate saline tamponnée</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>pistolet antistatique</td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>centrifugeuse Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ultra sonicateur</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>cassettes de dialyse</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotine</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Protéine de neutravidine</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>microscope inversé</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>miroirs cinématiques</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>périscope</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>huile d’immersion</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X objectif</td><td>Zeiss</td><td>Huile Plan-apochromatique 100X, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 20X</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>verre de protection</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de dopamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Caméra infrarouge 2D</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana réseau de</td><td></td></tr><tr><td>capteurs infrarouges 1D</td><td>Princeton Instruments</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR spectrographe</td><td>Princeton Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>lentille planoconvexe</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>plaques de puits (fond de verre)</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

reconnaissance moléculaire ingénierie avec polymères bio-mimétiques sur simple walled carbon nanotubes

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Les nanotubes de carbone semi-conducteurs à paroi simple (SWNT) sont une classe de nanomatériaux optiquement actifs qui deviennent fluorescents dans le proche infrarouge, coïncidant avec la fenêtre optique où les échantillons biologiques sont les plus transparents. Ici, nous décrivons des techniques pour adsorber des polymères amphiphiles et des acides polynucléiques à la surface des SWNT afin de concevoir leurs phases corona et de créer de nouveaux capteurs moléculaires pour les petites molécules et les protéines. Ces capteurs SWNT fonctionnalisés sont à la fois biocompatibles et stables. Les polymères sont adsorbés sur la surface des nanotubes soit par sonication directe des SWNT et du polymère, soit en suspendant les SWNT à l’aide d’un tensioactif suivi d’une dialyse avec un polymère. L’émission de fluorescence, la stabilité et la réponse de ces capteurs aux analytes cibles sont confirmées à l’aide de l’absorbance et de la spectroscopie de fluorescence dans le proche infrarouge. De plus, nous démontrons l’immobilisation de surface des capteurs sur des lames de verre pour permettre la microscopie à fluorescence à molécule unique pour caractériser l’adsorption des polymères et la cinétique de liaison des analytes.

SWNT ont été suspendues en solution aqueuse en utilisant les tensioactifs et les polymères amphiphiles par sonication directe et par échange de dialyse. La figure 1 montre SWNT, cultivé selon la méthode du carbonyle de fer catalysée (HIPCO), suspendue en utilisant SC, RMCT-PEF20-RMCT, et (GT) 15 -ADN. La densité optique d&#39;un SWNT avec du SDS (ou polymère) augmente de manière spectaculaire après sonication et diminue lors de l&#39; élimination des agrégats ...

Nous présentons un protocole pour l’ingénierie de la phase corona de nanotubes de carbone fluorescents à paroi unique (SWNT) dans le proche infrarouge en utilisant des polymères amphiphiles et de l’ADN pour développer des capteurs pour des cibles moléculaires sans éléments de reconnaissance connus.

Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer des nanotubes de carbone fluorescents à paroi unique dans le proche infrarouge pour la détection moléculaire qui ont été fonctionnalisés à l’aide de polymères biomimétiques. Ces nanocapteurs peuvent permettre une imagerie résolue dans le temps dans les tissus vivants. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour détecter la dopamine dans le cerveau.Le principal avantage de ces capteurs est leur fluorescence proche infrarouge inhérente, qui permet d’imager plus profondément dans les tissus. Les capteurs synthétiques permettent de détecter des molécules sans éléments de reconnaissance moléculaire naturels, ce qui rend cette méthode générique de développement de capteurs particulièrement utile pour la détection de petites molécules. Pour préparer une suspension d’acide nucléique de SWNT, dissolvez d’abord les acides nucléiques dans du chlorure de sodium 0,1 molaire à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.Dans une hotte, éliminez l’électricité statique de la spatule jetable, des tubes de microcentrifugation et de la crosse SWMT, à l’aide d’un pistolet antistatique. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution d’acide nucléique à 980 microlitres de chlorure de sodium 0,1 molaire. Ajoutez ensuite 1 milligramme de SWNT lavés à la solution d’acide nucléique obtenue avant de soniser le mélange.Le positionnement de la pointe de la sonde pendant la sonication est essentiel. En cas de mousse, repositionnez la pointe de la sonde et essayez de réduire l’amplitude. Alternativement, vous pouvez essayer des impulsions de sonication ou de sonication de bain si la suspension reste mauvaise.À l’aide d’un ultrasoniseur avec une pointe de 3 millimètres de diamètre, sonicez la solution pendant 10 minutes à 40 % d’amplitude dans un bain de glace. Centrifugez la solution d’ADN SWNT deux fois pendant 90 minutes à 16, 100 xg. Recueillir et conserver le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille contenant des faisceaux et des agrégats de nanotubes de carbone.Jeter les granules conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux appropriées pour les nanomatériaux. Mesurer l’absorbance de la solution à 632 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis pour déterminer la concentration approximative des SWNT en suspension, conformément à la loi de Lambert-Beer, et le facteur de dilution approprié. Pour les suspensions de polymères amphiphiles, éliminez d’abord l’électricité statique de la spatule jetable, des tubes de microcentrifugation et de la crosse SWNT.Dans une hotte, ajoutez cinq milligrammes de SWNT à cinq millilitres de solution de cholate de sodium à 2 %. À l’aide d’un ultrasoniseur avec une pointe de six millimètres de diamètre, sonicez la solution pendant une heure à 40 % d’amplitude dans un bain de glace. Centrifugez l’échantillon à 150 000 xg pendant quatre heures à l’aide d’une ultracentrifugeuse, avant de prélever soigneusement le surnageant.Ensuite, dissolvez 1 % en poids de polymère amphiphile dans la solution de scSWNT. Ensuite, dialysez la solution de polymère scSWNT à l’aide d’une membrane de dialyse de 3,5 kilodaltons contre un litre d’eau désionisée ou de tampon pendant cinq jours. Changez l’eau ou le tampon à la deuxième heure et à la quatrième heure.Mesurer l’absorbance de la solution à 632 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis pour déterminer la concentration approximative de SWNT en suspension. Pour préparer les lames recouvertes de biotine BSA, nettoyez une lame de microscope et un verre de couverture de 0,17 millimètre avec de l’eau déminéralisée, puis du méthanol, de l’acétone et un rinçage final à l’eau déminéralisée. Créez des canaux en plaçant plusieurs morceaux de ruban adhésif double face à environ cinq millimètres de distance sur la lame de microscope propre.Scellez les canaux en prenant une longue lamelle en verre et en la pressant sur le dessus du ruban adhésif double face. Assurez-vous de le centrer sur la lame du microscope de manière à ce que les bords de la lamelle et de la lame ne soient pas affleurants. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution mère BSA-biotine à 900 microlitres de 1x tampon Tris jusqu’à une concentration finale d’un milligramme par millilitre.Versez 50 microlitres de la solution de biotine BSA dans le canal en pipetant la solution à une extrémité et en évacuant la solution à l’autre extrémité à l’aide d’un mouchoir. Après avoir incubé la solution pendant cinq minutes, effectuez trois à cinq rinçages avec 50 microlitres de chlorure de sodium à 0,1 molaire. Ensuite, diluez 40 microlitres de cinq milligrammes par millilitre de solution mère NAV dans 960 microlitres de 1x tampon Tris, jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre.Versez 50 microlitres de la solution NAV dans le canal en pipetant la solution à une extrémité et en évacuant la solution à l’autre extrémité à l’aide d’un mouchoir. Après avoir incubé la lame pendant deux à cinq minutes, effectuez trois à cinq rinçages avec 50 microlitres de chlorure de sodium à 0,1 molaire. Ensuite, diluez les solutions mères de SWNT en suspension et le tampon d’imagerie à une concentration de 1 à 10 milligrammes par litre.Versez 50 microlitres de cette solution dans le canal et incubez pendant cinq minutes. Rincez doucement l’excès de SWNT à l’aide de 50 microlitres de tampon d’imagerie. Pour mesurer la réponse réversible des GT15 DNA-SWNT à la dopamine, montez d’abord les canaux recouverts du capteur sur la platine du microscope à fluorescence.Mettez les canaux au point à l’aide d’un objectif à huile 100X et d’une caméra à l’arséniure d’indium et de gallium. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution de dopamine de 100 micromolaires dans une solution saline tamponnée au phosphate dans le canal d’écoulement et enregistrez le changement d’intensité de fluorescence. Lavez la solution de dopamine à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate et observez le changement de fluorescence des capteurs SWNT individuels.Pour effectuer le criblage de la réponse analytique des SWNT de polymère biomimétique, pipetez des volumes égaux du capteur SWNT suspendu dans chaque puits. Utilisez suffisamment de volume pour couvrir uniformément le fond du puits. Ensuite, pipetez les analytes de la bibliothèque de criblage dans les plaques à puits.Préparez chaque analyte en trois exemplaires pour tenir compte des variations potentielles d’un puits à l’autre et des fluctuations de l’intensité de l’excitation ou de la température. Relever l’objectif tout en surveillant les spectres d’émissions à l’aide du spectromètre et du réseau d’arséniure d’indium et de gallium. La position optimale de l’objectif placera le plan focal à peu près au milieu du volume de l’échantillon dans le puits, ce qui devrait correspondre à un maximum d’intensité mesurée.Pour chaque puits d’échantillon, enregistrez une exposition d’une à 10 secondes pour recueillir un spectre. Comparez les spectres d’émissions de chaque puits à ceux d’un témoin ne contenant que des SWNT sans analyte supplémentaire, afin de quantifier la réponse de fluorescence. Le spectre d’absorbance des capteurs de nanotubes d’ADN GT15 montre plusieurs pics correspondant à des nanotubes de carbone bien dispersés de chiralité différente.La fluorescence dans le proche infrarouge des capteurs de nanotubes d’ADN GT15 est illustrée. Il est intéressant de noter que l’intensité de la fluorescence double environ en réponse à la dopamine. Sur cette figure, la microscopie à fluorescence dans le proche infrarouge révèle des capteurs uniques de nanotubes d’ADN GT15 immobilisés à la surface d’une lamelle de verre.À l’avenir, il est important de tester le capteur pour une utilisation in vivo, par exemple en élargissant la bibliothèque d’analytes pour inclure les concurrents moléculaires, en testant la linéarité de la réponse dans le régime de concentration biologiquement pertinent, et en testant également la réversibilité. Une fois maîtrisée, cette approche peut être utilisée pour créer une bibliothèque de différents capteurs synthétiques à partir de molécules sans éléments de reconnaissance moléculaire connus.

