Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

L’objectif principal de la méthode présentée dans cet article vidéo est de générer rapidement des motifs cellulaires définis dans l’espace pour faciliter l’analyse spatio-temporelle in situ des interactions entre cellules. La stratégie présentée s’appuie sur la technologie des sondes microfluidiques. La tête de sonde microfabriquée localise des volumes nanolitres de produits biochimiques sur des substrats biologiques pour modeler les monocouches cellulaires.

Le principal avantage d’une technique de structuration basée sur MFP est qu’elle est presque instantanée, en raison de la lyse locale, ce qui permet de modifier en temps réel les motifs à générer. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons remarqué que d’autres méthodes pour générer des motifs cellulaires nécessitent des protocoles longs et en plusieurs étapes avant de voir le succès des modèles cellulaires. Pour exécuter des expériences stables avec un confinement d’écoulement hydrodynamique à la surface d’une cellule, les paramètres MFP doivent être optimisés.

À cette fin, une démonstration visuelle est essentielle. Aditya Kashyap et Julien Cors feront la démonstration de cette procédure. Les modules opérationnels de la plate-forme comprennent des seringues motorisées, des platines motorisées et un contrôleur.

Le MFP est connecté à une platine Z motorisée pour contrôler la distance d’espace entre la tête et le substrat, et le support de substrat est fixé aux platines motorisées X et Y constituant le système de balayage. La tête MFP est dotée de vias fluidiques pour se connecter à la station de pompage, de trous de montage pour monter la tête sur l’étage Z et de canaux qui sortent de l’apex poli. L’apex est fixé coplanaire au substrat de culture cellulaire.

Pour préparer la station de pompage et l’appareil de manipulation des fluides, nettoyer les seringues et les pistons de seringue par sonication et une solution d’eau de Javel à 0,5 % dans de l’eau ultrapure avant et après les expériences sur cellules vivantes. Rincez-les abondamment à l’eau. Remplissez les seringues d’eau en immergeant complètement leurs pointes dans un bain-marie et en aspirant à l’aide du piston.

Purgez le liquide à l’intérieur du bain-marie avec la tige de la seringue en contact avec le joint à la sortie de la seringue. Continuez à aspirer et à purger jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles d’air dans les colonnes de seringue. Connectez les seringues remplies aux pousse-seringues à l’aide de connecteurs à verrouillage inférieur.

Utilisez la soupape de commutation montée sur les pompes pour diriger le liquide de la seringue vers l’un des deux capillaires menant soit à la tête de l’imprimante multifonction, soit aux réservoirs de liquide. Purgez les deux capillaires avec de l’eau des seringues à un débit d’environ 10 à 50 microlitres par minute, selon la taille de la seringue, jusqu’à ce qu’il reste environ 10 microlitres d’eau dans les seringues. Nettoyez la tête du MFP par sonication à l’aide d’un détergent pour verrerie pour un nettoyage standard, ou d’un agent de blanchiment à 0,5 % pour un nettoyage rigoureux, pendant cinq minutes.

Purgez les canaux avec de l’eau en immergeant l’apex dans l’eau et en appliquant un vide sur les vias. Inspectez les canaux au microscope stéréoscopique pour détecter toute obstruction potentielle et répétez l’étape précédente, si nécessaire. Ensuite, montez la tête nettoyée sur le support de tête et vissez le connecteur sur la tête.

Insérez les capillaires purgés dans un adaptateur de connecteur microfluidique approprié qui s’interface avec les vias de canal dans la tête. Vissez le support de tête sur la platine Z, qui est utilisée pour le contrôle de la distance d’espace entre la tête et la monocouche de cellule, avant d’effectuer l’étalonnage du point final comme décrit dans le protocole texte. Obtenez une distance brute à espace zéro en amenant la tête MFP sur une lame de chambre sans cellules et en descendant lentement par pas de cinq microns.

Lors du contact de la sonde avec le substrat, les anneaux de Newton doivent être observés. Il s’agit d’une estimation grossière. Une position précise doit être obtenue après ajustement de la coplanarité de l’apex de la sonde par rapport au substrat.

Une fois formés, assurez-vous que les anneaux de Newton sont symétriques. Pour assurer la coplanarité de l’apex de la sonde, ajustez l’inclinaison de la tête à l’aide d’un goniomètre à l’interface de la tête et de la platine Z. Éloignez la tête du MFP de 20 microns du substrat et ajustez l’inclinaison à l’aide du goniomètre.

Répétez la descente, la mise à zéro et le réglage de l’inclinaison jusqu’à ce que les anneaux de Newton soient symétriques au contact. Avec l’inclinaison ajustée, réglez la position Z, qui produit des anneaux de Newton symétriques, à zéro. Ensuite, préparez le liquide de traitement pour le canal d’injection interne et la solution tampon d’extraction nécessaire à l’injection externe, comme décrit dans le protocole texte.

À l’aide de la conduite de vidange, connectez-vous aux pousse-seringues, purgez l’eau restante et aspirez les solutions dégazées dans les seringues d’injection à 40 microlitres par minute jusqu’à ce que les seringues soient pleines. Cela garantit un remplissage sans bulles des seringues, des connecteurs et des capillaires. Pour préparer les monocouches cellulaires sur des lames de chambre, utilisez des cellules dans des flacons en T en utilisant des protocoles de culture cellulaire standard.

Une fois la confluence cellulaire dans les flacons de culture, trypsiniser et prélever les cellules. Ensemencez 0,2 million de cellules par centimètre carré dans chacune des lames à deux chambres pour la création de motifs. Cultivez les cellules pendant 48 heures en utilisant les cellules de l’une des chambres comme contrôle de la croissance et de la viabilité cellulaires.

