Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

L'objectif principal de la méthode présentée dans cet article vidéo est de générer rapidement des motifs cellulaires spatialement définis afin de faciliter l'analyse in situ des interactions spatiotemporelles entre cellules. La stratégie décrite s'appuie sur la technologie de la sonde microfluidique. La tête de sonde microfabriquée localise des volumes nanolitriques de produits biochimiques sur des substrats biologiques pour former des motifs de monocouches cellulaires.

Le principal avantage d'une technique de dessin basée sur un MFP réside dans sa quasi-instantanéité, grâce à la lyse locale, ce qui permet une modification en temps réel des motifs à produire. Nous avons eu l'idée de cette méthode en remarquant que d'autres techniques de génération de motifs cellulaires nécessitent des protocoles longs et multiphasés avant de pouvoir observer le succès des motifs cellulaires. Pour réaliser des expériences stables avec un confinement hydrodynamique sur une surface cellulaire, les paramètres du MFP doivent être optimisés.

À cette fin, la démonstration visuelle est essentielle. Aditya Kashyap et Julien Cors démontreront cette procédure. Les modules opérationnels de la plateforme comprennent des seringues motorisées, des plateaux motorisés et un contrôleur.

Le MFP est connecté à une platine Z motorisée afin de contrôler la distance d'entrefer entre la tête et le substrat, et le support du substrat est fixé aux platines motorisées X et Y constituant le système de balayage. La tête du MFP possède des vias fluidiques pour se connecter à la station de pompage, des trous de fixation pour monter la tête sur la platine Z, ainsi que des canaux qui débouchent au niveau de l'apex poli. L'apex est positionné coplanaire au substrat de culture cellulaire.

Pour préparer la station de pompage et l'appareil de manipulation des fluides, nettoyez les seringues et les pistons de seringue par sonication dans une solution d'eau distillée contenant 0,5 % d'eau de Javel avant et après les expériences sur cellules vivantes. Rincez-les soigneusement à l'eau. Remplissez les seringues d'eau en y immergeant complètement les embouts dans un bain d'eau et en aspirant à l'aide du piston.

Éliminer l'air du liquide dans le bain-marie en maintenant la tige de la seringue en contact avec le joint à la sortie de la seringue. Continuer à aspirer et à purger jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air ne soit visible dans la colonne de la seringue. Relier les seringues remplies aux pompes à seringue à l'aide de raccords à verrouillage inférieur.

Utilisez le robinet de commutation monté sur les pompes pour diriger le liquide de la seringue vers l'une des deux capillaires menant soit à la tête MFP, soit aux réservoirs de liquide. Purgez les deux capillaires avec de l'eau provenant des seringues à un débit d'environ 10 à 50 microlitres par minute, selon la taille de la seringue, jusqu'à ce qu'il reste environ 10 microlitres d'eau dans les seringues. Nettoyez la tête MFP par sonication en utilisant un détergent pour verrerie pour un nettoyage standard, ou de l'eau de Javel à 0,5 % pour un nettoyage rigoureux, pendant cinq minutes.

Purgez les canaux avec de l'eau en immergeant l'apex dans l'eau et en appliquant un vide aux vias. Inspectez les canaux au microscope stéréo à la recherche d'obstructions éventuelles, et répétez l'étape précédente si nécessaire. Ensuite, fixez la tête nettoyée sur le support de tête et vissez le connecteur sur la tête.

Insérez les capillaires purgés dans un adaptateur de connecteur microfluidique approprié qui s'interfasse avec les vias de canal dans la tête. Vissez le support de tête sur la platine Z, utilisée pour le contrôle de la distance d'entrefer entre la tête et la monocouche cellulaire, avant d'effectuer l'étalonnage final tel que décrit dans le protocole textuel. Obtenez une distance d'entrefer nulle approximative en plaçant la tête MFP au-dessus d'une lamelle sans cellules et en descendant lentement par paliers de cinq micromètres.

