Name: Commande temporelle des données dexpression dynamique dexpression spatiale détaillée Plans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Découvrez une méthode computationnelle pour cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique dans l'horloge de segmentation vertébrée. Cette technique permet d'analyser simultanément de nombreux échantillons de mésoderme présomitique fixé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par une studentship MRC à RAB, un studentship MRC à CSLB, et une subvention de projet de WT à JKD (WT089357MA). Le travail a également été soutenu par un prix stratégique Welcome Trust (097.945 / Z / 11 / Z). Nous remercions le Dr E. Kremmer pour le genre don de l&#39;anticorps DLL1 et le Dr O. Pourquie pour la sonde Lfng ARN.

Toutes les expériences ont été réalisées au titre du projet numéro de licence 6,004,219 dans le strict respect des animaux (Scientific Procedures) Act de 1986 et les codes UK Home Office de pratique pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans les procédures scientifiques. 1. PSM Explantation Dissection <ol><li> Obtenir le tissu de la queue à partir d&#39; embryons produits par l&#39;accouplement temporisée de type sauvage (CD1) souris 13. Brièvement, au jour embryonnaire (E) 10,5, euthanize la souris donneuse enceinte dans une chambre de dioxyde de carbone. Récolter la corne utérine et le placer dans 1x solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) en conformité avec Home Office procédures de licence ou des règles locales équivalentes. Transférer la corne utérine à une boîte de culture de tissu contenant frais, PBS stérile. Effectuez toutes les étapes de dissection ultérieures dans cette solution. </li><li> En vertu d&#39;un stéréomicroscope, couper la membrane musculaire épaisse de la corne utérine en utilisant des ciseaux courbes et extraire chaque embryon avec soin en utilisant une pince fine. Prends soinfaire en sorte que le tissu de la queue ne soit pas endommagé dans ce processus. Avec des ciseaux courbes et une pince fine, disséquer le sac amniotique de chaque embryon, en prenant soin de ne pas endommager l&#39;embryon. </li><li> Utiliser une aiguille chirurgicale ou ciseaux courbes pour récolter la queue tissu de chaque embryon en coupant la partie postérieure de l&#39;embryon aux bourgeons des membres arrière. </li><li> Équilibrer le tissu de la queue ventrale vers le bas en utilisant les deux pinces et une aiguille. Générer des paires de explants PSM de chaque queue embryonnaire en disséquant le tissu de la queue en deux moitiés le long de la ligne médiane; effectuer un mouvement de balancement doux avec une aiguille. Veiller à ce que le tube, notochorde, et le tissu neural PSM sont répartis également entre les deux explants. </li><li> Pipeter chaque PSM expiant controlatéral sur la face inférieure d&#39;une 35 mm de culture en plastique plat couvercle dans un petit volume de pré-chauffé (37 ° C) du milieu de culture (DMEM-F12 + 0,1% de L-glutamine substitut supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal , 10 nM bFGF humain et 1% de pénicilline / streptomycine). </li> &lt;li&gt; Placez le plat sur le dessus du couvercle et rapidement inverser afin que le tissu PSM est suspendu à partir du couvercle dans une &quot;goutte suspendue&quot; du milieu. La culture des explants PSM dans une chambre humidifiée à 37 ° C pendant 1 - 2 h. </li><li> des paires de transfert d&#39;explants PSM dans les puits individuels d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Incuber à 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 1 h à température ambiante (TA) ou à 4 ° C pendant une nuit (O / N). ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique, et des mesures de sécurité appropriées doivent être prises lorsque l&#39;on travaille avec cette solution. REMARQUE: Effectuer toutes lavage et d&#39;incubation des étapes ultérieures dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. </li><li> Laver les puits d&#39;échantillon dans PBS à la température ambiante sur une plate-forme à bascule, en utilisant une pipette fine plastique Pasteur pour échanger la solution PBS sur les échantillons pour PBS frais 3 - 4 fois. Traiter une explantation du PSM de chaque paire en utilisant une immunohistochimie (étape 2) et l&#39;autre en utilisant une hybridation in situ fluorescente pour un gène d&#39;horloge connue (step 3). </li></ol> 2. immunohistochimie de PSM explants <ol><li> Laver un explant PSM de chaque paire embryonnaire généré à l&#39;étape 1 à 2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante sur une plate-forme à bascule, puis rincer les échantillons brièvement dans PBS. Remplacer le tampon PBS sur les échantillons avec une solution de blocage (2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS + 0,1 Tween-20%) et on incube O / N à 4 ° C sur une plate-forme à bascule. REMARQUE: Tous les lavages ultérieurs et les étapes d&#39;incubation de cette section doivent être effectuées à la température ambiante sur une plate-forme à bascule, sauf indication contraire. Les solutions de lavage peuvent être facilement modifiés en utilisant une matière plastique ou en verre pipette à pointe fine Pasteur. </li><li> Diluer l&#39;anticorps / anticorps primaires souhaités dans un tampon de travail (0,1% de BSA, 0,3% de NGS et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS). Dans cet exemple, diluer les anticorps DLL1 et Notch1 1:25 dans un tampon de travail. NOTE: L&#39;optimisation sera nécessaire pour déterminer le facteur de dilution approprié requis dans this étape si des anticorps de remplacement sont utilisés. </li><li> Incuber explants dans la solution d&#39;anticorps pendant 3 - 5 jours à 4 ° C sur une plate-forme à bascule. Assurez-vous d&#39;inclure des échantillons avec un tampon de travail ne contenant pas d&#39;anticorps primaire à agir en tant que témoins d&#39;anticorps secondaires. </li><li> Récupérer la solution d&#39;anticorps primaire dans un tube de stockage de 1,5 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette et le stocker à 4 ° C. REMARQUE: Récupéré anticorps primaire peut être utilisé plusieurs fois, en fonction de l&#39;anticorps utilisé. </li><li> Effectuer 2 lavages des échantillons pendant 5 - 10 minutes à chaque fois dans du PBS, puis 3 lavages pendant 10 minutes à chaque