Une fois la confluence cellulaire atteinte sur les lames de la chambre, incubez les cellules pendant 45 minutes avec 500 microlitres de solution de colorant cell-tracker à une concentration de 10 micromolaires préparée dans un milieu sans sérum. Ceci est fait pour la visualisation des cellules pendant la structuration. Lavez les cellules marquées avec du PBS en rinçant doucement chaque chambre à l’aide d’une pipette.

Par la suite, cultivez les cellules dans un milieu supplémenté en sérum pour les expériences de structuration. Le confinement de l’écoulement hydrodynamique localise les liquides en utilisant l’injection et l’aspiration simultanées d’un liquide de traitement. Dans le confinement hiérarchique, plusieurs liquides de traitement sont confinés, le HFC externe protégeant l’échantillon du HFC du traitement interne.

Déplacez le MFP sur la monocouche de cellule à une distance d’espace de 50 microns de la lame de verre. Cette distance d’espace assure le contact avec le HFC hiérarchique et tient également compte de la variation de surface et d’épaisseur de la monocouche. Injection d’hydroxyde de sodium à six ou huit microlitres par minute à travers I-deux.

Évaluez d’autres débits à l’aide des règles de flux du protocole texte. Modulez la taille du HFC intérieur en modifiant le rapport des débits d’injection QI-deux et QI-un à l’aide des seringues d’injection. Par exemple, utilisez un QI-one entre 1,3 microlitres par minute et quatre microlitres par minute, avec le QI-2 fixé à huit microlitres par minute, pour obtenir une empreinte hydroxyde de sodium de 150 à 300 cellules.

Injectez tout le fluide à partir des ouvertures les plus extérieures de la tête MFP à un débit de 20 microlitres par minute pour tenir compte de l’évaporation du fluide et de l’aspiration pendant le fonctionnement du hHFC. Pour modéliser les monocouches de cellules, réglez le logiciel de platine pour balayer la tête de sonde sur la monocouche de cellules selon des motifs définis par l’utilisateur à une vitesse de balayage de 10 microns par seconde et à une distance d’écart de 50 microns. Lorsque le hHFC imbriqué fonctionne et est en contact avec la monocouche, balayez le MFP avec la trajectoire du motif souhaité pour effectuer l’élimination des cellules à motifs.

Pour une coculture après l’élimination du premier type cellulaire, ensemencez une lignée cellulaire différente pour combler les lacunes, comme précédemment. Préparer la station d’échantillonnage pour l’analyse en aval du lysat. Voici un exemple de station d’échantillonnage, qui comprend un support PCR imprimé en trois D à huit bandes.

Essuyez le support de tube avec de l’éthanol à 70 % ou d’autres décontaminants de surface, en fonction de la rigueur souhaitée pour l’application. À l’aide d’un clip magnétique sur le support de tube, fixez-le sur le support de substrat. Après avoir préparé la station d’échantillonnage, positionnez la tête MFP à 100 microns de la monocouche.

Commencez à faire fonctionner le hHFC avec une solution d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires comme liquide de traitement pour le canal d’injection interne avec un débit d’un microlitre par minute pour le QI-un, de six microlitres par minute pour le QI-deux, de moins sept microlitres par minute pour le QA-un et de moins 17,5 microlitres par minute pour le QA-deux. Une fois que le confinement de l’écoulement s’est stabilisé, descendez la tête de la sonde à une distance d’espace de 50 microns pour effectuer une lyse locale à base d’hydroxyde de sodium sur la sous-population choisie de cellules avec le hHFC. Une fois la lyse de la sous-population terminée, diriger la tête vers les tubes de la station d’échantillonnage.

Éjectez directement le lysat collecté dans les tubes PCR. Après avoir traité le lysat, comme décrit dans le protocole texte, chargez-le dans un flux de travail qPCR standard défini par le fournisseur de l’instrument. En contrôlant le rapport des liquides d’injection dans le HFC hiérarchique, la taille de l’empreinte en contact avec la surface de la cellule est modulée.

Les débits ont été choisis, de sorte que l’effet chimique, plutôt que le cisaillement, est le mécanisme dominant de la lyse cellulaire. Cela a été corroboré par la détermination du cisaillement à l’aide de la dynamique des fluides numérique. La représentation est la génération d’une grille d’îlots cellulaires par balayage de la programmation de trajectoire avec le MFP.

La modulation de la taille de l’empreinte à l’aide du rapport de liquide d’injection permet de contrôler la résolution de l’élimination des cellules. Cette méthode peut être utilisée pour la coculture séquentielle de plusieurs populations cellulaires, générant ainsi des modèles complexes d’interactions de cellule à cellule. L’utilisation d’hydroxyde de sodium comme liquide de traitement rend le lysat compatible avec l’analyse des cellules par PCR.

Ici, le contenu en ADN a été quantifié à partir de cinq et une empreinte, lysée à l’aide de la méthode décrite. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur des cellules en moins de 30 minutes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que les canaux et les capillaires sont exempts de bulles d’air, car cela peut nuire au HFC.

N’oubliez pas que travailler avec de l’hydroxyde de sodium, une solution chimique corrosive, peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que des lunettes de sécurité et des blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Suite à cette procédure, nous pouvons analyser localement les cellules par immunomarquage ou séquençage de l’ADN-ARN par lyse médiée par MFP afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelles protéines sont surexprimées en raison du confinement géométrique des cellules. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie moléculaire pour explorer la signalisation intercellulaire et extracellulaire lors de la génération et de la dégénérescence des tissus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de modéliser de manière soustractive les monocouches de cellules configurées dans MFP pour le traitement local et de créer des géométries complexes de cocultures de cellules.