Reconnaissance moléculaire Ingénierie avec Polymères Bio-mimétiques sur simple Walled Carbon Nanotubes

L’objectif global de cette procédure est de préparer des nanotubes de carbone fluorescents à paroi unique dans le proche infrarouge pour la détection moléculaire qui ont été fonctionnalisés à l’aide de polymères biomimétiques. Ces nanocapteurs peuvent permettre une imagerie résolue dans le temps dans les tissus vivants. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour détecter la dopamine dans le cerveau.

Le principal avantage de ces capteurs est leur fluorescence proche infrarouge inhérente, qui permet d’imager plus profondément dans les tissus. Les capteurs synthétiques permettent de détecter des molécules sans éléments de reconnaissance moléculaire naturels, ce qui rend cette méthode générique de développement de capteurs particulièrement utile pour la détection de petites molécules. Pour préparer une suspension d’acide nucléique de SWNT, dissolvez d’abord les acides nucléiques dans du chlorure de sodium 0,1 molaire à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Dans une hotte, éliminez l’électricité statique de la spatule jetable, des tubes de microcentrifugation et de la crosse SWMT, à l’aide d’un pistolet antistatique. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution d’acide nucléique à 980 microlitres de chlorure de sodium 0,1 molaire. Ajoutez ensuite 1 milligramme de SWNT lavés à la solution d’acide nucléique obtenue avant de soniser le mélange.

Le positionnement de la pointe de la sonde pendant la sonication est essentiel. En cas de mousse, repositionnez la pointe de la sonde et essayez de réduire l’amplitude. Alternativement, vous pouvez essayer des impulsions de sonication ou de sonication de bain si la suspension reste mauvaise.

À l’aide d’un ultrasoniseur avec une pointe de 3 millimètres de diamètre, sonicez la solution pendant 10 minutes à 40 % d’amplitude dans un bain de glace. Centrifugez la solution d’ADN SWNT deux fois pendant 90 minutes à 16, 100 xg. Recueillir et conserver le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille contenant des faisceaux et des agrégats de nanotubes de carbone.

Jeter les granules conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déchets dangereux appropriées pour les nanomatériaux. Mesurer l’absorbance de la solution à 632 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis pour déterminer la concentration approximative des SWNT en suspension, conformément à la loi de Lambert-Beer, et le facteur de dilution approprié. Pour les suspensions de polymères amphiphiles, éliminez d’abord l’électricité statique de la spatule jetable, des tubes de microcentrifugation et de la crosse SWNT.

Dans une hotte, ajoutez cinq milligrammes de SWNT à cinq millilitres de solution de cholate de sodium à 2 %. À l’aide d’un ultrasoniseur avec une pointe de six millimètres de diamètre, sonicez la solution pendant une heure à 40 % d’amplitude dans un bain de glace. Centrifugez l’échantillon à 150 000 xg pendant quatre heures à l’aide d’une ultracentrifugeuse, avant de prélever soigneusement le surnageant.

Ensuite, dissolvez 1 % en poids de polymère amphiphile dans la solution de scSWNT. Ensuite, dialysez la solution de polymère scSWNT à l’aide d’une membrane de dialyse de 3,5 kilodaltons contre un litre d’eau désionisée ou de tampon pendant cinq jours. Changez l’eau ou le tampon à la deuxième heure et à la quatrième heure.

Mesurer l’absorbance de la solution à 632 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis pour déterminer la concentration approximative de SWNT en suspension. Pour préparer les lames recouvertes de biotine BSA, nettoyez une lame de microscope et un verre de couverture de 0,17 millimètre avec de l’eau déminéralisée, puis du méthanol, de l’acétone et un rinçage final à l’eau déminéralisée. Créez des canaux en plaçant plusieurs morceaux de ruban adhésif double face à environ cinq millimètres de distance sur la lame de microscope propre.

Scellez les canaux en prenant une longue lamelle en verre et en la pressant sur le dessus du ruban adhésif double face. Assurez-vous de le centrer sur la lame du microscope de manière à ce que les bords de la lamelle et de la lame ne soient pas affleurants. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution mère BSA-biotine à 900 microlitres de 1x tampon Tris jusqu’à une concentration finale d’un milligramme par millilitre.