fois dans 2% de Triton X-100 dans du PBS à la température ambiante sur une plate-forme à bascule. </li><li> Diluer anticorps / anticorps secondaires marqués par fluorescence (épitope adaptée à l&#39;anticorps primaire / anticorps utilisés) dans un tampon de travail. Éventuellement, ajouter 20 pg / ml de Hoechst 33342 à cette solution à contre-colorer les noyaux. NOTE: L&#39;optimisation peut être nécessaire pour déterminer le facteur de dilution approprié nécessaire à cette étape. Dans cet exemple, un facteur de dilution de 1: 400 a été généralement utilisé. </li><li> Centrifuger la solution d&#39;anticorps secondaire pendant 10 min à 16 xg pour empêcher la formation d&#39;agrégats d&#39;anticorps. Ajouter 250 - 500 ul de la solution d&#39;anticorps secondaire à chaque échantillon, en prenant soin de ne pas utiliser ces dernières microlitres de la solution, qui peut contenir des agrégats d&#39;anticorps. </li><li> Couvrir la plaque d&#39;échantillon avec une feuille d&#39;étain pour minimiser l&#39;exposition de lumière et incuber les échantillons dans la solution d&#39;anticorps secondaire pendant 3 - 5 jours à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Avant de goûter le montage, se laver les échantillons deux fois pendant 10 min chacune dans 0,1% de Tween-20 dans PBS (PBST) et une fois pendant 5 min dans du PBS à la température ambiante sur une plate-forme à bascule (voir l&#39;étape 4). </li></ol> 3. Fluorescent In Situ Hybridation (FISH) de PSM explants <ol><li> Si elles sont stockées dans un récipient alternatif, transférer les autres explants PSM controlatérale dans les puits individuels d&#39;une plaque de culture tissulaire de 24 puits. </li><li> Laver les échantillons pour10 minutes dans l&#39;éthanol à 50% dans du PBST, puis effectuer 2 lavages pendant 10 minutes à chaque fois dans 100% d&#39;éthanol sur une plate-forme à bascule à la température ambiante pour déshydrater le tissu. REMARQUE: Tous les lavages ultérieurs et les étapes d&#39;incubation de cette section doivent être effectuées à la température ambiante sur une plate-forme à bascule, sauf indication contraire. </li><li> Réhydrater le tissu par un lavage pendant 10 min dans de l&#39;éthanol à 50% dans du PBST, suivi par un lavage deux fois pendant 5 min à chaque fois dans du PBST. REMARQUE: les étapes 3.2 et 3.3 sont des étapes de fixation nécessaires pour ce protocole et ne peut pas être omis. </li><li> Incuber les échantillons avec 10 pg / ml de proteinase K dans 0,1% de Tween-20 dans du PBS (PBST) pendant 5 minutes sans agitation. Retirez rapidement la proteinase K et rincer les échantillons brièvement avec PBST avant post-fixation du tissu pendant 30 min dans 4% de formaldéhyde + 0,1% de glutaraldéhyde dans du PBST. ATTENTION: Les deux formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont toxiques, et des mesures de sécurité appropriées doivent être prises lorsque l&#39;on travaille avec ces solutions. NOTE: Le lavage suivantet les étapes d&#39;incubation impliquant 50% et 100% des mélanges d&#39;hybridation (étapes 03.06 à 03.09) doivent être effectuées sans agitation. </li><li> Après avoir lavé les échantillons deux fois pendant 10 min chacune dans PBST, laver les échantillons une fois dans 50% mélange d&#39;hybridation (adapté pour les sondes introniques: 50% de formamide, 5x citrate salin-sodium (SSC), EDTA 5 mM, 50 pg / ml d&#39;ARNt, 0,2% de Tween-20, 0,1% de SDS et 100 pg / ml d&#39;héparine) dans le PBST préparé à la température ambiante. Incuber les échantillons dans cette solution pendant 10 min à 65 ° C sans agitation. </li><li> Rincer les échantillons deux fois avec préchauffé (65 ° C) mélange d&#39;hybridation avant l&#39;incubation des échantillons mélange d&#39;hybridation pendant ≥ 2 h (jusqu&#39;à 48 h) à 65 ° C (plus longues durées d&#39;incubation d&#39;améliorer le contraste résultant signal sur bruit) . Retirer le mélange d&#39;hybridation de l&#39;étape précédente, et le remplacer par de 0,25 à 0,5 ml de pré-chauffé (65 ° C) mélange d&#39;hybridation contenant une digoxigénine (DIG) marqué à la sonde d&#39;ARN anti-sens contre un composant connu segmentation d&#39;horloge. NE PASE: Par exemple, une frange Lunatic intronique (Lfng (i)) sonde a été utilisée à une concentration de 20 ul / ml pour détecter l&#39; ARNm naissant Lfng. La dilution utilisée dans cette étape est dépendante de la sonde et nécessitera l&#39;optimisation. </li><li> Sceller la plaque en utilisant du ruban adhésif pour empêcher l&#39;évaporation et incuber les échantillons dans la solution de sonde pour deux nuits à 65 ° C. </li><li> En utilisant une pipette de Pasteur en plastique à pointe fine, récupérer la sonde pour la réutilisation et le stocker à 20 ° C. Rincer les échantillons deux fois avec préchauffé (65 ° C) post-mélange d&#39;hybridation (50% de formamide, 0,2% de Tween-20, et 1x SSC) avant de se laver les échantillons deux fois pour 20 minutes chacun à 65 ° C en pré- réchauffé post-mélange d&#39;hybridation. </li><li> Laver les échantillons pendant 15 min à 65 ° C dans un mélange d&#39;hybridation préchauffé à 50% dans 0,1% de Tween-20 dans une solution saline tamponnée au Tris (TBST). Rincer les échantillons deux fois avec du TBST avant lavage pendant 30 min à température ambiante dans du TBST sur une plate-forme à bascule. </li><li> Pré-incuber les explants dans blosolution tain (TBST + 2% de réactif de blocage du tampon (BBR) + 20% de sérum de chèvre traité à la chaleur) pendant un minimum de 2 heures. Remplacer cette solution avec une solution de blocage frais contenant une dilution 1: 200 de peroxydase de raifort (HRP) conjugué à un anticorps anti-digoxigénine. Incuber les échantillons O / N à 4 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation d&#39;anticorps, rincer les échantillons 3 fois avec du TBST à température ambiante et de les transférer à des puits individuels d&#39;une nouvelle plaque de 24 puits de culture tissulaire. Laver les explants avec TBST 3 fois pendant 1 h chacun. </li><li> À ce stade, transférer les échantillons dans 0,5 mL tubes de stockage ou les puits individuels d&#39;une plaque de culture de tissus à 48 puits pour réduire le volume nécessaire des tyramide amplification du signal (TSA) des réactifs de détection dans les étapes suivantes. </li><li> Incuber les échantillons dans un tampon