Commande temporelle des données d'expression dynamique d'expression spatiale détaillée Plans

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique du « horloge de segmentation » chez les vertébrés à l'aide d'échantillons de tissus fixés. Cette méthode permet une évaluation impartiale de la dynamique oscillatoire des gènes dans le mésoderme présomitique, ce qui est essentiel pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la somatogenèse chez les vertébrés. Le principal avantage de cette technique est que de nombreux échantillons peuvent être produits et traités simultanément, permettant une analyse tripartite approfondie de la dynamique de l'expression génique sur tissus fixés.

Le Dr Charlotte Bailey, ancienne postdoctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir obtenu un cornet utérin de souris selon le protocole décrit, utilisez des ciseaux courbes sous un microscope stéréo pour couper la membrane musculaire épaisse du cornet utérin et extraire soigneusement chaque embryon. À l’aide de ciseaux courbes et de pinces fines, disséquez la membrane amniotique de chaque embryon.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille chirurgicale ou de ciseaux courbes, prélevez le tissu caudal de chaque embryon en coupant l’embryon juste en avant des bourgeons des membres postérieurs. Placez le tissu caudal avec le côté ventral vers le bas. Ensuite, générez des paires d’explants de mésoderme présomptif de la queue (PSM) en divisant le tissu caudal en deux moitiés le long de la ligne médiane, à l’aide d’un mouvement doux de balancement avec l’aiguille.

Veillez à ce que le tube neural, la notocorde et le tissu du MRP soient également répartis entre les deux explants. Ensuite, aspirez chaque explant de MRP controlatéral à l’aide d’une pipette et déposez-le sur la face inférieure du couvercle d’une boîte de culture plastique de 35 mm, dans un petit volume de milieu de culture préchauffé. Placez la boîte sur le dessus du couvercle, puis retournez rapidement l’ensemble afin que le tissu du MRP soit suspendu au couvercle dans une goutte pendante de milieu.

Ensuite, cultiver les explants de MPR dans une enceinte humide à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Transférer des paires d'explants de MPR dans les puits individuels d'une plaque de culture tissulaire 24 puits. Puis ajouter du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS aux échantillons et incuber la plaque à température ambiante pendant une heure, ou à quatre degrés Celsius sur une plateforme agitée pendant la nuit.

Après l'incubation, utiliser du PBS pour laver les puits d'échantillons à température ambiante sur une plateforme agitée. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique fine, remplacer la solution de PBS sur les échantillons trois à quatre fois. Pour réaliser l’immunohistochimie, ajouter du PBS contenant 2 % de Triton X-100 à un explant de PSM provenant de chaque paire embryonnaire et incuber les échantillons à température ambiante sur une plateforme agitée pendant une heure afin de les laver.

Rincez brièvement les échantillons avec du PBS. Remplacez ensuite le PBS par la solution de blocage et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius sur une plateforme agitée pendant la nuit. Diluez les anticorps primaires souhaités dans du tampon de travail.

Dans cet exemple, des anticorps dirigés contre Delta-like 1 et Notch1 sont utilisés à une dilution de 1:25. Ajoutez les anticorps aux explants et incubez les échantillons sur une plateforme agitée à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Après l'incubation, utilisez du PBS pour laver les échantillons deux fois, cinq à dix minutes chacun.

Effectuez ensuite trois lavages avec du PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 à température ambiante sur une plateforme agitée. Après dilution des anticorps secondaires dans le tampon de travail, ajoutez entre 250 et 500 microlitres de la solution d'anticorps dans chaque puits d'échantillon, en prenant soin de ne pas utiliser les derniers microlitres de solution, qui pourraient contenir des agrégats d'anticorps. Recouvrez la plaque de papier d'aluminium et incubez les échantillons dans la solution d'anticorps secondaires à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant trois à cinq jours.

Après l'incubation, laver les échantillons deux fois avec du PBST, dix minutes chacun. Ensuite, laver le tissu une fois avec du PBS à température ambiante sur une plateforme agitée pendant cinq minutes. Conformément au protocole décrit, déshydrater et réhydrater les explants de PSM controlatéraux restants selon une série de dilutions d'éthanol dans du PBST.

Ajouter dix microgrammes par millilitre de protéinase K dans du PBST à 0,1 % aux explants, puis incuber le tissu sans agitation pendant cinq minutes. Ensuite, retirer rapidement la solution de protéinase K et rincer brièvement les échantillons avec du PBST. Ajouter 4 % de formaldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBST aux explants de PSM afin de les postfixer, puis incuber les échantillons pendant 30 minutes.

Ensuite, après avoir lavé les échantillons deux fois avec du PBST pendant dix minutes chacun, ajouter le mélange d'hybridation à 50 % au tissu et incuber à 65 degrés Celsius sans agitation pendant dix minutes. Après avoir incubé les échantillons et le mélange d'hybridation conformément au protocole indiqué, retirer la solution et ajouter de 0,25 à 0,5 millilitre de mélange d'hybridation préchauffé contenant une sonde d'ARN antisense marquée à la digoxigénine dirigée contre un composant connu de l'horloge de segmentation. Utiliser du ruban adhésif pour sceller la plaque et incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant deux nuits.