Lors du contact entre la sonde et le substrat, des anneaux de Newton doivent être observés. Il s'agit d'une estimation approximative. Une position précise doit être obtenue après ajustement de la coplanéité de l'apex de la sonde avec le substrat.

Lorsqu'elles se forment, veillez à ce que les anneaux de Newton soient symétriques. Afin de garantir la coplanéité de l'extrémité de la sonde, ajustez l'inclinaison de la tête à l'aide d'un goniomètre placé à l'interface entre la tête et la platine Z. Éloignez la tête de la MFP de 20 micromètres par rapport au substrat et ajustez l'inclinaison à l'aide du goniomètre.

Répétez la descente, la mise à zéro et le réglage de l'inclinaison jusqu'à ce que les anneaux de Newton soient symétriques au contact. Une fois l'inclinaison ajustée, réglez à zéro la position Z produisant des anneaux de Newton symétriques. Préparez ensuite le liquide de traitement pour le canal d'injection interne et la solution tampon d'extraction nécessaire pour l'injection externe, comme décrit dans le protocole écrit.

À l’aide de la ligne de drainage, raccorder les pompes à seringue, purger l’eau restante et aspirer les solutions dégazées dans les seringues d’injection à raison de 40 microlitres par minute jusqu’à ce que les seringues soient pleines. Cela garantit un remplissage sans bulles des seringues, des raccords et des capillaires. Pour préparer les monocouches cellulaires sur des lamelles-chambre, faire proliférer les cellules dans des flacons de culture T en suivant les protocoles standards de culture cellulaire.

Une fois la confluence cellulaire atteinte dans les flacons de culture, trypsiner et recueillir les cellules. Ensemencer 0,2 million de cellules par centimètre carré dans chacune des chambres des lames à deux chambres pour le dessin. Cultiver les cellules pendant 48 heures en utilisant les cellules d'une des chambres comme témoin pour la croissance et la viabilité cellulaire.

Lorsque les cellules atteignent la confluence sur les lamelles-chambre, incubez-les pendant 45 minutes avec 500 microlitres de solution de colorant traceur de cellules à une concentration de 10 micromolaire préparée dans un milieu sans sérum. Cette étape est réalisée pour visualiser les cellules pendant le dessin du motif. Lavez les cellules marquées avec du PBS en rinçant doucement chaque chambre à l’aide d’une pipette.

Ensuite, cultiver les cellules dans un milieu enrichi en sérum pour les expériences de mise en motif. Le confinement hydrodynamique par flux localise les liquides grâce à l'injection et à l'aspiration simultanées d'un liquide de traitement. Dans le confinement hiérarchique, plusieurs liquides de traitement sont confinés, le HFC externe protégeant l'échantillon du HFC de traitement interne.

Déplacez le MFP au-dessus de la monocouche cellulaire jusqu’à une distance d’écart de 50 micromètres par rapport à la lame de verre. Cette distance d’écart garantit le contact de la HFC hiérarchique et tient également compte des variations de surface et d’épaisseur de la monocouche. Injectez de l’hydroxyde de sodium à raison de six ou huit microlitres par minute à travers I-deux.

Évaluez d'autres débits en utilisant les règles de débit décrites dans le protocole textuel. Modifiez la taille du HFC interne en changeant le rapport des débits d'injection QI-deux et QI-un à l'aide des seringues d'injection. Par exemple, utilisez un QI-un compris entre 1,3 microlitre par minute et 4 microlitres par minute, avec un QI-deux fixé à 8 microlitres par minute, afin d'obtenir une empreinte d'hydroxyde de sodium de 150 à 300 cellules.