d&#39;amplification TSA (voir la liste des réactifs) à température ambiante pendant 1 min sans agitation en utilisant un volume aussi faible que possible, en veillant à ce que les échantillons sont entièrement immergés dans la solution. </li><li> Ajouter réactif TSA (voir leListe des réactifs) dans le tampon d&#39;amplification de l&#39;échantillon à une dilution de 1:50. mélanger rapidement la solution jusqu&#39;à ce que le réactif TSA est répartie uniformément, couvrir la plaque ou les tubes dans une feuille d&#39;étain, et incuber les échantillons pendant 60 - 90 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer la solution d&#39;amplification TSA et laver les échantillons dans TBST 3 fois pendant 5 minutes chacun. Transférer les explants en arrière sur une plaque de culture tissulaire à 24 puits pour augmenter le volume de lavage, et on incube les échantillons à 1% de peroxyde d&#39;hydrogène dans du TBST pendant 1 h. Laver les échantillons avec TBST 3 fois pendant 5 min chacun, puis deux fois pendant 5 min chacun avec PBST avant d&#39;échantillonner de montage (voir étape 4). </li></ol> 4. Préparation de l&#39;échantillon pour l&#39;imagerie <ol><li> Préparer une lame de verre chargé d&#39;adhérence pour chaque paire d&#39;expiant par l&#39;addition de 0,12 mm d&#39;épaisseur des entretoises de formation d&#39;image, ce qui empêche les échantillons d&#39;être écrasées par l&#39;addition d&#39;une lamelle. Enlever le revêtement adhésif d&#39;une surface d&#39;une pièce d&#39;écartement et placer l&#39;adhésif vers le bas sur une lame de verre, une pression firmly pour sceller l&#39;élément d&#39;espacement sur la lame. NOTE: Pour les étapes restantes, s&#39;efforcer de conserver les échantillons en basse lumière ou dans l&#39;obscurité pour éviter photoblanchiment. Pipette explants paires sur une lame préparée en utilisant une pipette Pasteur en verre dans le centre de l&#39;entretoise, assurant que le côté disséqué de l&#39;expiant fait face à la diapositive. Arrangez paires controlatérale de explants côte à côte. </li><li> Retirez autant de liquide que possible de la diapositive à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre et évacuer toute humidité résiduelle entourant les échantillons en utilisant un morceau de papier de soie peu pelucheux plié. </li><li> Laisser les échantillons adhèrent à la diapositive 45 - 60 s, jusqu&#39;à ce que le tissu commence à apparaître collante et translucide. Pendant ce temps, retirez le revêtement adhésif restant de l&#39;entretoise en utilisant une pince. Ne pas laisser les échantillons sécher. </li><li> Ajouter une grosse goutte de milieu de montage à double fonction et d&#39;une solution de compensation (0,5% de p-phénylènediamine et du Tris 20 mM, pH 8,8, dans 90% de glycerol) aux échantillons dans le centrede l&#39;entretoise. NOTE: Cette solution vire au brun / noir lorsque autorisé à s&#39;oxyder. </li><li> Placer délicatement une lamelle couvre-objet circulaire (n. 1,5) pour les échantillons, en veillant à ce que le milieu de montage est uniformément répartie et que tous les bords de la lamelle en contact avec la pièce d&#39;écartement. Placez la glissière de couverture-glissé à l&#39;envers sur un papier de soie peu pelucheux. </li><li> Presser fermement pour faire en sorte que la lamelle adhère parfaitement à la pièce d&#39;écartement, et que tout excès de milieu de montage est retirée. Répétez jusqu&#39;à ce que aucun blots plus Mountant le papier. </li><li> Nettoyer et étiqueter la diapositive (s) de manière appropriée, et de les stocker dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;imagerie, à court terme à -20 ° C ou à long terme à -80 ° C. Après avoir retiré les diapositives de stockage, de leur permettre de dégeler complètement avant l&#39;imagerie. </li><li> Image les échantillons montés en utilisant un microscope confocal avec l&#39;acquisition carrelée et un objectif à fort grossissement. Image les paires d&#39;explants en utilisant un objectif à immersion d&#39;huile 40X à 4 um z intervalles en utilisant 488 nm, 568 nm et 647 nm li lasernes pour exciter les fluorophores verts, rouges, et bien-rouge, respectivement, utilisées pour les protéines et la détection de l&#39; ARNm dans cette étude 12. NOTE: carrelée images ont été cousues post-acquisition pour former une seule image pour l&#39;analyse. </li></ol> 5. Post-acquisition Analyse d&#39;image <ol><li> Utilisez un logiciel d&#39;analyse d&#39;image pour définir une région d&#39;intérêt dans le PSM de chaque échantillon expérimental. <ol><li> Pour quantifier les niveaux d&#39;expression, fond soustraction et images de seuil au niveau de non-primaire échantillon de contrôle avant la quantification ultérieure. Définir une origine, un axe et une longueur unitaire pour chaque échantillon. </li></ol></li><li> Calculer l&#39;intensité de fluorescence en fonction de la position le long de l&#39;axe rostro-caudale normalisée pour chacun des M échantillons 12. Après la normalisation des parcelles d&#39;intensité, placez le côté des profils d&#39;intensité à côte et obtenir une matrice d&#39;intensité f (i, j) qui décrit l&#39;intensité à l&#39;i <sup&gt; e position spatiale dans la j ième échantillon. </li></ol> 6. Commande temporelle des échantillons <ol><li> Pour déduire l&#39;ordre temporel d&#39;un composant connu d&#39;horloge, de définir sa matrice d&#39;intensité. Ensuite, réorganiser les colonnes de la matrice d&#39;intensité de façon à obtenir un motif périodique dans le temps. Pour ce faire, définir la fonction <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> où A (f j, k) représente la fonction d&#39;auto - corrélation de la j - ième colonne de f et A T est une fonction d&#39;auto - corrélation cible, choisi pour respecter la périodicité temporelle du motif donné par <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li> Utilisez le Metropolis-Hastings (ou un autre algorithme de minimisation) 12 pour identifier l&#39;ordre des échantillons qui minimisent la fonction g. Ainsi, déterminer l&#39;ordre duM échantillons qui maximise la périodicité temporelle d&#39;un composant connu d&#39;horloge. </li><li> Utilisation de l&#39;ordre temporel inférée des M échantillons, construire un kymographe commandé pour le motif d&#39;expression dans le canal 12 en partenariat. </li></ol>

