Quantification temporelle d'expression MAPK induite en simples cellules de levure

L’objectif global de l’expérience suivante est de quantifier l’expression de la protéine activée par les mitogènes au niveau de la cellule unique. Pour ce faire, une souche de levure portant l’expression fluorescente reporter quadruple Vénus contrôlée par le promoteur STL one et spécifique à l’activation de la hog one map kinase a été générée. L’expression des protéines fluorescentes peut être quantifiée soit par un test de microscopie à cellules vivantes dans lequel les cellules sont stressées directement sur le microscope pour faciliter l’apparition en temps réel de la fluorescence, soit par cytométrie en flux, dans ce cas les cellules sont stressées dans un microtube et la synthèse des protéines est bloquée à un moment donné.

Grâce à l’ajout de cyclo-heide, seules quelques cellules à la fois peuvent être analysées avec la microscopie à cellules vivantes, mais le destin des cellules individuelles peut être directement observé et corrélé avec d’autres propriétés cellulaires de la cytométrie en flux, d’autre part, permet également d’évaluer l’expression de la protéine activée par le mitogène sur un grand nombre de cellules à la fois. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation, telles que les protéines impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la voie de la levure, elle peut également être appliquée à d’autres cascades de signalisation en fonction de la disponibilité de l’expression appropriée. Reporter.

Pour préparer les cellules à la microscopie à cellules vivantes, commencez par inoculer cinq millilitres de milieu synthétique avec de la levure, puis cultivez les cellules à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la DO 600 de la culture de nuit, puis diluez la culture de nuit dans cinq millilitres de milieu synthétique jusqu’à une DO 600 de 0,05. Cultivez la culture diluée à 30 degrés Celsius pendant au moins quatre heures de plus.

Ensuite, filtrez environ 200 microlitres de solution de contenant a fraîchement préparée dans la lame de puits. Après 30 minutes, retirez la solution de contrôle et ajoutez 150 microlitres d’eau dans le puits. Retirez maintenant l’eau et laissez sécher le puits pendant que les cellules sont préparées.

Mesurez à nouveau la DO 600 de la culture cellulaire, puis diluez les cellules pour obtenir 300 microlitres de culture cellulaire à une DO 600 de 0,02 et un microtube de 1,5 millilitre. Soniquez les cellules dans un bain-marie pendant 45 secondes. Vortex brièvement les microtubes, puis sonicate et vortex à nouveau les cellules.

Ajoutez maintenant 200 microlitres de cellules dans la lame du puits, puis après avoir laissé la cellule se déposer au fond du puits pendant environ 30 minutes, placez la lame sur le microscope. Ensuite, sélectionnez les paramètres d’éclairage de leur canal fluorescent à enregistrer et de deux images en fond clair, en ajustant l’un des paramètres de fond clair à environ trois microns sous le plan focal pour permettre une segmentation correcte des cellules. Réglez ensuite les intervalles de temps pour les mesures en accéléré et sélectionnez les champs de vision pour l’imagerie.

Maintenant, commencez l’acquisition pour quelques images, puis interrompez l’acquisition pour ajouter 100 microlitres de milieu de chlorure de sodium 0,6 molaire fraîchement préparé, et reprenez l’imagerie pour préparer les cellules à la mesure par cytométrie en flux. Commencez par inoculer la levure dans cinq millilitres de milieu synthétique et faites pousser les cellules pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, mesurez la DO 600 de la culture de nuit, puis diluez la suspension cellulaire dans cinq millilitres de milieu synthétique jusqu’à une DO 600 de 0,1.

Cultivez la culture pendant au moins quatre heures à 30 degrés Celsius pour atteindre une OD 600 de 0,2 à 0,4. Ajoutez ensuite 100 microlitres de chlorure de sodium de 0,6 molaire fraîchement préparé dans un microtube de 1,5 millilitre pour chaque point temporel à mesurer au temps zéro. Ajoutez 200 microlitres de cellules dans chaque micro-tube et incubez les cultures en les secouant à 30 degrés Celsius.

Ensuite, à chacun des points de temps expérimentaux, ajoutez 30 microlitres de cyclo heide fraîchement préparé dans l’un des micro-tubes. Pendant que les microtubes sont en incubation, ajoutez 400 microlitres de PBS dans un tube de fax correspondant pour chaque microtube. Après l’incubation, faites brièvement tourbillonner les microtubes, puis sonifiez les cellules et ajoutez-y un bain-marie pendant une minute comme nous venons de le démontrer.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de culture cellulaire de chaque microtube dans son tube de fax correspondant au débit du cytomètre. Chargez les paramètres d’excitation et de détection appropriés et testez les échantillons non exprimants et entièrement exprimés pour vérifier qu’ils se situent dans la plage de sensibilité du détecteur. Enfin, mesurez 10 000 cellules pour chaque échantillon Dans ces images, des cellules de levure portant l’expression rapporteur de la protéine veineuse quadruple sous le contrôle du promoteur TL one et fixées au fond d’une lame de puits ont été stimulées par édition directe d’un milieu de stress.

Comme nous venons de le démontrer, les cellules ont été surveillées pendant environ deux heures à des intervalles de 10 minutes, et des images ont été acquises avant et après l’édition du stimulus. Notez l’expression fluorescente du rapport pendant les cellules activées. Pour extraire les informations quantitatives contenues dans ces images, un processus complexe d’analyse d’images doit être effectué ici.

Les résultats obtenus avec la plateforme d’analyse quantitative de levure sont présentés. Chaque trace rouge représente l’évolution temporelle de l’intensité moyenne de fluorescence d’une seule cellule. La ligne bleue illustre la médiane de plus de 500 cellules qui ont été segmentées et suivies tout au long de 20 images de cinq films en accéléré acquis à partir de cinq champs de vision différents à partir du même puits la zone bleu clair représente le 25e et le 75e centile de toutes les intensités mesurées à un point de temps donné pour étudier la dynamique de l’expression du même rapporteur par cytométrie en flux Du cycloheximide a été ajouté à la levure Cultures cellulaires à différents moments à des intervalles de cinq à 10 minutes.

Le médicament bloque la synthèse de nouvelles protéines, mais la maturation de la protéine fluorescente déjà exprimée n’est pas perturbée. Par conséquent, l’expression protéique visualisée par le déplacement de l’histogramme vers la droite peut être quantifiée au moment de l’édition du cycle H, contournant ainsi les problèmes associés à la maturation des protéines fluorescentes. Dans ce graphique, la dynamique de l’expression rapporteure telle que mesurée par microscopie ou cytométrie en flux est comparée tandis que le signal fluorescent augmente 30 à 40 minutes après l’édition du milieu de stress tel que mesuré par la microscopie, les mesures de cytométrie en flux indiquent clairement que les protéines sont déjà produites entre 10 à 15 minutes après le stimulus démontrant la lente maturation des protéines fluorescentes.

Les deux techniques permettent d’accéder à des informations sur une cellule unique pour ces expériences simples, la variabilité entre trois réplicats biologiques est faible par rapport à la grande variabilité observée dans les réponses unicellulaires par microscopie ou cytométrie en flux. Après ces procédures, d’autres méthodes telles que ces mesures de réponse peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le seuil d’expression génique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’expression des protéines au niveau d’une seule cellule avec un microscope de cytométrie en flux.