Versez 50 microlitres de la solution de biotine BSA dans le canal en pipetant la solution à une extrémité et en évacuant la solution à l’autre extrémité à l’aide d’un mouchoir. Après avoir incubé la solution pendant cinq minutes, effectuez trois à cinq rinçages avec 50 microlitres de chlorure de sodium à 0,1 molaire. Ensuite, diluez 40 microlitres de cinq milligrammes par millilitre de solution mère NAV dans 960 microlitres de 1x tampon Tris, jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre.

Versez 50 microlitres de la solution NAV dans le canal en pipetant la solution à une extrémité et en évacuant la solution à l’autre extrémité à l’aide d’un mouchoir. Après avoir incubé la lame pendant deux à cinq minutes, effectuez trois à cinq rinçages avec 50 microlitres de chlorure de sodium à 0,1 molaire. Ensuite, diluez les solutions mères de SWNT en suspension et le tampon d’imagerie à une concentration de 1 à 10 milligrammes par litre.

Versez 50 microlitres de cette solution dans le canal et incubez pendant cinq minutes. Rincez doucement l’excès de SWNT à l’aide de 50 microlitres de tampon d’imagerie. Pour mesurer la réponse réversible des GT15 DNA-SWNT à la dopamine, montez d’abord les canaux recouverts du capteur sur la platine du microscope à fluorescence.

Mettez les canaux au point à l’aide d’un objectif à huile 100X et d’une caméra à l’arséniure d’indium et de gallium. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution de dopamine de 100 micromolaires dans une solution saline tamponnée au phosphate dans le canal d’écoulement et enregistrez le changement d’intensité de fluorescence. Lavez la solution de dopamine à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate et observez le changement de fluorescence des capteurs SWNT individuels.

Pour effectuer le criblage de la réponse analytique des SWNT de polymère biomimétique, pipetez des volumes égaux du capteur SWNT suspendu dans chaque puits. Utilisez suffisamment de volume pour couvrir uniformément le fond du puits. Ensuite, pipetez les analytes de la bibliothèque de criblage dans les plaques à puits.

Préparez chaque analyte en trois exemplaires pour tenir compte des variations potentielles d’un puits à l’autre et des fluctuations de l’intensité de l’excitation ou de la température. Relever l’objectif tout en surveillant les spectres d’émissions à l’aide du spectromètre et du réseau d’arséniure d’indium et de gallium. La position optimale de l’objectif placera le plan focal à peu près au milieu du volume de l’échantillon dans le puits, ce qui devrait correspondre à un maximum d’intensité mesurée.

Pour chaque puits d’échantillon, enregistrez une exposition d’une à 10 secondes pour recueillir un spectre. Comparez les spectres d’émissions de chaque puits à ceux d’un témoin ne contenant que des SWNT sans analyte supplémentaire, afin de quantifier la réponse de fluorescence. Le spectre d’absorbance des capteurs de nanotubes d’ADN GT15 montre plusieurs pics correspondant à des nanotubes de carbone bien dispersés de chiralité différente.

La fluorescence dans le proche infrarouge des capteurs de nanotubes d’ADN GT15 est illustrée. Il est intéressant de noter que l’intensité de la fluorescence double environ en réponse à la dopamine. Sur cette figure, la microscopie à fluorescence dans le proche infrarouge révèle des capteurs uniques de nanotubes d’ADN GT15 immobilisés à la surface d’une lamelle de verre.

À l’avenir, il est important de tester le capteur pour une utilisation in vivo, par exemple en élargissant la bibliothèque d’analytes pour inclure les concurrents moléculaires, en testant la linéarité de la réponse dans le régime de concentration biologiquement pertinent, et en testant également la réversibilité. Une fois maîtrisée, cette approche peut être utilisée pour créer une bibliothèque de différents capteurs synthétiques à partir de molécules sans éléments de reconnaissance moléculaire connus.