<ol><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+embryos+with+oscillations%3A+structure%2C+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).</li>
<li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).</li>
<li>Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856(2008).</li>
<li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBailey%2C+C+%22Somitogenesis+in+Vertebrate+Development%22">Somitogenesis in Vertebrate Development</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).</li>
<li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/139/14/2453">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).</li>
<li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li>
<li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662(2009).</li>
<li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842(2015).</li>
<li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li>
<li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141(2012).</li>
<li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1%2C+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160(2007).</li>
<li>Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISHing+for+chick+genes%3A+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li>
<li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étapes critiques dans le Protocole Le présent protocole décrit une méthode sensible pour effectuer l&#39;analyse quantitative de l&#39;expression de la protéine et la dynamique oscillatoire de bas niveau dans les explants E10.5 souris PSM. Un protocole robuste pour les deux immunohistochimie et hybridation in situ fluorescente (FISH) est suivie par haute résolution toute monture imagerie confocale, puis par analyse d&#39;image et de la segmentation temporelle de kymographs pour générer une carte spatiotemporelle d&#39;expression de protéines à travers le PSM. Un rapport signal-bruit élevé dans la détection de la protéine et l&#39;ARNm est essentiel pour assurer le succès de cette technique. Des précautions doivent être prises pour échanger complètement toutes les solutions de manière efficace au cours des étapes de lavage et de maintenir la température de 65 ° C lavages C dans les phases pertinentes de l&#39;étape 3. Il est particulièrement avantageux de prendre le temps de se procurer des anticorps efficaces et des sondes d&#39;ARN contre la cibles d&#39;intérêt et de tester ces réactifsà fond sur des échantillons entiers monture avant de commencer ce protocole. Modifications et dépannage Les principaux problèmes qui peuvent être rencontrés lors de l&#39;exécution de ce protocole proviennent de faible résistance de détection de signal et de qualité. Cela dépend en grande partie de l&#39;efficacité des anticorps ou des sondes d&#39;ARN utilisées pour les immunohistochimie ou FISH étapes du protocole, respectivement. Un certain nombre de différentes étapes peut nécessiter une optimisation avant la détection de signal adéquate est obtenue. Une cause commune pour la détection du signal est faible fixation inadéquate; il est impératif que soit PFA frais ou PFA conservés à 4 ° C pendant plus d&#39;une semaine est utilisé pour fixer les échantillons. La longueur de fixation peut également nécessiter une optimisation, en fonction de la sonde de l&#39;anticorps ou de l&#39;ARN utilisé. Pour les anticorps, il est conseillé de suivre les instructions du fabricant lorsque cela est possible, alors que pour des sondes d&#39;ARN, nous vous conseillons la consultation de la littérature publiée. Lfng. En raison de son manque relatif de l&#39; abondance, la détection de Lfng pré-ARNm nécessite une longue période d&#39;incubation avec la sonde dans le mélange d&#39;hybridation contenant du citrate de sodium salin 5x (SSC) pour une bonne détection de signal. Les mêmes conditions peuvent appliquer à d&#39; autres sondes qui détectent les ARNm faiblement exprimées, mais dans notre expérience, la détection de cibles d&#39;ARNm plus stables peuvent nécessiter une étape plus courte sonde d&#39;hybridation et des concentrations plus faibles de la SSC dans le mélange d&#39;hybridation (par exemple, 1,3x SSC). Pour les deux immunohistochimie et FISH, le protocole doit d&#39;abord être optimisé sur des embryons entiers, et la concentration optimale d&#39;anticorps ou de la sonde doit être déterminée de manière empirique. Limites de la technique Comme mentionné ci-dessus, le succès de cette technique dépend fortement de la qualité de la protéine et la détection de l&#39;ARNm. We ont présenté plusieurs suggestions quant à la façon dont les protéines et la détection de l&#39;ARNm peut être améliorée, mais en l&#39;absence de détection de signal fluorescent de haute qualité, il n&#39;y a aucun moyen de l&#39;expérience peut se poursuivre. Le nombre de cibles protéiques qui peuvent être analysées dans chaque échantillon de tissu est limité par la résolution spectrale du microscope confocal et par les épitopes des anticorps utilisés. Dans cette étude, nous avons pu utiliser jusqu&#39;à trois épitopes pour la détection de la protéine à côté d&#39; une tache d&#39;ADN sur chaque échantillon 12. Ce protocole ne permet la détection d&#39;un ARNm cible, bien que les méthodes alternatives actuelles pourraient être employées pour augmenter ce jusqu&#39;à trois cibles 14. Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives La méthode décrite ici fournit une technique sensible pour détecter les fluctuations de protéines de bas niveau dans des explants entiers de montage PSM. La quantification de ces dynamiques estpossible en effectuant FISH pour un gène d&#39;horloge connu dans explants controlatérale correspondant. Une bibliothèque de kymographs est généré qui peut être organisée sur un cycle d&#39;horloge de segmentation, mettant en évidence la dynamique d&#39;expression spatio-temporelle d&#39;une cible d&#39;intérêt dans ce laps de temps. Une différence essentielle de cette technique par rapport aux autres est l&#39;utilisation de l&#39;automatisation informatique pour commander temporellement grands ensembles de données, ce qui permet la dynamique d&#39;expression spatio-temporelle des nouveaux composants d&#39;horloge à analyser d&#39;une manière impartiale. Par exemple, cette technique a donné un aperçu de la façon dont DLL1 et Notch1 protéines et leurs oscillations sont co-régulé sur l&#39;ensemble du PSM. Des méthodes alternatives dans ce contexte ont également invoqué immunocoloration, mais ils ne pas détecter les petites fluctuations dans DLL1 et Notch1 niveaux de protéines dans le PSM caudale qui étaient évidentes en utilisant cette méthode. Au lieu de cela, ils ont rapporté un gradient constant d&#39;expression qui est la plus forte dans la région rostrale 9 <sup&gt;, 10, 11. Cela pourrait être dû au fait que ce protocole a une période plus longue de l&#39;anticorps primaire d&#39;incubation (3 - 5 jours, par opposition à une nuit), ce qui peut être nécessaire pour détecter des niveaux inférieurs de protéine. Comme les niveaux de DLL1 et d&#39;expression Notch1 sont relativement élevés dans le PSM rostrale, cela peut avoir influencé les auteurs à l&#39;image des échantillons à une exposition plus faible réglage que seraient nécessaires pour détecter l&#39;expression de la protéine caudale. Une autre différence de potentiel provient de l&#39;utilisation d&#39; un tissu non fixé dans l&#39;étude de Chapman et al. , Dans lequel l&#39;expression transitoire de DLL1 et Notch1 dans le PSM caudale peut avoir été moins bien conservé 9. Applications futures ou les directions après Maîtriser la technique Une fois que ce protocole a été maîtrisé, l&#39;analyse de l&#39;expression à haut débit peut être effectuée pour toute protéine d&#39;intérêt dans le PSM.explants PSM générés à partir de plusieurs portées de souris peuvent être traitées à la fois pour générer le nombre nécessaire pour l&#39;analyse de l&#39;échantillon élevé. Bien que nous n&#39;avons utilisé des embryons de type sauvage dans ces études, il est possible d&#39;effectuer cette analyse en utilisant des embryons génétiquement modifiés afin d&#39;évaluer l&#39;importance d&#39;un ou plusieurs facteurs sur la dynamique d&#39;expression de protéines. Au-delà du PSM, ce protocole peut être adapté à d&#39;autres systèmes qui se composent de deux moitiés controlatéral et peuvent être utilisés pour détecter avec sensibilité et expression de la protéine oscillatoires dynamique de bas niveau. Un exemple pour lequel ce protocole peut être adapté est l&#39;étude de l&#39; expression des protéines dynamique dans le tube neural de la souris, puisque les moitiés controlatérale ont pu être générées et mises en culture et l&#39; activité de Notch a été démontré à la fois présent et important pour motif 15. Nous encourageons d&#39;autres groupes afin d&#39;adapter ce protocole à d&#39;autres systèmes et de fournir une rétroaction pour l&#39;amélioration future.

