Commande temporelle des données d'expression dynamique d'expression spatiale détaillée Plans

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de cartographier la dynamique spatio-temporelle de l’expression génique de l’horloge de segmentation des vertébrés à l’aide d’un échantillonnage de tissus fixes. Cette méthode permet une évaluation impartiale de la dynamique des gènes oscillatoires dans le mésoderme présomitique, ce qui est crucial pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la somatogenèse des vertébrés. Le principal avantage de cette technique est que de nombreux échantillons peuvent être générés et traités simultanément, ce qui permet une analyse en trois parties de la dynamique d’expression génique dans les tissus fixés.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Charlotte Bailey, qui est une ancienne post-doctorante dans mon laboratoire. Après avoir obtenu une corne utérine de souris selon le protocole de texte, sous un stéréomicroscope, à l’aide de ciseaux incurvés, coupez l’épaisse membrane musculaire de la corne utérine et extrayez soigneusement chaque embryon. À l’aide de ciseaux incurvés et d’une pince fine, disséquez le sac amniotique de chaque embryon.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille chirurgicale ou de ciseaux incurvés, prélevez le tissu de la queue de chaque embryon en coupant l’embryon en avant des bourgeons des membres arrière. Équilibrez le tissu de la queue, côté ventral vers le bas. Générez ensuite des paires d’explants de PSM en disséquant le tissu de la queue en deux moitiés le long de la ligne médiane, en utilisant un léger mouvement de balancement avec l’aiguille.

Assurez-vous que le tube neural, la notocorde et le tissu PSM sont répartis à parts égales entre les deux explants. Ensuite, pipetez chaque explant controlatéral de PSM sur la face inférieure d’un couvercle de boîte de culture en plastique de 35 mm dans un petit volume de milieu de culture préchauffé. Placez le plat sur le dessus du couvercle et retournez-le rapidement, de sorte que le tissu PSM soit suspendu au couvercle dans une goutte suspendue de moyen.

Ensuite, cultivez les explants de PSM dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Transférer des paires d’explants de PSM dans les puits individuels d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Ajoutez ensuite 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS aux échantillons et incubez la plaque à température ambiante pendant une heure, ou à quatre degrés Celsius sur une plate-forme à bascule pendant la nuit.

Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les puits d’échantillons à température ambiante sur une plate-forme à bascule. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique fin, échangez la solution PBS sur les échantillons trois à quatre fois. Pour réaliser une immunohistochimie, ajoutez 2 % de Triton X-100 dans du PBS à un explant de PSM de chaque paire embryonnaire et incubez les échantillons à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant une heure pour les laver.

Utilisez du PBS pour rincer brièvement les échantillons. Remplacez ensuite le PBS par une solution bloquante et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius sur une plate-forme à bascule pendant la nuit. À l’aide d’un tampon de travail, diluez les anticorps primaires souhaités.

Dans cet exemple, les anticorps dirigés contre Delta-like 1 et Notch1 sont utilisés à une dilution de 1:25. Ajoutez les anticorps aux explants et incubez les échantillons sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les échantillons deux fois pendant cinq à dix minutes chacune.

Effectuez ensuite trois lavages dans 0,3 % Triton X-100 dans PBS à température ambiante sur une plate-forme à bascule. Après avoir dilué les anticorps secondaires dans un tampon de travail, ajoutez bien 250 à 500 microlitres de la solution d’anticorps à chaque échantillon, en prenant soin de ne pas utiliser les derniers microlitres de solution, qui peuvent contenir des agrégats d’anticorps. À l’aide d’une feuille d’étain, couvrez la plaque et incubez les échantillons dans une solution d’anticorps secondaire dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours.

Après l’incubation, utilisez PBST pour laver les échantillons deux fois pendant dix minutes chacune. Ensuite, utilisez du PBS pour laver le mouchoir une fois à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant cinq minutes. Conformément au protocole textuel, déshydrater et réhydrater les explants controlatéraux de PSM restants par une série de dilutions d’éthanol PBST.

Ajoutez dix microgrammes par millilitre de protéinase K dans 0,1 % de PBST aux explants et incubez le tissu sans agitation pendant cinq minutes. Ensuite, retirez rapidement la solution de protéinase K et utilisez le PBST pour rincer brièvement les échantillons. Ajoutez 4 % de formaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBST aux explants de PSM pour les postfixer et incuber les échantillons pendant 30 minutes.

Ensuite, après avoir utilisé le PBST pour laver les échantillons deux fois pendant dix minutes chacune, ajoutez un mélange d’hybridation à 50 % au tissu et incubez à 65 degrés Celsius sans agitation pendant dix minutes. Après avoir incubé les échantillons et le mélange d’hybridation conformément au protocole de texte, retirez la solution et ajoutez 0,25 à 0,5 millilitre de mélange d’hybridation préchauffé contenant une sonde d’ARN antisens marquée à la digoxigénine contre un composant d’horloge de segmentation connu. Utilisez du ruban adhésif pour sceller la plaque et incubez les échantillons à 65 degrés Celsius pendant deux nuits.