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Une méthode de fonctionnalisation de nanotubes de carbone avec des couches d’encapsulation polymérique réglables à la structure et de caractérisation structurale à l’aide de la diffusion de neutrons aux petits angles est présentée.

Fonctionnalisation de Simple paroi Carbon Nanotubes avec Thermo-réversibles Copolymères blocs et Caractérisation par petits angles de diffusion neutronique

Les acides nucléiques sont des analytes courants pour l’évaluation des systèmes biologiques ; cependant, le biais de manipulation enzymatique peut être préoccupant. Ici, une méthode est décrite pour la détection sans marquage des acides nucléiques à l’aide de la polyaniline. Cette technologie de capteur sensible et rentable permet de distinguer les différences de nucléotides entre les molécules.

Un capteur à base de polyaniline d&#39;acides nucléiques

Ici, nous présentons un protocole pour préparer et visualiser les structures secondaires (par exemple, des fibres, des architectures toroïdaux et nano-sphères) dérivées de polycarbodiimides hélicoïdaux. La morphologie caractérisée à la fois par microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie électronique à balayage (SEM) a montré dépendre de la structure moléculaire, la concentration et le solvant de choix.

Morphologies auto-assemblage obtenu à partir hélicoïdaux polycarbodiimide Copolymères et leurs dérivés triazole

Polymères semi-flexibles affichent des propriétés mécaniques uniques qui sont largement appliquées par les systèmes vivants. Toutefois, des études systématiques sur les biopolymères sont limitées puisque les propriétés telles que la rigidité de polymère sont inaccessibles. Ce manuscrit décrit comment cette limitation est contournée par programmable ADN nanotubes, permettant des études expérimentales sur l’impact de la rigidité du filament.

Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

Une procédure pour la synthèse de nanotubes de carbone multiparois polystyrène-greffés à l’aide de modification chimique successifs les étapes sélectivement pour introduire les chaînes de polymère à flancs et leur auto-assemblage est via anisotrope morcellement présenté.

Greffage des Nanotubes de carbone multiparois avec polystyrène pour permettre à l’auto-assemblage et morcellement anisotrope

Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification des molécules abondantes faibles dans des solutions complexes en utilisant moléculaire en combinaison avec un biocapteur capacité d’impression.

Base de détection ultrasensible des biomarqueurs à l’aide d’une empreinte moléculaire biocapteur capacitif

Dans ce travail, nous proposons un protocole permettant de biofonctionnaliser des nanomatériaux magnétiques avec des anticorps pour un ciblage cellulaire spécifique. À titre d’exemple, nous utilisons des nanofils de fer pour cibler les cellules cancéreuses.

Biofonctionnalisation des nanomatériaux magnétiques

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Découvrez l'ingénierie de nanocapteurs fluorescents à nanotubes de carbone pour la détection moléculaire in vivo. Cette méthode utilise des polymères amphiphiles pour détecter la dopamine dans les tissus vivants.

Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

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