Somites sont les premiers segments formés dans l&#39;axe du corps d&#39;allongement dans le développement des espèces de vertébrés et sont les précurseurs de la colonne vertébrale, les côtes et le derme du tissu, ainsi que des muscles et des cellules endothéliales. Pendant somitogenèse, somites épithéliales se forment à partir du mésoderme non segmenté présomitique (PSM) (examiné dans la référence 1). Ce processus est régi par la «horloge de segmentation&quot;, qui se compose d&#39;un réseau de gènes oscillatoires et des protéines, la plupart appartenant à la voie de signalisation Notch. L&#39;horloge de segmentation se compose de différentes boucles de rétroaction négative, qui permettent la production pulsatile de l&#39; activité de Notch dans une seule cellule 2 (revue dans les références 3-6). Bien que la méthode intracellulaire d&#39;oscillation est bien caractérisée, il est encore largement inconnu comment ces oscillations sont coordonnées à travers le tissu de PSM. Il a été récemment montré par les études expérimentales et théoriques, que ces oscillations sont Yessential au processus de somitogenèse et que la voie Notch joue un rôle crucial dans le processus de segmentation à la fois et l&#39; expression génique oscillatoire 7, 8. Cependant, il a été largement rapporté que le récepteur Notch 1 (Notch1) et le ligand Delta-like (Dll) -1 ont des gradients statiques dans le PSM 9, 10, 11. Nous émettons l&#39;hypothèse que les oscillations de Notch dépendant de l&#39;horloge du PSM de segmentation dépendent de l&#39;activation périodique du récepteur principal de la voie Notch et le ligand, et Notch1 DLL1, respectivement, dans le PSM de la souris. Les conclusions des études précédentes qui ont rapporté un gradient de rostrale-caudale statique de ces protéines étaient dues, nous prévoyons, à un manque de sensibilité dans les techniques de immunocoloration. Ils étaient donc incapables de détecter des fluctuations de faible niveau de DLL1 et Notch1 dans le PSM caudale. Nous avonse a conçu une méthode pour examiner de plus près ces facteurs, combinant des données expérimentales avec la modélisation mathématique pour prédire un mécanisme par lequel les oscillations des protéines des composants d&#39;horloge sont coordonnées à travers le PSM 12. L&#39;objectif global de cette méthode est de détecter et de quantifier bas niveau, l&#39; expression dynamique des protéines dans le PSM et de cartographier les profils d&#39;expression des protéines d&#39;intérêt selon l&#39;expression du gène d&#39;horloge connu, frange Lunatic (Lfng). Depuis un cycle de l&#39;horloge de segmentation dans l&#39;embryon de souris prend 2 h pour terminer, divers échantillons sont nécessaires pour construire un profil complet de spatiotemporelle DLL1 et Notch1 expression de la protéine lors d&#39; une oscillation Lfng dans le PSM. Nous avons donc mis au point ce protocole pour permettre la détection à haut débit de l&#39;expression des protéines de bas niveau dans l&#39;ensemble du montage, explants PSM controlatéral. Cependant, cette technique peut également être utile pour les études de tchapeau visent à caractériser la dynamique des protéines de bas niveau au sein de tout tissu embryonnaire qui peut être divisé en deux moitiés controlatéral.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade ;-1 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, qualifié, approuvé par l’UE, origine Amérique du Sud</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF humain recombinant (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr> Anticorps <tr><td>monoclonal anti-souris Notch1</td><td></td><td></td> (ThermoFisher Scientific)15140122 Anticorps polyclonal anti-rat Dll1^ S.O.O.552466 <td></td></tr><tr><td>S.O.</td><td></td><td></td><<td></td></tr><tr><td>em>Lfng Sonde d’ARN antisens intronique^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 16 %<td></td></tr><tr><td> paraformaldéhyde</td><td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K, recombinante, grade PCR&nbsp ;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>31158</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Fabriqué en interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS) (traité thermiquement)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>16210072&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Citrate salin de sodium (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>101095</td><td></td></tr><tr><td>héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au tris (TBS)</td><td>Fabriqué en interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Réactif tampon de blocage&nbsp ;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>anticorps conjugué anti-DIG au harfort peroxydase (HRP)</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11207733910 kit d’amplification</td><td></td></tr><tr><td>du signal Tyramide (TSA)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL744001KT</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*L’anticorps Dll1 et la sonde d’ARN utilisés dans cette étude ne sont pas disponibles dans le commerce. Veuillez consulter les remerciements pour les sources.</td></tr><tr><td colspan="4">^Les sondes d’anticorps/ARN doivent être sourcées de manière à s’appliquer aux intérêts de recherche du lecteur.</td></tr></tbody></table>

commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée plans

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Au cours de la somitogenèse, des paires de somites épithéliales se forment de manière progressive, bourgeonnant à partir de l’extrémité antérieure du mésoderme pré-somitique (PSM) avec une périodicité stricte spécifique à l’espèce. La périodicité du processus est régulée par un oscillateur moléculaire, connu sous le nom d'« horloge de segmentation », qui agit dans les cellules PSM. Cette horloge pilote les modèles oscillatoires de l’expression des gènes à travers le PSM dans une direction postéro-antérieure. Ces gènes dits de l’horloge sont des composants clés de trois voies de signalisation : Wnt, Notch et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF). De plus, la signalisation Notch est essentielle pour synchroniser les oscillations intracellulaires dans les cellules voisines. Nous avons récemment eu un aperçu de la façon dont cela peut être régulé mécaniquement. Lors de l’activation du ligand, le récepteur Notch est clivé, libérant le domaine intracellulaire (NICD), qui se déplace vers le noyau et régule l’expression des gènes. La NICD est très labile et son renouvellement dépendant de la phosphorylation agit pour restreindre la signalisation Notch. Le profil de production (et de dégradation) de NICD dans le PSM est connu pour être oscillatoire et ressembler à celui d’un gène de l’horloge. Nous avons récemment rapporté que le récepteur Notch et le ligand Delta, qui interviennent dans le couplage intercellulaire, présentent eux-mêmes une expression dynamique à la fois au niveau de l’ARNm et de la protéine. Dans cet article, nous décrivons les méthodes de détection sensibles et les outils d’analyse d’images détaillés que nous avons utilisés, en combinaison avec la modélisation informatique que nous avons conçue, pour extraire et superposer des données d’expression à partir de points distincts du cycle d’expression. Cela nous a permis de construire une image spatio-temporelle du profil d’expression dynamique du récepteur, du ligand et des gènes de l’horloge cible Notch tout au long d’un cycle d’oscillation. Nous décrivons ici les protocoles utilisés pour générer et cultiver les explants de PSM, ainsi que la procédure de coloration de l’ARNm ou de la protéine. Nous expliquons également comment les images confocales ont ensuite été analysées et ordonnées temporellement par calcul pour générer des séquences ordonnées d’instantanés d’expression d’horloge, ci-après définies comme des « kymographes », pour la visualisation de l’expression spatio-temporelle de Delta-like1 (Dll1) et Notch1 dans tout le PSM.

Ce protocole permet de visualiser le profil spatio - temporel d&#39;une protéine d&#39;intérêt le long de la transcription du gène d&#39;horloge dans le PSM 12 souris. Par exemple, DLL1 (figure 1A-C) et Notch1 (figure 1D-F) expression de la protéine sont montrées à osciller sur synchronie avec la transcription naissante du gène Notch segmentation horloge régulée Lfng. Quantification de la DLL1, Notch1 et Lfng (i) d&#39;intensité du signal par rapport à l&#39;axe antéro-postérieur (AP) de la MSP (figure 1G) révèle la dynamique d&#39;expression oscillatoires claires pour ces cibles (Figure 1 H-J). Le profil spatiotemporelle de DLL1 et Notch1 expression de la protéine tout au long du cycle d&#39;horloge sont clairement visualisé et quantifié en utilisant ce protocole par le post-acquisition analyse d&#39;image des données d&#39;image fixe tissu à haute résolution. Figure 1: Visualisation spatio-temporelle et la quantification des DLL1 et Notch1 Protein Expression Dynamics. (AF) paires d&#39;explants de six embryons E10.5 (AF) montrant la distribution spatiale des protéines DLL1 (AC) ou d&#39;une protéine Notch1 (DF) dans une moitié le long de la détection de Lfng pré-ARNm (Lfng (i)) dans la la moitié controlatérale de chaque paire correspondante. Les panneaux sont disposés suivant la Phase 1 (A et D), la phase 2 (B et E) et la phase 3 (C et F) du cycle de segmentation d&#39;horloge, telle que déterminée par le profil spatial de Lfng : (i) l&#39; expression. L&#39;étendue des domaines d&#39;expression pour DLL1 (vert), Notch1 (rouge), et Lfng (i) (gris) le long de l&#39;axe antéro-postérieur du PSM ont been délimité par des barres de couleur. Les lignes en pointillés délimitent les positions des somites plus récemment formé (s), les bords extérieurs du PSM et le tissu nerveux adjacent (C et E). Les barres d&#39;échelle ( en bas à gauche de chaque panneau, AF) représentent 100 um. (G) Une parcelle d&#39;intensité exemple illustrant la variation axiale de l&#39;intensité du signal à travers le PSM. Les données sont tracées à partir de deux paires explants montrant Lfng pré-ARNm (ligne hachée noir) dans un explant par rapport à la protéine Notch1 (rouge) dans l&#39;expiant controlatéral (Embryo 1), ainsi que Lfng pré-ARNm (noir ligne continue) en une autre explant par rapport à la protéine DLL1 (vert) dans l&#39;expiant controlatéral (Embryo 2). intensité du signal mesuré (axe y) est représenté en fonction position axiale (axe x; antérieur PSM [A] à droite et postérieure PSM [P] à gauche). (H) un kymographe montrant la répartition spatiale des DLL1, Notch1 et Lfng (i) à traversde nombreux PSMs. Chaque ligne de la kymographe représente l&#39;intensité de signal d&#39;un explant PSM individuel. Les rangées sont disposées en séquence temporelle selon la répartition spatio - temporelle des Lfng pré-ARNm (I) La répartition spatio - temporelle des DLL1, Notch1 et Lfng (i) à travers de multiples oscillations d&#39;horloge est simulée par l&#39;extension périodique des données présentées dans (H) , mettant en évidence la nature oscillatoire de DLL1 et Notch1 dynamique d&#39;expression. (J) pulsatile Notch1 expression de la protéine dans le PSM caudale est mis en évidence par grossissement de la région délimitée dans le kymographe virtuel représenté en (I). Modifié de Référence 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> Figure 2: Quantification de la dynamique spatio-temporelle de DLL1 et Notch1 Protein Expression. (A) Une parcelle par exemple d&#39;intensité représente la variation axiale de l&#39;intensité du signal à travers le PSM. Les données tracées à partir de deux paires explants montrant Lfng pré-ARNm (ligne hachée noir) dans un explant par rapport à la protéine Notch1 (rouge) dans la moitié des explants controlatéral, ainsi que Lfng pré-ARNm (noir ligne continue) dans un demi - explant d&#39;un deuxième queue par rapport à la protéine DLL1 (vert) dans la moitié des explants controlatéral de la seconde queue. intensités mesurées (y-axe) sont tracées en fonction position axiale (axe x; rostrale [A] à droite et caudale [P] à gauche). (BH) Kymographs montrent la distribution spatiale des Notch1, DLL1, NICD et Lfng (i) à travers de nombreux PSMs. (B et C) NICD (B) et DLL1 (C) expression dans les sections PSM; (D et E) Lfng (i) (D) et DLL1 (&lt;strong&gt; E) dans les moitiés d&#39;explants controlatérale; (F et G) Lfng (i) (F) et Notch1 (G) dans les moitiés d&#39;explants controlatéral. De Référence 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’horloge de segmentation pilote l’expression des gènes oscillatoires à travers le mésoderme pré-somitique (PSM). L’activité Dynamic Notch est la clé de ce processus. Nous utilisons l’imagerie et les analyses computationnelles pour extraire la dynamique temporelle des données d’expression spatiale afin de démontrer que l’expression du ligand Delta et du récepteur Notch oscille chez le PSM des vertébrés.

Commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée Plans

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique du « horloge de segmentation » chez les vertébrés à l'aide d'échantillons de tissus fixés. Cette méthode permet une évaluation impartiale de la dynamique oscillatoire des gènes dans le mésoderme présomitique, ce qui est essentiel pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la somatogenèse chez les vertébrés. Le principal avantage de cette technique est que de nombreux échantillons peuvent être produits et traités simultanément, permettant une analyse tripartite approfondie de la dynamique de l'expression génique sur tissus fixés.Le Dr Charlotte Bailey, ancienne postdoctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir obtenu un cornet utérin de souris selon le protocole décrit, utilisez des ciseaux courbes sous un microscope stéréo pour couper la membrane musculaire épaisse du cornet utérin et extraire soigneusement chaque embryon. À l’aide de ciseaux courbes et de pinces fines, disséquez la membrane amniotique de chaque embryon.Ensuite, à l’aide d’une aiguille chirurgicale ou de ciseaux courbes, prélevez le tissu caudal de chaque embryon en coupant l’embryon juste en avant des bourgeons des membres postérieurs. Placez le tissu caudal avec le côté ventral vers le bas. Ensuite, générez des paires d’explants de mésoderme présomptif de la queue (PSM) en divisant le tissu caudal en deux moitiés le long de la ligne médiane, à l’aide d’un mouvement doux de balancement avec l’aiguille.Veillez à ce que le tube neural, la notocorde et le tissu du MRP soient également répartis entre les deux explants. Ensuite, aspirez chaque explant de MRP controlatéral à l’aide d’une pipette et déposez-le sur la face inférieure du couvercle d’une boîte de culture plastique de 35 mm, dans un petit volume de milieu de culture préchauffé. Placez la boîte sur le dessus du couvercle, puis retournez rapidement l’ensemble afin que le tissu du MRP soit suspendu au couvercle dans une goutte pendante de milieu.Ensuite, cultiver les explants de MPR dans une enceinte humide à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Transférer des paires d'explants de MPR dans les puits individuels d'une plaque de culture tissulaire 24 puits. Puis ajouter du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS aux échantillons et incuber la plaque à température ambiante pendant une heure, ou à quatre degrés Celsius sur une plateforme agitée pendant la nuit.Après l'incubation, utiliser du PBS pour laver les puits d'échantillons à température ambiante sur une plateforme agitée. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique fine, remplacer la solution de PBS sur les échantillons trois à quatre fois. Pour réaliser l’immunohistochimie, ajouter du PBS contenant 2 % de Triton X-100 à un explant de PSM provenant de chaque paire embryonnaire et incuber les échantillons à température ambiante sur une plateforme agitée pendant une heure afin de les laver.Rincez brièvement les échantillons avec du PBS. Remplacez ensuite le PBS par la solution de blocage et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius sur une plateforme agitée pendant la nuit. Diluez les anticorps primaires souhaités dans du tampon de travail.Dans cet exemple, des anticorps dirigés contre Delta-like 1 et Notch1 sont utilisés à une dilution de 1:25. Ajoutez les anticorps aux explants et incubez les échantillons sur une plateforme agitée à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Après l'incubation, utilisez du PBS pour laver les échantillons deux fois, cinq à dix minutes chacun.Effectuez ensuite trois lavages avec du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 à température ambiante sur une plateforme agitée. Après dilution des anticorps secondaires dans le tampon de travail, ajoutez entre 250 et 500 microlitres de la solution d'anticorps dans chaque puits d'échantillon, en prenant soin de ne pas utiliser les derniers microlitres de solution, qui pourraient contenir des agrégats d'anticorps. Recouvrez la plaque de papier d'aluminium et incubez les échantillons dans la solution d'anticorps secondaires à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours.Après l'incubation, laver les échantillons deux fois avec du PBST, dix minutes chacun. Ensuite, laver le tissu une fois avec du PBS à température ambiante sur une plateforme agitée pendant cinq minutes. Conformément au protocole décrit, déshydrater et réhydrater les explants de PSM controlatéraux restants selon une série de dilutions d'éthanol dans du PBST.Ajouter dix microgrammes par millilitre de protéinase K dans du PBST à 0,1 % aux explants, puis incuber le tissu sans agitation pendant cinq minutes. Ensuite, retirer rapidement la solution de protéinase K et rincer brièvement les échantillons avec du PBST. Ajouter 4 % de formaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBST aux explants de PSM afin de les postfixer, puis incuber les échantillons pendant 30 minutes.Ensuite, après avoir lavé les échantillons deux fois avec du PBST pendant dix minutes chacun, ajouter le mélange d'hybridation à 50 % au tissu et incuber à 65 degrés Celsius sans agitation pendant dix minutes. Après avoir incubé les échantillons et le mélange d'hybridation conformément au protocole indiqué, retirer la solution et ajouter de 0,25 à 0,5 millilitre de mélange d'hybridation préchauffé contenant une sonde d'ARN antisense marquée à la digoxigénine dirigée contre un composant connu de l'horloge de segmentation. Utiliser du ruban adhésif pour sceller la plaque et incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant deux nuits.Après l'incubation, utiliser le mélange d'hybridation à 50 % préchauffé dans du TBST pour laver les échantillons pendant 15 minutes. Ensuite, rincer les échantillons deux fois avec du TBST avant d'incuber le tissu dans du TBST à température ambiante sur une plateforme agitée pendant 30 minutes. Puis, pré-incuber les explants dans la solution de blocage pendant au moins deux heures.Ensuite, remplacez la solution par une solution de blocage fraîche, contenant une dilution à 1:200 d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la HRB. Incubez les échantillons à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, rincez les échantillons trois fois avec du TBST à température ambiante et transférez-les dans des puits individuels d'une nouvelle plaque de culture tissulaire de 24 puits.Ensuite, laver les explants trois fois avec du TBST, pendant une heure chacun. Utiliser un kit d'amplification du signal par tyramide pour visualiser l'ARNm détecté avant de préparer les échantillons pour l'imagerie. Préparer une lame en verre adhésive chargée pour chaque paire d'explants en retirant le film adhésif d'un espaceur d'imagerie d'une épaisseur de 0,12 mm et en le collant sur une lame en verre.Après avoir positionné une paire d'explants sur la lame selon le protocole décrit, laissez les échantillons adhérer à la lame pendant 45 à 60 secondes, jusqu'à ce que le tissu commence à paraître collant et translucide sans s'assécher complètement. Pendant ce temps, utilisez une pince pour retirer le film adhésif restant du séparateur et ajoutez une grande goutte de milieu de montage à double fonction et de solution de clarification au centre des échantillons situés dans le séparateur. Placez une lamelle circulaire sur les échantillons en veillant à ce que le milieu de montage soit uniformément réparti et que tous les bords entrent en contact avec le séparateur.Ensuite, placer la lame recouverte de lamelle à l’envers sur du papier peu pelucheux. Appuyer fermement pour s’assurer que la lamelle adhère complètement à l’espaceur et que tout excès de milieu de montage est éliminé. Répéter ce processus jusqu’à ce qu’aucun milieu de montage ne tache plus le papier.Nettoyez et étiquetez la lame, puis stockez-la à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie. Ensuite, réalisez l’imagerie et l’analyse conformément au protocole écrit. Dans cette expérience, l’expression des protéines Delta-Like 1 et Notch1 est montrée comme oscillant de manière asynchrone, en organisant temporairement les embryons selon la transcription naissante du gène de la pendule de segmentation régulé par Notch, lunatic fringe intronique, détectée dans une moitié de chaque paire d’explant.Les panneaux sont organisés selon les phases une, deux et trois du cycle de l'horloge de segmentation. L'étendue des domaines d'expression de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique le long de l'axe antéropostérieur du mésoderme présomptif (PSM) est délimitée par des barres codées par couleur. Comme indiqué ici, un graphique est généré afin de quantifier l'intensité du signal de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique par rapport à l'axe antéropostérieur du PSM, illustrant ainsi la variation axiale et l'intensité du signal à travers le PSM durant tout le cycle de l'horloge.Les kymographies visualisent la répartition spatiale de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique au sein de nombreux PSM. Chaque ligne de la kymographie représente l'intensité du signal d'un explant individuel de PSM. La quantification de l'intensité du signal de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique par rapport à l'axe antéropostérieur du PSM révèle des dynamiques d'expression clairement oscillatoires pour ces cibles.Enfin, ces kymogrammes montrent la distribution spatiale de la forme clivée et activée du récepteur Notch (NICD), de Delta-Like 1, de lunatic fringe intronique et de Notch1 à travers de nombreux mésoderme présomitique (PSM). Cette technique a aidé les chercheurs dans le domaine de la mitogenèse des vertébrés à mieux comprendre la dynamique des oscillations des gènes de segmentation dans le mésoderme présomitique de poulet et de souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à un grand nombre d'échantillons, permettant d'analyser simultanément les profils d'expression de plusieurs ARNm et protéines d'intérêt.Après cette procédure, une quantification supplémentaire des données d'image peut permettre de comprendre les retards temporels dans l'expression génique ainsi que la localisation subcellulaire des signaux d'ARN et de protéine d'intérêt pour le chercheur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique du « horloge de segmentation » chez les vertébrés à l'aide d'échantillons tissulaires épais. Cette étape peut être suivie par une analyse automatisée des images, comme décrit dans le protocole écrit.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer d'une répartition équitable du mésoderme présomptif (PSM), de la notocorde et du tube neural entre les explants de PSM, et de bien optimiser les dilutions des anticorps avant de commencer. N'oubliez pas que l'utilisation de formamide, de paraformaldéhyde et de glutaraldéhyde peut être extrêmement dangereuse. Veillez à porter des équipements de protection individuelle et à travailler sous hotte aspirante lorsque cela est nécessaire.