Après l’incubation, utilisez un mélange d’hybridation à 50 % préchauffé dans du TBST pour laver les échantillons pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez TBST pour rincer les échantillons deux fois avant d’incuber le tissu dans TBST à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant 30 minutes. Ensuite, pré-incubez les explants dans une solution bloquante pendant au moins deux heures.

Remplacez ensuite la solution par une solution bloquante fraîche, contenant une dilution de 1:200 d’anticorps anti-digoxigénine conjugué HRB. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez le TBST pour rincer les échantillons trois fois à température ambiante et les transférer dans des puits individuels d’une nouvelle plaque de culture tissulaire de 24 puits.

Ensuite, avec TBST, lavez les explants trois fois pendant une heure chacune. Utilisez un kit d’amplification du signal tyramide pour visualiser l’ARNm détecté avant de préparer les échantillons pour l’imagerie. Préparez une lame de verre à adhérence chargée pour chaque paire d’explants en retirant la doublure adhésive d’une entretoise d’imagerie de 0,12 mm d’épaisseur et en la collant sur une lame de verre.

Après avoir positionné une paire ou des explants sur la lame conformément au protocole textuel, laissez les échantillons adhérer à la lame pendant 45 à 60 secondes, jusqu’à ce que le tissu commence à apparaître collant et translucide sans se dessécher complètement. Pendant ce temps, à l’aide d’une pince, retirez la doublure adhésive restante de l’entretoise et ajoutez une grosse goutte de support de montage à double fonction et de solution de clarification sur les échantillons au centre de l’entretoise. Appliquez une lamelle circulaire sur les échantillons en veillant à ce que le milieu de montage soit uniformément réparti et que tous les bords entrent en contact avec l’entretoise.

Placez ensuite la lamelle à l’envers sur du papier à faible peluche. Appuyez fermement pour vous assurer que la lamelle adhère complètement à l’entretoise et que tout excès de support de montage est éliminé. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de support de montage sur le papier.

Nettoyez et étiquetez la lame et rangez-la dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie. Effectuez ensuite l’imagerie et l’analyse selon le protocole texte. Dans cette expérience, il est démontré que l’expression des protéines Delta-Like 1 et Notch1 oscille de manière désynchronisée en arrangeant temporairement les embryons en fonction de la transcription naissante du gène de segmentation régulée par Notch détectée dans la moitié de chaque paire d’explants.

Les panneaux sont disposés en fonction de la phase un, deux et trois du cycle d’horloge de segmentation. L’étendue des domaines d’expression de Delta-Like 1, Notch1 et de la frange lunatique intronique le long de l’axe antéropostérieur de la MSP est délimitée par des barres codées en couleur. Comme illustré ici, un graphique est généré pour quantifier l’intensité du signal Delta-Like 1, Notch1 et de la frange lunatique intronique par rapport à l’axe antéropostérieur du PSM et illustre la variation axiale et l’intensité du signal à travers le PSM tout au long du cycle d’horloge.

Les kymographes visualisent la distribution spatiale de Delta-Like 1, Notch1 et de la frange lunatique intronique à travers de nombreux PSM. Chaque rangée du kymographe représente l’intensité du signal d’un explant PSM individuel. La quantification de l’intensité du signal de Delta-Like 1, Notch1 et de la frange lunatique intronique par rapport à l’axe antéropostérieur du PSM révèle une dynamique d’expression oscillatoire claire pour ces cibles.

Enfin, ces kymographes montrent la distribution spatiale de la forme clivée et activée du récepteur Notch NICD, Delta-Like 1, frange lunatique intronique et Notch1 à travers de nombreux PSM. Cette technique a aidé les chercheurs dans le domaine de la mitogénèse des vertébrés à mieux comprendre la dynamique de l’oscillation des gènes de segmentation dans le mésoderme présomitique du poussin et de la souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur un grand nombre d’échantillons permettant d’analyser simultanément les profils d’expression de plusieurs ARNm et protéines d’intérêt.

À la suite de cette procédure, une quantification supplémentaire des données d’image peut permettre de comprendre les retards temporels dans l’expression des gènes ainsi que la localisation subcellulaire des signaux ARN et protéiques d’intérêt pour le chercheur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cartographier la dynamique spatio-temporelle de l’expression génique de l’horloge de segmentation des vertébrés à l’aide d’un échantillonnage de tissus épais. Cela peut être suivi d’une analyse d’image automatisée comme détaillé dans le protocole texte.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’assurer une distribution égale du PSM, de la notocorde et du tube neural entre les explants de PSM et d’optimiser soigneusement les dilutions d’anticorps avant de commencer. N’oubliez pas que travailler avec du formamide, du paraformaldéhyde et du glutaraldéhyde peut être extrêmement dangereux. Prenez soin de porter un équipement de protection individuelle et de travailler dans une hotte le cas échéant.