Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

L’objectif de cette méthodologie est de manipuler des tissus délicats de plantes, d’oomycètes et de champignons, pour leur observation optimale au microscope électronique à balayage, ou MEB. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions concernant pratiquement tous les champignons, microbes, mor-phorités, et comment ils infectent, colonisent et se fixent à leur hôte. La technique de notre méthodologie améliorée consiste à fixer des échantillons, pour savoir où se trouvent les mi-toh-mins dans les écosystèmes aquatiques.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de visualiser les aspects clés de l’infection à l’aide de ressources coûteuses et facilement disponibles. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes ont été considérablement modifiées par rapport aux protocoles traditionnels. Et les méthodes publiées décrivent des procédures générales sans détails.

Pour commencer, préparez le fixateur de formol et d’alcool acétique, ou FAA, dans une sorbonne équipée d’un filtre à aldéhyde. À 85 parties d’éthanol dénaturé à 70 %, 10 parties de solution de formaldéhyde à 60 % et cinq parties d’acide acétique glacial. Sous la sorbonne, versez le stock de FAA dans des récipients individuels.

Sélectionnez les méristèmes floraux ou végétatifs à fixer, en veillant à ce qu’ils ne soient pas endommagés par des insectes, des champignons ou des conditions météorologiques extrêmes. Coupez les branches, en enlevant les matériaux indésirables, et déposez immédiatement l’échantillon dans la solution FAA. Après 72 à 96 heures, versez le FAA dans un récipient en plastique pour l’élimination des produits chimiques.

Lavez immédiatement les échantillons trois fois avec de l’éthanol frais à 70 % pour éliminer tout résidu de FAA. Le matériau fixe peut être stocké indéfiniment dans de l’éthanol à 70 %. Disséquez les échantillons dans une boîte de Pétri recouverte d’éthanol pour éviter que les tissus ne se dessèchent.

Utilisez une boîte de Pétri dont la base est recouverte d’un silicone noir sec pour mieux voir le tissu blanc contrastant. Transférez les tissus dans des récipients séparés, puis plongez-les dans une boîte de Pétri contenant 70 % d’éthanol. Mettez les couvercles sur les récipients et déposez-les dans un tube à centrifuger en plastique avec beaucoup d’éthanol à 70 %.

Transférez le matériau disséqué à travers une série d’éthanol dans des bocaux hermétiques ou des tubes à centrifuger. Laissez les échantillons dans chaque solution pendant au moins une heure. Conservez ensuite les échantillons toute la nuit dans une solution 100 % éthanol.

Après la série d’éthanol, transférez les récipients contenant le matériel dans le CPD. Inscrivez le numéro d’identification de l’échantillon sous les porte-échantillons MEB. Couvrez ensuite le haut des talons avec du ruban adhésif double face.

Placez les talons dans un porte-échantillons. À l’aide d’un stéréomicroscope, ouvrez avec précaution les récipients contenant les échantillons jeunes et délicats déjà séchés dans le CPD. Gardez à l’esprit qu’après le traitement CPD, les échantillons deviennent plus légers et sensibles à l’électrostatique.

Fermez les récipients une fois les échantillons retirés pour éviter la poussière ou les impuretés. Placez les échantillons sur la surface collante des talons en planifiant à l’avance la position souhaitée. Une fois que les échantillons touchent la surface, il est très difficile de les retirer.

N’essayez pas d’effectuer une dissection majeure à ce stade. Il suffit de retirer le tissu indésirable qui est facile à ramasser. Pour les études palynologiques, disséquez les anthères et ouvrez-les pour exposer le pollen sur les talons.

Conservez les échantillons protégés toute la nuit dans un récipient hermétique avec du gel de silice pour éviter la réhydratation. Enrobez les échantillons à l’aide de l’observateur et transférez-les dans le MEB comme décrit dans le protocole de texte. Pour tester la croissance différentielle des épines des kystes sur des boîtes de Pétri séparées, mettez 0,5 millilitre de suspension de kyste secondaire sur différentes surfaces.

Les surfaces peuvent inclure des grilles de microscopie électronique à transmission de carbone, d’or et de cuivre. Auparavant, les écailles de saumon et de merlu blanchies et les lamelles de verre. Incuber les kystes à 20 degrés Celsius pendant 70 minutes, ce qui favorise la fixation des kystes à la surface.

Retirez le liquide et ajoutez 0,5 millilitre de glutaraldéhyde à 2 % sur chaque surface pour la fixation des kystes. Conservez les échantillons à température ambiante sous une sorbonne pendant une heure. Retirez le glutaraldéhyde et déshydratez les échantillons à travers une série d’éthanol, en ajoutant cinq millilitres de chacune des solutions d’éthanol pendant 15 minutes.