Après l'incubation, utiliser le mélange d'hybridation à 50 % préchauffé dans du TBST pour laver les échantillons pendant 15 minutes. Ensuite, rincer les échantillons deux fois avec du TBST avant d'incuber le tissu dans du TBST à température ambiante sur une plateforme agitée pendant 30 minutes. Puis, pré-incuber les explants dans la solution de blocage pendant au moins deux heures.

Ensuite, remplacez la solution par une solution de blocage fraîche, contenant une dilution à 1:200 d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la HRB. Incubez les échantillons à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, rincez les échantillons trois fois avec du TBST à température ambiante et transférez-les dans des puits individuels d'une nouvelle plaque de culture tissulaire de 24 puits.

Ensuite, laver les explants trois fois avec du TBST, pendant une heure chacun. Utiliser un kit d'amplification du signal par tyramide pour visualiser l'ARNm détecté avant de préparer les échantillons pour l'imagerie. Préparer une lame en verre adhésive chargée pour chaque paire d'explants en retirant le film adhésif d'un espaceur d'imagerie d'une épaisseur de 0,12 mm et en le collant sur une lame en verre.

Après avoir positionné une paire d'explants sur la lame selon le protocole décrit, laissez les échantillons adhérer à la lame pendant 45 à 60 secondes, jusqu'à ce que le tissu commence à paraître collant et translucide sans s'assécher complètement. Pendant ce temps, utilisez une pince pour retirer le film adhésif restant du séparateur et ajoutez une grande goutte de milieu de montage à double fonction et de solution de clarification au centre des échantillons situés dans le séparateur. Placez une lamelle circulaire sur les échantillons en veillant à ce que le milieu de montage soit uniformément réparti et que tous les bords entrent en contact avec le séparateur.

Ensuite, placer la lame recouverte de lamelle à l’envers sur du papier peu pelucheux. Appuyer fermement pour s’assurer que la lamelle adhère complètement à l’espaceur et que tout excès de milieu de montage est éliminé. Répéter ce processus jusqu’à ce qu’aucun milieu de montage ne tache plus le papier.

Nettoyez et étiquetez la lame, puis stockez-la à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie. Ensuite, réalisez l’imagerie et l’analyse conformément au protocole écrit. Dans cette expérience, l’expression des protéines Delta-Like 1 et Notch1 est montrée comme oscillant de manière asynchrone, en organisant temporairement les embryons selon la transcription naissante du gène de la pendule de segmentation régulé par Notch, lunatic fringe intronique, détectée dans une moitié de chaque paire d’explant.

Les panneaux sont organisés selon les phases une, deux et trois du cycle de l'horloge de segmentation. L'étendue des domaines d'expression de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique le long de l'axe antéropostérieur du mésoderme présomptif (PSM) est délimitée par des barres codées par couleur. Comme indiqué ici, un graphique est généré afin de quantifier l'intensité du signal de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique par rapport à l'axe antéropostérieur du PSM, illustrant ainsi la variation axiale et l'intensité du signal à travers le PSM durant tout le cycle de l'horloge.

Les kymographies visualisent la répartition spatiale de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique au sein de nombreux PSM. Chaque ligne de la kymographie représente l'intensité du signal d'un explant individuel de PSM. La quantification de l'intensité du signal de Delta-Like 1, de Notch1 et de lunatic fringe intronique par rapport à l'axe antéropostérieur du PSM révèle des dynamiques d'expression clairement oscillatoires pour ces cibles.

Enfin, ces kymogrammes montrent la distribution spatiale de la forme clivée et activée du récepteur Notch (NICD), de Delta-Like 1, de lunatic fringe intronique et de Notch1 à travers de nombreux mésoderme présomitique (PSM). Cette technique a aidé les chercheurs dans le domaine de la mitogenèse des vertébrés à mieux comprendre la dynamique des oscillations des gènes de segmentation dans le mésoderme présomitique de poulet et de souris. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée à un grand nombre d'échantillons, permettant d'analyser simultanément les profils d'expression de plusieurs ARNm et protéines d'intérêt.

Après cette procédure, une quantification supplémentaire des données d'image peut permettre de comprendre les retards temporels dans l'expression génique ainsi que la localisation subcellulaire des signaux d'ARN et de protéine d'intérêt pour le chercheur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cartographier la dynamique spatio-temporelle de l'expression génique du « horloge de segmentation » chez les vertébrés à l'aide d'échantillons tissulaires épais. Cette étape peut être suivie par une analyse automatisée des images, comme décrit dans le protocole écrit.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer d'une répartition équitable du mésoderme présomptif (PSM), de la notocorde et du tube neural entre les explants de PSM, et de bien optimiser les dilutions des anticorps avant de commencer. N'oubliez pas que l'utilisation de formamide, de paraformaldéhyde et de glutaraldéhyde peut être extrêmement dangereuse. Veillez à porter des équipements de protection individuelle et à travailler sous hotte aspirante lorsque cela est nécessaire.