temporal-ordering-dynamic-expression-data-from-detailed-spatial

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous rapportons une méthode pour l'introduction, le suivi et l'analyse quantitative de l'expression de GFP dans les cellules végétales. Cette méthode utilise un système conçu sur mesure pour la robotique collection d'images en semi-continu d'un grand nombre d'échantillons, au fil du temps. Nous démontrons également l'utilisation d'ImageJ et ImageReady pour l'analyse des séries d'images.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Nous proposons une méthode basée sur la formation d' image par immunofluorescence pour la localisation spatiale et temporelle de ERK actif dans le disséqué C. gonades elegans. Le protocole décrit ici peut être adapté à la visualisation de toute signalisation ou d'une protéine structurelle du C. elegans gonades, pourvu d' un réactif d'anticorps convenable est disponible.

Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

Présenté ici est un protocole pour la microdésection laser-capture (LCM) des tissus végétaux. LCM est une technique microscopique pour isoler les zones de tissu d’une manière sans contamination. La procédure comprend la fixation des tissus, l’incorporation de paraffine, la sectionnement, l’extraction de LCM et d’ARN. L’ARN est utilisé dans l’analyse spécifique aux tissus en aval et résolue temporellement des transcriptomes.

Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

Ici, nous décrivons un protocole de réglage fin des régions d’intérêt (ROI) pour les technologies Spatial Omics afin de mieux caractériser le microenvironnement tumoral et d’identifier des populations cellulaires spécifiques. Pour les tests protéomiques, des protocoles personnalisés automatisés peuvent guider la sélection du retour sur investissement, tandis que les tests transcriptomiques peuvent être affinés en utilisant des retours sur investissement aussi petits que 50 μm.

Profilage spatial de l’expression des protéines et de l’ARN dans les tissus : une approche pour affiner la microdissection virtuelle

Cet article présente un protocole d’utilisation de DeepSpaceDB, une base de données dynamique et interactive pour la transcriptomique spatiale, proposant des flux de travail d’analyse et des exemples pour explorer l’organisation des tissus et l’expression des gènes liés à la maladie.

Exploitation de jeux de données de transcriptomique spatiale à l’aide de DeepSpaceDB

Ce protocole présente un flux de travail reproductible pour l'analyse de données de transcriptomique spatiale, guidant les utilisateurs depuis l'acquisition de données publiques et le contrôle qualité basé sur Seurat jusqu'à l'intégration, la détection de caractéristiques spatiales, la déconvolution des types cellulaires, l'annotation de régions d'intérêt et l'analyse des communications cellule-cellule, avec des points de contrôle pratiques qui soutiennent une exécution transparente.

Un flux de travail pratique pour l'analyse des données de transcriptomique spatiale : de l'acquisition des données aux analyses avancées

Cette étude présente un protocole multiome spatial Trekker–CUT&amp;Tag combinant le codage à barres spatial direct d’une section tissulaire avec l’analyse multiome unicellulaire. Cette approche permet simultanément un profilage spatial de l’expression génique par une seule cellule et la modification de l’histone H3K27ac, offrant des perspectives mécanistes sur la régulation génique dans le contexte de la microanatomie tissulaire.

Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

L'expression de protéines fluorescentes en Branchiostoma lanceolatum Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

Découvrez une méthode computationnelle pour cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique dans l'horloge de segmentation vertébrée. Cette technique permet d'analyser simultanément de nombreux échantillons de mésoderme présomitique fixé.

Commande temporelle des données d'expression dynamique d'expression spatiale détaillée Plans

Explorer plus de vidéos