Une fois dans la dernière solution 100 % éthanol, l’échantillon peut être stocké jusqu’à un mois dans une boîte de Pétri scellée. Transférez soigneusement les grilles et les balances de la boîte de Pétri dans un support adapté au CPD qui maintient les échantillons séparés les uns des autres, tel qu’un support de grille CPD ou un support d’échantillon empilable. Prenez la grille et les écailles avec une pince à épiler, en gardant à l’esprit que les kystes doivent être orientés vers le haut sur les grilles à tout moment.

Procéder au séchage du matériel à l’aide du CPD avant d’effectuer la préparation d’échantillons MEB des ovocytes pour observer leur comportement sur différentes surfaces, comme décrit dans le protocole textuel. Enveloppez soigneusement chaque échantillon avec du papier filtre pour former des enveloppes étiquetées au crayon d’environ 0,5 à un centimètre carré. Veillez à ne pas écraser les échantillons.

Scellez le papier filtre avec des trombones. Transférez ensuite les échantillons emballés dans une boîte de Pétri et plongez-les dans 10 millilitres d’eau pour réhydrater le tissu autour des spores. Mettez immédiatement les échantillons dans un micro-ondes.

Retirez le matériau une fois que l’eau commence à s’évaporer et laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, passez l’échantillon dans une série d’éthanol. En fonction de la quantité d’échantillon, utilisez un bécher ou un tube à centrifuger pour cette étape.

Laissez les échantillons pendant 15 minutes dans chaque solution. Ensuite, placez les échantillons dans le CPD comme décrit dans le protocole texte. Pour monter les spores pour l’observation MEB, ouvrez les enveloppes.

Récupérez ensuite les spores avec la surface collante des talons, en prenant soin de ne pas les écraser. Enfin, effectuez un revêtement d’or des échantillons et l’observation MEB comme détaillé dans le protocole de texte. On voit ici des boutons floraux d’anacyclus clavatus traités au tétroxyde d’osmium et préparés à l’aide du protocole CPD de la FAA démontré dans cette vidéo.

On voit également des échantillons séchés de Phellorinia herculanea sans aucun traitement, ainsi que des spores fongiques traitées, comme le montre cette vidéo. Cette figure illustre le développement floral précoce, intermédiaire et tardif capturé dans le cadre du MEB. Cette image est la vue de dessus d’un jeune reh-cim.

On voit ici un bouton floral lors de la différenciation du gynésium et une fleur à l’anthèse. Certaines structures peuvent être difficiles à fixer et à préserver pour l’imagerie sous le MEB, par exemple celles provenant d’environnements humides, ainsi que celles avec des ornements et celles avec des indumenta.

On voit ici les modèles de croissance différentielle des épines de Saprolegnia parasitica sur du verre, du carbone, du cuivre, de l’or, des écailles de merlu et des écailles de saumon. Il s’agit d’une vidéo montrant le cycle de vie asexué de Saprolegnia parasitica. Le cycle asexué est important pour la dispersion de ces organismes dans leurs milieux aquatiques ou humides.

De plus, les spoors de zoo produits à ce stade représentent l’unité primaire d’infection chez les espèces parasites de l’ordre des saprolèges. Bien que la maîtrise de cette technique puisse être réalisée en trois à cinq jours, elle est effectuée correctement. Nous avons utilisé de l’argent pour compléter les thérapies SEM fournies à un usage externe pendant cette période au Jardin botanique royal de Madrid.

Après avoir regardé cette vidéo, les chercheurs sauraient comment collecter et fixer efficacement du matériel biologique délicat pour l’observation MEB. La destruction des cellules, la distorsion des organes ou la mauvaise conservation des échantillons des environnements humides peuvent être facilement surmontées avec cette procédure. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’observation par MEB se limite à l’étude à fort grossissement des surfaces.

De plus, avant le traitement CPD, les joints doivent être protégés des modifications choquantes et du contact direct avec l’air. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la phytologie pour explorer la structure des spores au cours du processus infectieux, en particulier chez les espèces d’intérêt pour les pêcheries. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie à transmission ou la MT peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la structure interne de la composition cellulaire dans un organe ou des cellules spécifiques, ou le pollen.

N’oubliez pas que la manipulation du formol et du glutaraldéhyde peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que travailler sous une sorbonne et utiliser des masques, des blouses de laboratoire et des gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.