Injectez le milieu complet à partir des orifices les plus externes de la tête MFP à un débit de 20 microlitres par minute afin de compenser l'évaporation du milieu et l'aspiration pendant le fonctionnement du hHFC. Pour dessiner les monocouches cellulaires, réglez le logiciel de la platine pour balayer la tête de la sonde sur la monocouche cellulaire selon des motifs définis par l'utilisateur, à une vitesse de balayage de 10 micromètres par seconde et à une distance d'espacement de 50 micromètres. Avec le hHFC imbriqué en fonctionnement et en contact avec la monocouche, balayez la MFP selon la trajectoire du motif souhaité afin d'obtenir un retrait cellulaire selon ce motif.

Pour une coculture après le retrait du premier type de cellules, ensemencez une lignée cellulaire différente afin de combler les espaces, comme précédemment. Préparez la station d'échantillonnage pour l'analyse en aval du lysat. On voit ici un exemple de station d'échantillonnage, composée d'un support imprimé en trois dimensions pour huit bandes de PCR.

Essuyez le support de tube avec de l'éthanol à 70 % ou un autre désinfectant de surface, selon le niveau de rigueur souhaité pour l'application. Utilisez un clip magnétique sur le support de tube pour l'attacher au support de substrat. Après avoir préparé la station d'échantillonnage, positionnez la tête MFP à 100 micromètres de la monocouche.

Commencez à utiliser le hHFC avec une solution d'hydroxyde de sodium à 50 millimolaire comme liquide de traitement pour le canal d'injection interne, à un débit de un microlitre par minute pour QI-un, six microlitres par minute pour QI-deux, moins sept microlitres par minute pour QA-un et moins 17,5 microlitres par minute pour QA-deux. Une fois que le confinement de l'écoulement est stabilisé, abaissez la tête de la sonde jusqu'à une distance d'écartement de 50 microns afin d'effectuer une lyse locale basée sur l'hydroxyde de sodium sur la sous-population de cellules choisie à l'aide du hHFC. Une fois la lyse de la sous-population terminée, dirigez la tête vers les tubes situés à la station d'échantillonnage.

Éjectez le lysat recueilli directement dans les tubes PCR. Après traitement du lysat, comme décrit dans le protocole écrit, chargez le lysat dans un flux de travail qPCR standard tel que défini par le fournisseur de l'instrument. En contrôlant le rapport des liquides injectés dans la CFC hiérarchique, la taille de l'empreinte en contact avec la surface cellulaire est modulée.

Les débits ont été choisis de manière à ce que l'effet chimique, plutôt que le cisaillement, soit le mécanisme dominant de lyse cellulaire. Ceci a été confirmé par la détermination du cisaillement à l'aide de la dynamique des fluides numérique. On observe ici la génération d'une grille d'îlots cellulaires par programmation de trajectoire balayante avec le MFP.

La modulation de la taille de l'empreinte à l'aide du rapport du liquide d'injection permet de contrôler la résolution de l'élimination des cellules. Cette méthode peut être utilisée pour la coculture séquentielle de plusieurs populations cellulaires, permettant ainsi de générer des motifs complexes d'interactions cellule-cellule. L'utilisation d'hydroxyde de sodium comme liquide de traitement rend le lysat compatible avec une analyse basée sur la PCR des cellules.

Ici, la teneur en ADN a été quantifiée à partir de cinq empreintes et d'une empreinte unique, lysées à l'aide de la méthode décrite. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur des cellules en moins de 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que les canaux et les capillaires sont exempts de bulles d'air, car cela pourrait nuire négativement à la CHF.

N'oubliez pas que le travail avec l'hydroxyde de sodium, une solution chimique corrosive, peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Après cette procédure, nous pouvons analyser localement les cellules par immunomarquage ou par séquençage ADN-ARN grâce à la lyse médiée par MFP afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les protéines qui sont surexprimées en raison du confinement géométrique des cellules. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie moléculaire pour explorer la signalisation intra- et extracellulaire durant la formation et la dégénérescence des tissus.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un façonnage soustractif de monocouches cellulaires mises en place dans un MFP pour un traitement local, et créer des géométries complexes de cocultures de cellules.